外側中隔ニューロンから結節核への回路が快楽摂食を制御する

Molecular Psychiatry volume 27、pages 4843–4860 (2022)この記事を引用

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摂食行動は、体の恒常性の欲求と食物の快楽的価値の両方によって調節されます。おいしくてエネルギーが豊富な食品が簡単に手に入ることと、その結果としての肥満の蔓延により、快楽的な摂食を調節する神経回路をより深く理解する緊急の必要性が強調されています。今回我々は、外側中隔（LSNt）のニューロンテンシン陽性ニューロンが快楽摂食の調節に重要な役割を果たしていることを報告する。 LSNt をサイレンシングすると、特においしい食物の摂食が促進されますが、LSNt の活性化は全体的な摂食を抑制します。 LSNts ニューロンは GABA シグナル伝達を介して結節核 (TU) に投射し、快楽摂食を制御しますが、LSNts→乳頭上核 (SUM) からのニューロテンシンシグナルは摂食全体を抑制するのに十分です。 in vivo カルシウムイメージングと光遺伝学的操作により、摂食中に活性化および抑制される LSNts ニューロンの 2 つの集団が明らかになり、それぞれ食物の探索と消費に寄与します。 LSNts または LSNts→TU の慢性活性化は、高脂肪食誘発性肥満を軽減するのに十分です。私たちの発見は、LSNts→TUが快楽摂食の調節における重要な経路であることを示唆しています。

肥満および関連する代謝性疾患の発生率は過去数十年にわたって急速に増加しており、世界中で大きな健康上の懸念となっています[1]。肥満パンデミックの根底にある主な要因は、現代社会において非常に嗜好性が高くカロリーの高い食品が圧倒的に入手可能であることによって引き起こされる過食です。摂食はエネルギー要求によって引き起こされる可能性があり、これは代謝恒常性を維持するために進化的に保存されたメカニズムです。この恒常的な摂食は、脳ネットワークの活動と循環ホルモンによって厳密に制御されています[2、3、4]。一方、快楽摂食は、代謝を必要とせずにおいしい食べ物を消費する喜びによって動かされており、これが過食と肥満に寄与する主な要因です[5]。

恒常性摂食を媒介する神経回路は広く研究されているが、快楽摂食を調節する神経基質についてはほとんど知られていない[6、7、8]。恒常性摂食と快楽摂食は、別個の異なる神経回路によって処理される可能性があります [6]。弓状核 (ARC) や視床下部外側領域 (LHA) を含む視床下部核は、空腹シグナルを食物の探索と消費に変換する恒常性摂食を媒介することでよく知られています [9]。一般に、快楽摂食は、腹側被蓋野 (VTA) とその標的である側坐核 (NAc) を含む中脳辺縁系ドーパミン作動性報酬系によって媒介されると推定されています [2、10、11]。しかし、遺伝子操作されたドーパミン欠乏マウスは摂食を停止し、生後数週間以内に死亡する[12]ことから、VTAドーパミンシステムは摂食の恒常性など動物の生存に重要な行動の調節にも重要な役割を果たしていることが示唆されている。さらに、ARC のアグーチ関連ペプチド (AGRP) 発現ニューロンは、恒常性摂食の制御においてよく特徴付けられています [13]。 AGRP ニューロンを切除すると、通常の固形飼料の摂取はなくなりますが、グレリンによって誘発されるおいしい食物の摂取には影響しませんでした [14]。最近の研究によると、NAc への前室傍視床 (aPVT) 入力を活性化すると、高脂肪食の快楽摂食が促進されますが、一晩の固形飼料の摂取には影響がありません [15]。これらの研究は、異なる神経回路が恒常性摂食と快楽摂食に異なって寄与している可能性があることを示唆しました。

外側中隔 (LS) は海馬からの入力を受け取り、視床下部に大規模な投影を送ります。したがって、食物の美味しさなどのコンテキスト情報を統合して摂食行動をガイドするのに特に適しています。以前の研究では、一般的な摂食とストレス誘発性の不安の両方の調節におけるLSの潜在的な役割が示唆されています[4、16]。しかし、LS 細胞の種類と回路が快楽摂食にどのように寄与するかについてはほとんど知られていません。

私たちは、エネルギー不足なしでおいしい食べ物を摂取している間の脳の活性化を調べることによって、快楽摂食の調節におけるLSの関与を調べ、その後、通常の食事とおいしい食べ物の摂取中のLSの活性化を比較しました。このアプローチを使用して、快楽摂食中に特異的に活性化される外側中隔（LSNt）のニューロテンシン発現GABA作動性ニューロンのサブセットを同定しました。破傷風神経毒を介したシナプス不活性化または光遺伝学的なアプローチで LSNt をサイレンシングすると、特においしい食物の摂食が促進されます。しかし、LSNts の活性化は全体的な摂食を抑制します。古典的な神経伝達物質 GABA と神経ペプチドニューロテンシンは両方とも、摂食における LSNts ニューロンの調節効果に寄与します。 LSNtはGABAを介して結節核（TU）に投射して快楽摂食を調節するが、LSNtから乳頭上核（SUM）へのニューロテンシンシグナルは摂食全体を抑制するのに十分である。正確な分子、細胞型、および回路の同定は、肥満および関連する代謝性疾患の治療のための快楽摂食をターゲットとした新規治療法の開発に役立つ可能性があります。

この研究におけるすべての飼育および実験手順は、中国科学院 (CAS) の深セン先端技術研究所 (SIAT) の動物管理使用委員会によって承認されました。成人（生後 3 ～ 5 か月）雄 C57BL/6 J（広東省医学実験動物センター、広州、中国）、Nts-ires-Cre（Jax 番号 017525）、Rosa26-LSL-Cas9（Jax 番号 024857）この研究ではマウスを使用しました。マウスは、12時間の明期と12時間の暗期の概日周期で22〜25℃で飼育されました。

AAV2/9-hSyn-mCherry-P2A-TetTox-WPRE-pA、AAV2/9-hEF1a-DIO--hM3D(Gq)-mCherry-WPRE-pA、AAV2/9-hSyn-DIO-hChR2(H134R)を購入しました。 -mCherry-WPRE-pA、AAV2/9-hEF1a-DIO-eNpHR3.0-EYFP、AAV2/9-hSyn-FLEX-GCamP6s-WPRE-pA、AAV2/2Retro-hSyn-DIO-GCaMP6s-WPRE-pA、AAV2 /9-hEF1a-DIO-EYFP-WPRE-pA、AAV2/9-hEF1a-DIO-mCherry-WPRE-pA、AAV2/9-hSyn-FLEX-tdTomato-T2A--シナプトフィジン-EGFP-WPRE-pA、scAAV2/ 2 Tailtool の Retro-hsyn-FLEX-Flpo-pA、AAV2/9-hEF1a--fDIO-hM3D(Gq)-mCherry-WPRE-pA。 AAV-U6-sgRNA(LacZ)-pCbh-DIO--hM3D(Gq)-mCherry、AAV-U6-sgRNA(vGAT)-pCbh-DIO-hM3D(Gq)-mCherry および AAV--U6-sgRNA(Nts) -CAG-DIO-hM3D(Gq)-mCherry は、カリフォルニア大学バークレー校の Y. Dan が提供したコンストラクトを使用して BrainCase によって作成されました。クロザピン N-オキシド (BML-NS105-0025) は Enzo から購入しました。 CTB-488 (C34775)、CTB-555 (C34776)、および CTB-647 (C34778) は Thermo Fisher から購入しました。 c-fos 抗体 (2250) は Cell Signaling Technology から購入しました。 GFP (ab13970) および mCherry (ab167453、ab205402) 抗体は、Abcam から購入しました。 RNA プローブおよび RNAScope in situ ハイブリダイゼーション試薬キットは ACDbio から購入しました。

ペントバルビタール(80 mg/kg)の腹腔内注射によりマウスを麻酔した。標準的な手術を行って、LS、POA、AHN、TU、またはSUMの上の脳表面を露出させました。 LS 注射に使用した座標は、ブレグマ +0.75 mm、側方 ±0.35 mm、および硬膜 -2.85 mm でした。 POA 注射に使用した座標は、ブレグマ +0.62 mm、側方 ±0.25 mm、および硬膜 -4.25 mm でした。 AHN注射に使用した座標は、ブレグマ -0.80 mm、側方 ±0.40 mm、および硬膜 -5.0 mmでした。 TU 注射に使用した座標は、ブレグマ -1.94 mm、外側 ±1.20 mm、および硬膜 -5.10 mm でした。 SUM 注射に使用した座標は、ブレグマ -3.0 mm、横方向 ±0.25 mm、および硬膜 -4.4 mm でした。ＡＡＶベクターおよびＣＴＢ−４８８／５９４／６３３は、局所脳組織の潜在的な損傷を避けるために、ナノリッターインジェクター（ＤｒｕｍｍｏｎｄＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃＣｏｍｐａｎｙ）に接続されたガラスピペットを用いて、６０ｎｌ／分の遅い流速で定位注射された。ウイルス注射後少なくとも 10 分後にピペットを引き抜きました。

シナプス不活性化および化学遺伝学的活性化実験の場合、すべての注射 (AAV-DIO-EGFP-2A-TeNT、AAV-DIO-EYFP、AAV-DIO-hM3D-mCherry、AAV-DIO-mCherry、AAV-Retro-Flex-FlpO、AAV) -fDIO-hM3D-mCherry、AAV-sgRNA(LacZ/vGAT/Nts)-DIO-hM3D-mCherry)は両側性でした。ウイルス注射後 3 週間目に行動試験を実施しました。経路追跡実験では、AAV (AAV-DIO-tdTomato-T2A-Synaptophysin-EGFP) および CTB 注射を同じ側に片側で行いました。組織学的分析は、注射後 1 週間 (CTB の場合) または 3 週間 (AAV の場合) に実施されました。光遺伝学的操作、ファイバー測光およびカルシウムイメージング実験のために、AAV 注射 (AAV-DIO-ChR2-mCherry、AAV-DIO-mCherry、AAV-DIO-eNpHR-EYFP、AAV-DIO-EYFP、AAV-DIO-GCaMP6m) を使用しました。以下に説明するように、片側に光ファイバーまたは小型顕微鏡を埋め込みます。

AAV 注射の 30 分後、光ファイバー (直径 200 μm、NA 0.37) を備えたセラミックフェルールを、ファイバー先端が LS の上にある状態で移植しました (ブレグマ +0.75 mm、側方 +0.35 mm、硬膜 -2.70 mm)。、TU（ブレグマ -1.94 mm、外側 +1.20 mm、および硬さ -4.80 mm）または SUM（ブレグマ -3.0 mm、外側 ±0.25 mm、および硬さ -4.1 mm）。次に、フェルールを光硬化性樹脂で頭蓋骨に固定しました。移植後、皮膚が縫合され、手術創に抗生物質が塗布されました。光遺伝学およびファイバー測光実験は、光ファイバー移植後少なくとも 3 週間後に実施されました。

小型顕微鏡手術手順は以前に記載されているとおりでした（Resendez et al.、2016）。 AAV-DIO-GCaMP6 AAV 注射の 3 週間後、GRIN レンズ (Go!Foton、カタログ番号 CLHS050GFT009) を、レンズ先端が LS の上にある状態で移植しました (ブレグマ +0.75 mm、側方 +0.35 mm、硬膜 -2.70 mm)。。次に、レンズを光硬化性樹脂で頭蓋骨に固定しました。 GRIN レンズの移植から 3 週間後にベースプレートを取り付けました。行動実験は、ベースプレートの取り付けから回復してから少なくとも 1 週間後に開始しました。

ウイルス注射またはファイバー移植後、行動試験まで少なくとも 3 週間、マウスをグループ (ケージあたり 3 ～ 5 匹) で飼育しました。行動試験前の少なくとも 3 日間、実験者はそれらを毎日扱いました。すべての行動は、動物の治療について知らされていない実験者によって採点されました。すべての行動実験は実験室で少なくとも 3 回繰り返されました。

固形食物摂取アッセイの少なくとも３日前に、マウスを個別に飼育した。摂食行動実験中は、さまざまな種類の餌（標準飼料、高スクロース餌、または高脂肪餌、約 20 g）を毎日交換し、餌の破片が底に溜まらないようにケージを毎日交換しました。食物摂取量は、暗期初期（午後 8:00 ～ 10:00）にホームケージ内でケージから餌を短時間取り出し、重量を測定することによって手動で計算されました。そして、負荷シートに基づいて摂取カロリーを計算しました。食餌の変更によって引き起こされるストレスの潜在的な影響を回避するために、マウスを少なくとも 3 日間新しい食餌に慣れさせました。

c-fos マッピング実験では、エネルギー欠損の有無にかかわらず、給餌実験を実行しました。対照給餌群として、マウスには標準的な実験用飼料を自由に給餌した。快楽摂食群では、マウスは標準食を無制限に摂取できる一方、高スクロース食は毎日 2 時間、7 日間連続して与えられました。この 2 時間の間の食物摂取を監視しました。急性エネルギー不足による摂食の場合、食物を 22 時間除去し (絶食グループ)、その後標準食 (絶食 + 食事グループ) または高スクロース食 (絶食 + HSF グループ) を与えました。実験は実験室で3回繰り返されました。

TeNT 誘発シナプス不活性化および CRISPR/Cas9 媒介ノックダウン実験では、上記のように、満腹状態または絶食状態でさまざまな種類の食物の摂取量を連続的に測定しました。

化学遺伝学的活性化実験では、生理食塩水（0.9%; 200 μl）またはCNO（カタログ番号BML-NS105-0025、Enzo、生理食塩水中2 mg/kg体重）の腹腔内注射の30分後に食物摂取量を測定しました。さまざまな種類の食品の摂取量を、満腹状態または絶食状態で連続的に測定しました。

遊離液体食物摂取アッセイでは、実験前にマウスを個別にケージに入れ、自由に食物と水を与えた。実験中、マウスをオペラント条件付けチャンバー (22 cm × 16 cm × 15 cm、AniLab) に入れました。液体 (水、10% スクロース溶液、エンシュア、またはデンプン溶液) を 10 秒ごとに 1 滴 (10 μl) 滴下し、このシーケンスを 180 回繰り返しました。液体は、液体の入った注射器を保持するポンプによって押し出されました。なめる回数は、静電容量式タッチセンサー (Sparkfun MPR121) とマイクロコントローラー (Arduino) を備えたカスタムメイドのリックメーターによって監視されました。 1 日目から 3 日目まで、マウスに注ぎ口をなめるように訓練しました。 TeNT 誘発シナプス不活化実験では、3 日間の訓練後、4 日目に異なる液体の消費量を測定しました。化学遺伝学的活性化実験では、4 日目にマウスをランダムに 2 つのグループに分け、生理食塩水または CNO (2 mg) で治療しました。 /kg 体重、生理食塩水、IP) 試験の 30 分前。翌日（５日目）、マウスをＣＮＯまたは逆に生理食塩水で処理し、再度試験した。光遺伝学的阻害実験では、593 nm ダイオード励起固体レーザーシステムを使用して、光刺激用の 593 nm 青色レーザーを生成しました。 FC/PC アダプターを使用して、頭蓋内光送達のためにレーザーの出力を埋め込まれたフェルールに接続しました。 4日目に、マウスを行動チャンバーに入れ、光を消した状態で流動食の摂取量を測定した。５日目に、マウスを食物摂取アッセイのために同じチャンバーに入れ、摂食セッション全体を通じて黄色光刺激（５９３ｎｍ）を継続的に送達した。

合図条件付き液体給餌（エンシュア、通常の流動食、水）では、試験開始後 20 ～ 24 秒ごとに 1 秒の聴覚合図（20 kHz）が提示されました。合図提示の直後に、液体の入ったシリンジを保持するポンプによって流動食の 1 滴 (10 μl) が押し出されました。なめる回数は、静電容量式タッチセンサー (Sparkfun MPR121) とマイクロコントローラー (Arduino) を備えたカスタムメイドのリックメーターによって監視されました。

流動食を自分のペースで自由に給餌するために、マウスは各自分のペースでの給餌セッションで 30 分間、リックメーターの注ぎ口を介して Ensure に自由にアクセスできました。なめが検出されると、Ensure が 1 滴 (10 μl) 送達されました。各マイペース消費セッションには、通常、複数の消費試合が含まれていました。各試合は、6 秒未満のインターリック間隔での連続的な舐めとして定義されました。ニューロンのダイナミクスは、さらなる分析のために各試合の最初のリックに合わせて調整されました。

図5D〜Fのさまざまな摂食段階の実験中の光遺伝学的操作では、接近または消費段階中に青色光（473 nm）が20 Hz（20 msのパルス幅）で送達され、一方で黄色光（593 nm）が照射されました。接近フェーズまたは消費フェーズ中に常に。

行動試験の当日、マウスを試験室に移し、実験開始前に 3 時間部屋の条件に慣れさせました。他のマウスからの臭気を除去するために、装置を 20% エタノールで洗浄しました。マウスをプラスチックのオープンフィールドチャンバー（40×40cm）に入れました。マウスの位置は、カスタム MATLAB 追跡ソフトウェアを使用して 30 Hz のサンプリング周波数で監視されました。チャンバーは概念的に分析のために中央フィールド (25 × 25 cm) と周辺フィールドに分割されました。総移動量と中心部で費やした時間の割合を分析した。

急性化学遺伝学的活性化実験では、マウスをランダムに 2 つのグループに分け、試験の 30 分前に生理食塩水または CNO (生理食塩水中 2 mg/kg 体重、IP) で処理しました。マウスには 10 分間自由に探索させた。翌日、マウスを逆にCNOまたは生理食塩水で処理し、再度検査した。慢性的な化学遺伝学的活性化実験の場合、マウスは試験前に CNO で処理されませんでした。

光遺伝学的阻害実験では、マウスをチャンバーに入れ、黄色光刺激 (593 nm、5 分間オンと 5 分間オフを交互に繰り返す連続光) を 20 分間照射しました。

ウイルス注射後、マウスをグループ（ケージあたり 3 ～ 5 匹）に分けて飼育し、標準的な餌を与えました。３週間後、体重を毎日測定した。 TeNT 誘発シナプス不活性化実験では、マウスに標準食を与えるか、高脂肪食に変更しました。化学遺伝学的活性化実験では、さまざまなグループに標準的な食事を与えるか、高脂肪食に変更しました。 CNO (生理食塩水中 1 mg/kg、IP) を 1 日 2 回注射しました。

エネルギー消費量は、一定の環境温度 (22 ～ 25 °C) および 12 時間の明期、12 時間の暗期サイクル下に設置された間接熱量測定システム (Oxymax、Columbus Instruments) を使用して測定されました。各部屋のマウスには餌と水を自由に摂取させた。

血糖値を測定するために、マウスの尾の端をかみそりの刃で水平に切り、少量の血液を採取した。次いで、血糖値を血糖計(Bayer)を使用して測定した。化学遺伝学的活性化実験では、まず、光周期の暗期の開始時に基礎血糖値を測定しました。 CNO (生理食塩水中 2 mg/kg 体重、IP) の注射後、30 分後に血糖値を測定しました。血糖測定期間中は食事は与えなかった。 TeNT 誘発シナプス不活性化実験では、一晩の絶食 (16 時間) 後に空腹時血糖を測定しました。次いで、これらの絶食マウスに、経口投与量(1.5 g/kg)の30% D-グルコース溶液(カタログ番号G6125、Sigma-Aldrich)を強制経口投与した。ベースライン時と、グルコース投与の10、30、60、90および120分後に血液を採取した。

血圧および心拍数の測定には、BP-2000 Blood Pressure Analysis System™ (Visitech システム) を使用し、ユーザーズガイドに従いました。 BP-2000 は透過型光電脈波計を使用しており、尾部を透過する光の量の変化を分析して血圧と脈拍数を測定します。正式な実験を開始する前に、動物をまず 3 日間血圧測定に慣れさせました。測定は毎日午後 2 ～ 4 時に実行されました。測定を行う1〜2時間前に、マウスを静かな測定室に移した。マウスをできるだけ落ち着かせるために、マウスを優しく扱った。動物をホルダー内に置き、カフを尾の周りに置き、尾をセンサーの V 字型の溝の底に置きます。動物を十分に温めて尾に良好な血流を生じさせ、標本ホルダー内に慣れることができるようにするために、各セッションで実際の測定を開始する前に、少なくとも 5 回の予備測定を実行しました。各セッションで 10 ～ 20 回の実測が実行されました。

化学遺伝学的活性化実験では、3 日間の慣れ後に基礎血圧と心拍数を測定しました。翌日の同じ時間に、ＣＮＯ（生理食塩水中２ｍｇ／ｋｇ体重、ＩＰ）の注射後、血圧および心拍数を再度測定した。

直腸温度を測定するために、温度計 (TH-5 Thermalert、Physitemp) を使用しました。まず、体温計のプローブの先にワセリンを付けます。直腸温度を取得する間、マウスの尾の付け根を 2 本の指で固定し、動物が前足でケージの蓋の金属棒をつかみながらゆっくりと持ち上げ、こうして肛門生殖器領域を露出させました。排泄物と尿は、排尿や排便による交絡効果を最小限に抑えるために洗浄されました。次に、ワセリンを付けたプローブを肛門管に 1.5 センチメートル挿入し、安定した時点で温度を読み取りました。直腸温は、正式なデータが収集される前に、少なくとも連続 3 日間測定されました。化学遺伝学的実験では、CNO (Enzo、カタログ番号 BML-NS105-0025、生理食塩水中 2 mg/kg 体重、IP) の注射後 30 分で直腸温を測定しました。

ファイバー測光実験は、AAV-GCaMP6s 注射の少なくとも 3 週間後に実施されました。埋め込まれたファイバーは、光ファイバーパッチコード (200 μm、0.37 NA、Inper、杭州、中国) を介して光ファイバーメーター (ThinkerTech、中国、南京) に接続されました。蛍光シグナルを記録するために、480 LED からのビームをダイクロイックミラーで反射し、CMOS 検出器 (Thorlabs, Inc. DCC3240M) に接続されたレンズで焦点を合わせました。パッチコードの先端の LED 電力は 50 μW 未満でした。

LSNts ニューロンのカルシウム活性は、GCaMP6 に感染したマウスの合図条件付きまたは自己ペース給餌中に記録されました。なめる信号は、自家製のなめなめ計によって収集され、光ファイバーメーターによって取得されました。信号の解析は、カスタム作成された MATLAB コードを使用して実行されました。蛍光変化（ΔF/F）は、（F-F0）/F0として計算されました。ここで、F0はベースライン蛍光シグナル（最初のリックまたはキュー開始の-6〜-4秒前）です。曲線下面積 (AUC) はイベントの平均 ΔF/F として計算され、食物接近段階では -6 ～ 0 秒、食物消費段階では 0 ～ 8 秒でした。

LSNts→TUまたはLSNts→SUMからのCa2+を記録するために、AAV-Retro-DIO-GCaMP6をTUまたはSUMに注射し、Nts-ires-CreマウスのLSに光ファイバーを移植した。ベースラインドリフトの影響を排除するために、Xiao et al. が説明したように、生の蛍光トレースを補正しました。 (Xiao et al., 2020)。ベースラインドリフト補正後、最初のリック開始前の -6 ～ -4 秒の時間枠内で、シグナルの平均および標準偏差に対して蛍光シグナルの Z スコアを付けました。

ベースプレートと付属の小型顕微鏡 (UCLA ミニスコープ V4、Open Ephys) を装着したマウスを、イメージングセッションの前に少なくとも 3 日間イメージング行動チャンバー (35 cm × 30 cm) に慣れさせました。イメージングデータは 30 Hz のフレームレート、LED 出力 15% ～ 35% で取得されました。カルシウムのイメージングデータは、UCLA Miniscope-DAQ-DT-Software によって収集されました。小型顕微鏡と行動関連イベント (リックイベントやポンプイベント) の間の同期は、カスタム Arduino ボードによって実現されました。

カルシウムイメージング時系列の分析は、Python と MATLAB で実行されました。画像データは空間的にダウンサンプリング (xy で 2 倍) され、時間的にダウンサンプリング (4 倍) されました。微小内視鏡検査用の制約付き非ネガティブ行列因数分解 (CNMF-E) を使用して、処理されたデータから個々のニューロンに関連する GCaMP 蛍光応答を抽出しました (Zhou et al., 2018)。簡単に言うと、CNMF-E によって個々のニューロンの応答を推定し、通常は非現実的に小さい (1 ～ 5 ピクセル) または大きい (100 ピクセル以上) 細胞体サイズを持つ明らかな非神経オブジェクトを手動で削除しました。

従来のカルシウムイメージングでは、蛍光シグナルはΔF/Fとして比較されます。 CNME-F の検査済みの生の出力を、その後の分析の ΔF として使用しました。セッション内のニューロン全体の平均蛍光応答を報告するために、正規化 ΔF を (ΔF − ΔFbaseline)/(ΔFmax − ΔFmin) として計算しました。 ΔFbaseline は、試験の -6 ～ -4 秒の平均応答でした。

Ca2+ 応答の半値幅と発作持続時間は、MATLAB の線形曲線フィッティングから最初に推定されました。応答半値幅と発作持続時間の間の相関係数は、MATLAB 関数 'corrcoef' を使用して計算されました。

セッション内のさまざまな食品に対する反応を比較するために、各ニューロンの ΔF を複数の試験にわたって平均しました。次に、この平均応答から Z スコアが計算されました。

摂取中に Ca2+ 反応を「興奮」または「抑制」のいずれかに分類するために、まずベースライン値を各試行の -6 秒から -4 秒の ROI の平均蛍光シグナルから計算しました。ピーク応答は、各試行のピーク付近の平均蛍光シグナル±1秒から計算されました。すべての試験について、ベースライン値とピーク応答の間の統計的比較 (Wilcoxon 符号付き順位検定) を実行しました。 p < 0.05 であり、陽性のピーク応答があった場合、細胞は興奮性応答として分類されました。 p < 0.05 であり、負のピーク応答を示した場合、細胞は抑制応答として分類されました。 p > 0.05 の場合、細胞は応答なしとして分類されました。

急性脳スライスを準備し、光遺伝学的刺激による全細胞記録を実行する手順は、以前に記載されたものと同様でした（Zhu et al.、2016）。 LS または TU を含む冠状 250 ～ 300 μm のスライスを、ビブラトーム (VT-1000S、Leica) を使用して、(mM) 110 塩化コリン、2.5 KCl、0.5 CaCl2、7 MgCl2、 1.3 NaH2PO4、1.3 Na-アスコルビン酸、0.6 Na-ピルビン酸、25 グルコースおよび 25 NaHCO3、95% O2 および 5% CO2 で飽和。スライスを 32 °C の酸素添加人工脳脊髄液 (mM: 125 NaCl、2.5 KCl、2 CaCl2、1.3 MgCl2、1.3 NaH2PO4、1.3 Na-アスコルビン酸、0.6 Na-ピルビン酸、25 グルコースおよび 25 NaHCO3) 中で少なくとも 1 分間インキュベートしました。録音の 1 時間前。スライスを記録チャンバーに移し、2 ml/min の人工脳脊髄液で灌流しました。ホウケイ酸ガラス (PG10150-4、World Precision Instruments) から引き抜いたパッチピペット (2 ～ 5 MΩ) に、(mM) 135 CsMeSO3、10 HEPES、1 EGTA、3.3 QX- を含む Cs ベースの低 Cl- 内部溶液を充填しました。 314、4 Mg-ATP、0.3 Na-GTP、8 Na2-ホスホクレアチン、290 mOsm kg-1、CsOHでpH 7.3に調整。全細胞電圧クランプ記録は、Multiclamp 700B 増幅器および Digidata 1440 A (Molecular Devices) を使用して室温で実行されました。データは 10 kHz でサンプリングされ、Clampfit (Molecular Devices) または MATLAB (MathWorks) で分析されました。 Digidata 1440 A からのデジタルコマンドによって制御される青色発光ダイオード (470 nm、Thorlabs) を使用して、光刺激を提供しました。光誘発 IPSC を記録するには、青色光パルス (473 nm、1 ms、0.5 ～ 2 mW) を光ファイバーを通して照射し、視野全体を照らしました。ＩＰＳＣは、ＣＮＱＸ（１０μＭ）の存在下、０ｍＶの保持電位で記録された。 IPSCをブロックするために、ピクロトキシンを灌流システムを通じて記録チャンバーに添加し、少なくとも5分間インキュベートしました。

c-fos免疫染色実験のために、マウスは給餌開始から90分後に屠殺された。 c-fos RNAScope in situ ハイブリダイゼーション実験では、マウスを給餌開始から 30 分後に屠殺しました。化学遺伝学的活性化実験の検証のために、動物を屠殺する０．５時間前にＣＮＯ（生理食塩水中２ｍｇ／ｋｇ体重、ＩＰ）を与えた。マウスを過剰量のペントバルビタールナトリウムで安楽死させ、リン酸緩衝食塩水（PBS、pH 7.4）、続いてPBS中の4%パラホルムアルデヒド（PFA）で経心的に灌流した。脳を 4% PFA を含む PBS 中で 16 ～ 24 時間後固定し、底に沈むまで 30% スクロース中で 24 ～ 48 時間脱水しました。切片を作成する前に、組織をドライアイス上の Tissue-Tek OCT コンパウンド (Sakura) に包埋しました。脳をクライオスタット(Leica)を用いて40μmの切片に切断した。浮遊凍結切片を PBS に収集しました。脳切片を最初に PBS で洗浄し (3 × 10 分)、次に 10% 正常ヤギ血清 (GS)/0.3% Triton X-100 (PBST) で室温でブロックし、次に一次抗体 (Rabbit Anti-c- fos、細胞シグナル伝達) 4 °C で一晩。脳切片をPBSTで洗浄し（3×10分）、続いて蛍光標識二次抗体（5% GS PBST中1:1000、Invitrogen）とともに2時間インキュベートし、最後にDAPI（1:3,000）で対比染色しました。

In situ RNA ハイブリダイゼーションのために、マウスの脳をクライオスタット (Leica) で 18 μm の切片に切断し、SuperFrost Plus 顕微鏡スライド上にマウントしました。 c-fos (Advanced Cell Diagnostics、# 316921-C3)、Nts (Advanced Cell Diagnostics、# 420441)、Penk (Advanced Cell Diagnostics、# 318761)、Crhr2 (Advanced Cell Diagnostics、# 413201)、vGAT (Advanced) をターゲットとするプローブCell Diagnostics、# 319191-C3) および vGluT2 (Advanced Cell Diagnostics、# 319171-C3) は、Advanced Cell Diagnostics によって設計および検証されました。 RNAscope v2 アッセイ (Advanced Cell Diagnostics、#323100) を、製造元のプロトコールに従ってすべての FISH 実験に使用しました (参照: Wang et al.、2002)。簡単に説明すると、脳切片を39℃で2時間乾燥させ、1×PBSですすぎ、メトン中の3%過酸化水素、TR緩衝液で15分間処理し、RNAScopeプロテアーゼIIIで40℃で15分間処理した。脳切片を mRNA プローブとともに 40 °C で 2 時間インキュベートしました。次いで、特異的シグナルを多重化インプリケーションバッファーで増幅し、TSA Plus Flucerence Kit (Advanced Cell Diagnostics、#322809) で検出しました。

画像はオリンパス仮想スライド顕微鏡 (VS120-S6-W) を使用して取得し、実験グループの正体を知らされていない個人によって分析されました。細胞計数は、以下に説明するように、カスタム作成された MATLAB ソフトウェアを使用して実行されました。

c-fos+、Nts+、Penk+、Crhr2+、CTB+ 細胞の数を計数するために、各マウスの標的脳領域の 40 μm 冠状切片を収集しました。画像はスライドスキャナー (Olympus Virtual Slide Microscope、VS120-S6-W) で取得し、カスタム作成の MATLAB ソフトウェアで細胞計数を実行しました。

統計分析は、GraphPad Prism (GraphPad Software V8) または Matlab (2017a、Mathworks) を使用して行われました。サンプルサイズを事前に決定するために統計は使用されませんでした。

我々は、絶食せずにおいしい食物の大量摂取を誘導する、アクセスが制限されたおいしい食物の給餌プロトコルを採用しました。この給餌プロトコルは、毎日 2 時間、高スクロース食品を断続的に摂取することで構成され、標準的な実験用飼料が常に提供されました [15、17]。マウスはこの2時間の期間で安定した食物摂取を発達させましたが、標準的な食事を自由に摂取できる対照マウスはこの期間中ほとんど食べませんでした（図1Aおよび図S1A、B）。食物摂取は主においしい食物に限定されており（図S1C）、摂食は主に食物のおいしさによって推進されていることが示唆され、これは快楽的摂食の特徴である。

A LS は、エネルギー不足なく高スクロース食品の摂取中に活性化されました。左パネル：対照マウス（標準食への随意摂取、n = 10）および快楽摂食マウス（標準食への随意摂取に伴う高スクロース食への断続的摂取、n = 10）について 2 時間で測定した摂食量。マン・ホイットニーの U 検定。 ****P < 0.0001。中央のパネル: コントロール (n = 10) および快楽摂食マウス (n = 10) の LS における c-fos+ ニューロンの数。マン・ホイットニーの U 検定。 ****P < 0.0001。右パネル：対照マウスおよび快楽摂食マウスのLSにおけるc-fos免疫染色の代表的な画像。スケールバー: 100 μm。 B マウスが絶食後に標準食と比較して高スクロース食（HSF）を摂取した場合、LS は優先的な活性化を示しました。左のパネル: 一晩絶食した後、標準的な食事 (n = 8) または高スクロース食品 (n = 8) について 2 時間以内に測定された食事摂取量。マン・ホイットニーの U 検定。 ****P < 0.0001。中央のパネル: 絶食、絶食 + 食事、および絶食 + HSF グループの LS 内の c-fos+ ニューロンの数。一元配置分散分析 (F(2, 21) = 6.558、P < 0.01) に続いて Tukey の事後検定。 ns、有意差なし、*P < 0.05、**P < 0.01。右パネル：絶食、絶食+食事、および絶食+HSF群のLSにおけるc-fos免疫染色の代表的な画像。スケールバー: 100 μm。 C c-fos (緑) と Nts (赤) のダブル in situ ハイブリダイゼーション実験の代表的な画像。スケールバー: 100 μm。 D c-fos (緑) と Penk (赤) のダブル in situ ハイブリダイゼーション実験の代表的な画像。スケールバー: 100 μm。 E c-fos (緑) および Crhr2 (赤) のダブル in situ ハイブリダイゼーション実験の代表的な画像。スケールバー: 100 μm。 F c-fos+ 集団中の Penk+、Crhr2+、および Nts+ 細胞の割合: Penk+/c-fos+ = 19.7 ± 2.5%、Crhr2+/c-fos+ = 13.5 ± 1.3%、および Nts+/c-fos+ = 57.6 ± 2.5%。一元配置分散分析 (F(2,14) = 43.71、P < 0.01) に続いて Tukey の事後検定。 ***P < 0.001 および ****P < 0.0001。平均値 ± sem G Nts (赤) および vGAT (緑) のダブル in situ ハイブリダイゼーション実験の代表的な画像。スケールバー: 100 μm。 H vGAT+ 集団における Nts+ 細胞の割合および Nts+ 集団における vGAT+ 細胞の割合: (Nts+ & vGAT+)/vGAT+ = 21.3 ± 3.8%、(Nts+ & vGAT+)/Nts+ = 100%、および (Nts+ & vGluT2+)/ Nts+ = 1.38 ± 0.5%。

私たちは、脳全体の快楽摂食活性化ニューロンを調べるために、最近のニューロン活動のマーカーである c-fos の免疫染色を実行しました。視床室傍核（PVT）、LS、帯状皮質（Cg）、SUM、島、海馬（Hipp）、水道周囲灰白質（PAG）、腹側被蓋野（VTA）、腹側外側膝状核（VLGMC）、TUおよび不定帯（ZI）（図S1Dおよび図1A）。視床下部の室傍核（PVN）および視床下部外側領域（LHA）を含む視床下部核は、摂食調節における役割と一致して、c-fos発現の増加を示しました（図S1D）。それらの中で、PVTとLSは最も高いc-fos発現を示しました（図S1D）。

快楽的な摂食に関与するニューロンは、動物がおいしい食物を摂取しているときにより活性化するはずです。次に、一晩絶食した後、おいしい食べ物を食べたマウスと通常の食事を食べたマウスのPVTおよびLSにおけるc-fos発現レベルを比較しました。マウスが高スクロース食品と通常の食事を摂取した場合、PVTは同様のレベルのc-fos発現を示しましたが、LSはマウスがおいしい食品を摂取した後に優先的な活性化を示しました（図1Bおよび図S1E、F）。したがって、LS は快楽的な摂食の調節において独特の役割を果たしている可能性があります。

LS には、異なる分子マーカーによって定義されるさまざまなニューロン集団が含まれています。快楽摂食によって活性化されたLSニューロンの分子同一性を決定するために、c-fosをコードするmRNAと、LSニューロンマーカーであるニューロテンシン（Nts）、プロエンケファリン（Penk）およびコルチコトロピンについて、RNAscope二重蛍光in situハイブリダイゼーション（dFISH）を実行しました。解放係数 (Crhr2)。 RNAScope により、快楽摂食活性化 LS ニューロンの 57.6% ± 2.5% が Nts 陽性であるのに対し、Penk 陽性は 19.7% ± 2.5% のみ、Crhr2 陽性は 13.5% ± 1.3% であることが明らかになりました (図 1C-F)。快楽摂食活性化c-fos+細胞は吻側から尾側LSに分布しており、これはNtsの発現パターンと類似しています（図S1G、H）。また、ニューロテンシンと、GABA作動性ニューロンのマーカーである小胞性GABAトランスポーター（vGAT）、または中隔領域のグルタミン酸作動性ニューロンのマーカーである小胞性グルタミン酸トランスポーター2（vGluT2）のプローブを使用してdFISHを実行しました。ほぼすべての Nts 陽性ニューロンは vGAT 陽性でもありましたが、Nts 陽性ニューロンは LS の GABA 作動性ニューロンの約 21% を構成しました (図 1G、H)。

私たちは、Cre依存性アデノ随伴ウイルス（AAV）媒介発現戦略を採用して、LSNtsニューロンの活性を特異的に操作し、快楽摂食におけるLSNtsニューロンの機能を研究しました。二重フロックスEGFP（AAV-DIO-EGFP）を運ぶAAVをNts-ires-CreマウスのLSに注射することにより[18]、発現がLSのNts陽性ニューロンに限定されることを確認しました（図S2A、B））。次に、シナプスサイレンシングの分子ツールとして広く使用されている、シナプトブレビン-2 を切断することで神経伝達物質の放出をブロックするプロテアーゼである破傷風神経毒 (TeNT) を使用しました [19]。 TeNT誘導性のシナプスサイレンシングの効率を検証するために、チャネルロドプシン-2（ChR2）を発現するCre依存性AAVを、対照としての強化緑色蛍光タンパク質（EGFP）またはシナプスサイレンシング用の破傷風神経毒（TeNT）と一緒にLSに注入した。 Nts-ires-Cre マウス (図 2B)。 EGFP 発現対照マウスから調製した LS 切片では、ChR2 発現 LSNts ニューロンの光刺激により、隣接するすべての ChR2 陰性 LS ニューロン (7/7) で強力なピクロトキシン感受性抑制性シナプス後電流 (IPSC) が誘発されました (図 2C、D)。。 TeNT の発現により、LSNts ニューロンからのシナプス伝達がほぼ完全に遮断されました (図 2C、D)。驚くべきことに、LSNtsニューロンからのシナプス出力のサイレンシングは、好みの高スクロースおよび高脂肪食品の摂取を強く促進しましたが、自由摂取条件下では標準的な食事の摂取は促進しませんでした（図2E、上のパネル）。この食欲促進効果は、2時間と24時間の給餌期間の両方で観察されました（図2Eおよび図S3A〜C）。しかし、絶食マウスでは、ホメオスタシスの必要性が摂食の主な推進力となったとき、食物の種類に関係なく、TeNT発現は食物摂取に影響を及ぼさなかった(図2E、下のパネル)。また、リックメーターを備えた電動リックスパウトを使用して、少量の固定容量（10μl）の口当たりのよいショ糖溶液またはEnsureを自由に送達する際の流動食の摂取に対するTeNT発現の影響を調べました（図S1I-）。 K）。 TeNT の発現はまた、口当たりの良い流動食（スクロース溶液とエンシュアの両方）の摂取を有意に促進しましたが、水は促進しませんでした（図 2F）。また、LSNts ニューロンを沈黙させるために、時間精度に優れた光遺伝学的アプローチも採用しました。 TeNT媒介シナプスサイレンシングと一致して、LSNtsニューロンの光遺伝学的サイレンシングは、味の良いEnsureの摂取を大幅に増加させ、これは光が当たった直後に起こりました（図S3G–K）。これらの結果を総合すると、快楽摂食の調節における LSNts ニューロンの重要な役割が明らかになります。

左パネル：LSNtsニューロンのシナプスサイレンシングのためのLSへのAAV-DIO-TeNTの注入を示す概略図。右パネル：Nts-ires-CreマウスのLSにおける注射部位およびウイルス発現の代表的な画像。スケールバー: 500 μm。 B LSNts ニューロンにおける ChR2 (赤) と TeNT (緑) の発現を示す代表的な画像。スケールバー: 500 μm (上のパネル)、20 μm (下のパネル)。 C LSNtsニューロンの光遺伝学的刺激によって誘発されたLSスライスのシナプス後電流を記録するために使用された実験を示す概略図。 ChR2がEYFPと共発現されたスライスでは、青色光刺激により強力なIPSCが誘発され（灰色のトレース）、これはピクロトキシンによってブロックされました（赤色のトレース）。 ChR2がTeNTと共発現されたスライスでは、青色光刺激はIPSCを誘発できませんでした（緑色のトレース）。 D TeNT 発現 (n = 6 細胞) および EYFP 発現 (n = 7 細胞) マウスにおける光誘発 IPSC の振幅の統計。二元配置分散分析 (F(1,11) = 53.46、P < 0.0001) に続いて Sidak の事後検定。 ***P < 0.0001。平均±標準誤差 E EYFP 発現マウス (灰色のバー、n = 6) および TeNT 発現マウス (緑色のバー、n = 8) における 2 時間の固形食物摂取の定量化。上のパネル: TeNT の発現により、自由摂取条件下では高スクロースおよび高脂肪食品の摂取量が増加しましたが、標準的な食事の摂取量は増加しませんでした。下のパネル: TeNT 発現は絶食条件下での食物摂取に影響を与えませんでした。マン・ホイットニーの U 検定。 ***P < 0.001。平均±sem F EYFP発現マウス（灰色のバー、n = 6）およびTeNT発現マウス（緑色のバー、n = 8）による2時間の流動食摂取の定量化。 TeNT の発現により、おいしい流動食の摂取量は増加しましたが、水の摂取量は増加しませんでした。 EYFP-（グレー、n = 6）における水（上パネル）、スクロース溶液（中パネル）、およびエンシュア（下パネル）の代表的ななめ行動（左パネル）、累積なめ回数（中パネル）および総摂取量（右パネル） TeNT 発現マウス (緑色、n = 8)。マン・ホイットニーの U 検定。 **P < 0.01 および ****P < 0.0001。平均値 ± sem G EYFP 発現マウス (灰色のバー、n = 7) および TeNT 発現マウス (緑色のバー、n = 7) の体重変化の定量化。左パネル:高脂肪食を6週間与えた後のEYFPおよびTeNT発現マウスを示す代表的な画像。右パネル: TeNT の発現は、高脂肪食を与えたマウスの体重増加を促進しましたが、標準的な食事を与えたマウスの体重増加は促進しませんでした。マン・ホイットニーの U 検定。 ns、有意差なし、*P < 0.01、***P < 0.001。平均±標準誤差

LSNts サイレンシングがおいしい食物摂取に与える強力な影響は、エネルギーバランスが乱れている可能性を示唆しています。次に、運動活動とエネルギー消費を調べました。光遺伝学を介したニューロン阻害またはTeNTを介したLSNtのシナプスサイレンシングは、オープンフィールド試験におけるマウスの一般的な運動活動に影響を与えませんでした（図S2Gおよび3D）。 TeNTの発現は、代謝ケージ内のマウスのエネルギー消費量を変化させませんでした（図S3E、F）。これらの結果と一致して、TeNT の発現により、高脂肪食を 3 週間与えたマウスの体重が大幅に増加しました (図 2G)。しかし、この体重増加は、通常の食事を与えられたマウスでは観察されませんでした (図 2G)。これらの結果は、快楽的な摂食と体重の調節における LSNts ニューロンの重要な役割を裏付けています。

次に、LSNts ニューロンの活性化が食物摂取に及ぼす影響を調べました。我々は、デザイナードラッグ（DREADD）hM3D[20]またはmCherryによってもっぱら活性化される興奮性デザイナー受容体を発現するCre依存性AAVを、Nts-ires-CreマウスのLSに注射しました（図3A）。 3週間後、生理食塩水ではなくクロザピン N-オキシド (CNO、2 mg/kg) を腹腔内 (IP) 注射すると、hM3D 発現 LS ニューロンで強力な c-fos 発現が生じました (図 3B)。自由な条件下では、LSNts ニューロンの化学遺伝学的活性化により、食物の種類に関係なく、食物摂取量が大幅に減少しました（図 3C、上のパネル）。しかし、絶食状態では、LSNtsニューロンの活性化は、おいしい高脂肪および高スクロース食品の摂取量を減少させるだけであり、標準的な食事の摂取量は減少させませんでした（図3C、下のパネル）。 LSNts ニューロンの活性化は、口当たりの良い流動食、スクロース溶液とエンシュアの両方の摂取も抑制しました（図 3D–E）。 LSNtの化学遺伝学的活性化は、マウスの一般的な運動活動には影響を与えませんでした（図S2D）。 LSNtsニューロンの活動を操作しても、オープンフィールドテストでは不安に関連した行動には影響がなく（図S2Eおよび2H）、血圧、体温、血糖値、心拍数にも影響はありませんでした（図S4）。摂食の調節におけるLSNtsニューロンの特定の役割。

左パネル：LSNtsニューロンの化学遺伝学的活性化のためのLSへのAAV-DIO-hM3Dの注入を示す概略図。右パネル：Nts-ires-CreマウスのLSにおける注射部位およびウイルス発現の代表的な画像。スケールバー: 500 μm。 B 左パネル: CNO 注射 (2 mg/kg) が hM3D 発現マウスにおいて LSNts ニューロンの強力な c-fos 発現を誘導したことを示す代表的な画像。スケールバー: 100 μm。右パネル:「hM3D + 生理食塩水」(n = 4)、「EYFP + CNO」(n = 4)、および「hM3D + CNO」(n = 4) グループの LSNts ニューロンにおける c-fos+ 細胞の割合。一元配置分散分析 (F(2,9) = 684.5、P < 0.001) に続いてダネットの事後検定。 ****P < 0.0001。 C mCherry発現マウスおよびhM3D発現マウスにおける生理食塩水(灰色のバー)およびCNO(赤色のバー)注射後の2時間の固形食物摂取の定量化。上のパネル: CNO 注射は、hM3D 発現マウス (n = 6) において自由条件下で食物摂取量を減少させましたが、mCherry 発現マウス (n = 5) では減少させませんでした。二元配置分散分析 (標準飼料、F(1,18) = 8.202、P < 0.05; 高スクロース食品、F(1,18) = 9.941、P < 0.01; 高脂肪食品、F(1,18) = 19.27、P < 0.001) に続いて Sidak の事後検定を行います。 **P < 0.01、***P < 0.001、および ****P < 0.0001。下のパネル: CNO 注射により、hM3D 発現マウス (n = 6) において絶食-再食条件下で高スクロースおよび高脂肪食の摂取が減少しましたが、mCherry 発現マウス (n = 5) では減少しませんでした。二元配置分散分析 (標準飼料、F(1,18) = 0.9784、P > 0.05; 高スクロース食品、F(1,18) = 5.234、P < 0.05; 高脂肪食品、F(1,18) = 6.420、P < 0.05)、その後の Sidak の事後テスト、***P < 0.001、平均 ± sem D CNO 注射は、hM3D 発現 (n = 7) でしたが、mCherry 発現マウス (n = 5) ではありませんでした。スクロース溶液:二元配置分散分析 (F(1,20) = 7.96、P < 0.05) に続いて Sidak の事後検定。 ***P < 0.001。確認: 二元配置分散分析 (F(1,20) = 15.70、P < 0.001) の後に Tukey の事後検定を実行します。 ****P < 0.0001。平均±標準誤差

我々の結果は、LSNtsニューロンのサイレンシングが快楽摂食を特異的に促進する一方で、LSNtsニューロンの活性化が全体的な摂食を抑制することを示した。私たちは、LSNts ニューロンからのさまざまなシグナルが、快楽特異的および全体的な摂食を異なって調節しているのではないかと疑問に思いました。 LSNtの短い光遺伝学的刺激（1ms）後の局所シナプス後ニューロンにおけるピクロトキシン感受性IPSCを記録したように、基礎生理活性レベルでは、GABAが放出され、シナプス後ニューロンに作用しました（図2C）。強力な化学遺伝学的活性化により、ニューロテンシンペプチドは CNO 注射後に下流領域で検出されています (Patterson CM et al., 2015)。したがって、我々は、基礎活性レベルでのGABA放出が快楽摂食を抑制する一方、強いLSNts活性化によりニューロテンシンがさらに動員され、全体的な摂食を抑制すると仮説を立てた。

この仮説を検証するために、我々は CRISPR/Cas9 媒介ゲノム編集 [21] を使用して、LSNts ニューロンにおける GABA またはニューロテンシン放出をノックダウンしました。我々は、GABA 放出を減少させるために、GABA をシナプス小胞に詰め込み、GABA 作動性シナプス伝達に不可欠な小胞 GABA トランスポーター (vGAT) を標的とするシングルガイド RNA (sgRNA) を設計しました [22]。 Nts-ires-Cre マウスと Cre 誘導性 Cas9 ノックインマウスを交配した後 [21]、vGAT ターゲティング (sgRNA) と Cre 誘導性 hM3D-mCherry の両方を保持する AAV をLS に注入して、vGAT ノックダウンで hM3D を発現させました。細胞（図４Ａ）。 vGAT ノックダウンの効率を検証するために、vGAT ノックダウン動物の LS に AAV-DIO-ChR2 を注射し、シナプス後ニューロンからの IPSC を記録しました。短い青色光刺激 (1 ms) により、対照 LacZ sgRNA 動物から記録されたすべてのニューロン (8/8) で強力な IPSC が誘発されました (図 4B-D、灰色の線)。しかし、同じ光刺激では、vGAT ノックダウン動物から記録されたすべてのニューロン (0/8) で IPSC を誘発できませんでした (図 4C、D、赤線)。これらの結果は、GABA シグナル伝達を破壊するための CRISPR/Cas9 戦略の高い効率を実証しました。

CRISPR/Cas9を介したvGATおよびNtsのノックダウンの実験デザインを示す概略図。 vGAT ターゲティング、Nts ターゲティング、またはコントロール LacZ ターゲティング sgRNA および Cre 誘導性 hM3D をコードする AAV を、Cre 誘導性 Cas9 ノックインマウスと交配した Nts-ires-Cre マウスに注射しました。 B vGAT ノックダウンを検証するための実験計画を示す概略図。 LacZ コントロールまたは vGAT ノックダウンマウスでは、LSNts ニューロンで ChR2 が発現され、隣接する Nts 陰性ニューロンで全細胞パッチクランプ記録が行われました。 C 異なる光出力(左から右へ: 0.5 mW、1.0 mW、1.5 mW、2.0 mW)でのLacZコントロール(灰色)およびvGATノックダウン(赤色)マウスの光誘発IPSCの代表的なトレース。 D LacZ コントロール (灰色、n = 8 細胞) および vGAT ノックダウンマウス (赤色、n = 8 細胞) マウスにおける光誘発 IPSC の振幅の統計。二元配置分散分析 (F(1,14) = 50.87、P < 0.0001) に続いて Sidak の事後検定。 **P < 0.01 および ***P < 0.0001、意味 ± sem E LacZ 対照 (黄色、n = 11)、vGAT ノックダウン (赤色) によるベースライン食物摂取量 (左パネル: 標準食、右パネル: 高スクロース食品) 、n = 9）およびNtsノックダウンマウス（青色、n = 13）。一元配置分散分析 (標準的な食事、F(2,230) = 1.716、P > 0.05; おいしい食品、F(2,30) = 6.563、P < 0.01) に続いて Tukey の事後検定。 ns、有意差なし、*P < 0.05。平均±標準誤差 LacZ コントロール (n = 11)、vGAT ノックダウン (n = 9)、および Nts ノックダウン (n = 13) による食物摂取に対する LSNts ニューロンの化学遺伝学的活性化の影響 (左パネル: 標準的な食事、右パネル: おいしい食品) ）マウス。二元配置分散分析 (標準的な食事、F(2,60) = 4.661、P < 0.05; おいしい食品、F(2,60) = 5.583、P < 0.01) に続いて Sidak の事後検定。 ns、有意差なし、*P < 0.05、***P < 0.001、****P < 0.0001、平均±sem G CNO (2 mg/kg) 注射が強力な c-fos 発現を誘導したことを示す代表的な画像LacZ コントロール、vGAT ノックダウン、および Nts ノックダウンマウスの LSNts ニューロンにおける結果。スケールバー: 100 μm。 H LacZ コントロール (n = 3)、vGAT ノックダウン (n = 3)、および Nts ノックダウン (n = 3) マウスにおける生理食塩水および CNO 注射後の c-fos+ 細胞の比率の統計分析。一元配置分散分析 (F(5,12) = 854.6、P < 0.0001) に続いて Tukey の事後検定。 ****P < 0.0001。平均±標準誤差

LSNtsニューロンにおけるvGATノックダウンは、標準的な食事の摂取量には影響を及ぼさなかったが、口当たりの良い高スクロース食品の摂取量を有意に増加させた（図4E）。これは、GABAが基礎条件下で快楽摂食を特異的に抑制することを示唆している。同様のアプローチを使用して、ニューロテンシンペプチドをノックダウンするために Nts を標的とする sgRNA を設計しました。ニューロテンシンのノックダウンは、食物の種類に関係なく、食物摂取に影響を与えませんでした（図4E）。これらの結果は、基礎的な生理学的条件下では、ニューロテンシンではなく、GABA シグナル伝達が快楽摂食に対する LSNts ニューロンの抑制効果を媒介することを示唆しています。

次に、LSNts ニューロンの化学遺伝学的活性化に対する vGAT またはニューロテンシンのノックダウンの影響を調べました。 CNO注射によるLSNtの化学遺伝学的活性化は、3つのマウス群すべてにおいて強力なc-fos発現を誘導した(図4G、H)。 LacZ 対照マウスでは、LSNts ニューロンの化学遺伝学的活性化により、食物の種類に関係なく食物摂取が抑制されました (図 4F)。これは、我々の以前の結果と一致しています。 vGATノックダウンマウスでは、CNOの投与により食物摂取も有意に抑制され(図4F)、LSNtsニューロンが強く活性化された場合にはGABA作動性伝達は必要ないことが示唆された。 Nts ノックダウンマウスでは、CNO 注射は依然としておいしい食物の摂取を抑制しましたが、固形飼料の摂取を抑制することはできませんでした。このことは、快楽摂食の抑制における GABA シグナル伝達の特異的な役割をさらに示しています。 (図4F)。

まとめると、これらの CRISPR/Cas9 ノックダウン実験は、LSNts ニューロンからの GABA シグナル伝達とニューロテンシンシグナル伝達の両方が摂食を調節しているが、それらは異なる活性レベルで作用することを示しています。 LSNts ニューロンから放出される GABA は強壮阻害をもたらし、基底レベルで快楽摂食を抑制しますが、ニューロテンシンは強い活性化によりさらに動員され、摂食全体を抑制します。

我々は、ファイバー測光法[23]を利用して、摂食行動におけるLSNtsニューロン活動の動態と、快楽摂食におけるこれらのニューロンの関与を評価した。我々は、遺伝的にコードされたCa2+インジケーター（GCaMP6s）を発現するCre依存性AAVをLSNtsニューロンに形質導入し[24]、Nts-ires-CreマウスのLSに光ファイバーを移植した。ファイバー測光法を使用して、食物の探索と消費中に LSNts ニューロンから集団 Ca2+ シグナルを記録しました。まず、少量の固定量の口当たりの良いEnsureの合図条件付き送達中のLSNtsニューロンの活動を調べました（図S5A）。 LSNts ニューロンは、摂食中に堅牢な Ca2+ 動態を示しました（図 S5B）。しかし、Ca2+シグナルが合図の開始と一致している場合、その活動は食物を予測する聴覚合図や食物送達によって調節されませんでした（図S5C）。対照的に、Ca2+シグナルを合図後の最初のなめに合わせた場合、動物が餌の注ぎ口に近づく最初のなめの前にLSNts活性の増加が観察されました。この活性の増加に続いて、動物が食物を消費し始めると、活性のより強力な減少が続きました（図S5D）。

また、聴覚的合図が存在せず、餌の注ぎ口が常に利用可能な、フリーアクセスで自分のペースで摂食するプロトコル [25] 中に Ca2+ シグナルも記録しました。合図条件摂食と一致して、我々は、食物接近相中に興奮性反応を示し、食物消費相中に抑制性反応を示す二相性LSNtsニューロンCa2+動態を観察した（図5A、左パネル）。接近段階中の興奮反応は、動物に通常の餌や希釈したエンシュアではなく、口当たりの良いエンシュアを与えた場合にのみ観察されました（図S6A〜C）。これは、この活動がランニングやその他の運動アーチファクトによって引き起こされたものではないことを示唆しています。ただし、消費段階で観察された抑制反応は、異なる食品の種類間で同様でした（図S6A〜Cおよび6E、F）。食物を水に置き換えると、興奮性反応と抑制性反応の両方が減少しました（図S6D）。

左パネル：Ensureの自由摂取中のLSNtsニューロンの集団Ca2+活性。中央のパネル: 食物を省略した場合の LSNts ニューロンの集団 Ca2+ 活性。右パネル: 動物を頭部に固定し、餌を与えたときの LSNts ニューロンの集団 Ca2+ 活性。縦の破線: 最初のなめ。 B 食物アプローチ段階中の Ca2+ 活性の曲線下面積 (n = 8)。一元配置分散分析 (F(2, 21) = 5.49、P < 0.01) に続いて Tukey の事後検定。 *P < 0.05。平均±標準誤差 C 食物摂取段階中の Ca2+ 活性の曲線下面積 (n = 8)。一元配置分散分析 (F(2, 21) = 11.05、P < 0.01) に続いて Tukey の事後検定。 **P < 0.01 および ***P < 0.001。平均±sem D 上のパネル: LSNts ニューロンの光遺伝学的操作のための LS への AAV-DIO-ChR2 または AAV-DIO-eNpHR の注入を示す概略図。中央のパネル: LSNts ニューロンにおける ChR2-mCherry の発現を示す代表的な画像。下のパネル: eNpHR-EYFP の発現を示す代表的な画像。 E 食物接近段階中の LSNts ニューロンの光遺伝学的活性化 (青色、n = 4) または阻害 (黄色、n = 6) が食物探索および食物消費に及ぼす影響。ウィルコクソンの符号付き順位テスト。 *P < 0.05。 F 食物探索および食物消費に対する食物消費段階中の LSNts ニューロンの光遺伝学的活性化 (青色、n = 4) または阻害 (黄色、n = 6) の影響。ウィルコクソンの符号付き順位テスト。 *P < 0.05 および **P < 0.01。

これらの観察に基づいて、我々は、接近段階での LSNts ニューロンの興奮性反応はおいしい食べ物を手に入れる動機を表している可能性があり、したがって食べ物の探索と接近行動を促進するのに重要である一方、消費段階での抑制性反応はおいしい食べ物を手に入れるために重要である可能性があると仮説を立てました。全体的に完璧な行動。この仮説を検証するためにいくつかの試験で食物の送達を省略したところ、最初のなめ後の抑制反応が消失する一方、接近段階中の興奮反応は維持されることがわかりました（図5A、中央のパネル）。また、我々は、食物探索に従事する機会を排除した、頭を固定した体拘束摂食手順におけるLSNtsの活動を調べた。最初になめる前の興奮性反応は消失したが、摂取中の抑制性反応は保存されていることがわかりました（図5A、右パネル）。

二相反応は、接近段階中の LSNts ニューロンの活性化が食物の探索を促進する一方、消費段階中の LSNts ニューロンの抑制が食物の消費に必要であると予測します。我々の以前のTeNTシナプス不活性化と化学遺伝学的活性化では、生体内で測定したアプローチロック型ニューロンダイナミクスと消費ロック型ニューロンダイナミクスを区別できませんでした。光遺伝学的手法によって提供されるミリ秒の時間分解能を利用して、アプローチフェーズと消費フェーズの間のLSNtsニューロンの活動を特に操作し、食物の探索と食物消費に対するその影響を調べました。

次に、光遺伝学的活性化のためにLSNtsニューロンで興奮性オプシンChR2 [26]を発現させ、さまざまな摂食段階中の時間的に正確な光遺伝学的活性化の影響を調べました（図5D）。食物接近相中の光刺激は潜時を大幅に短縮し、食物ゾーンへの速度を増加させました（図5E）。これは、食物接近相中のLSNtsニューロンの活性化が食物探索行動を促進したことを示唆しています。しかし、この光遺伝学的操作は食物消費には影響を与えませんでした（図5E）。対照的に、消費段階中のLSNtsニューロンの光遺伝学的活性化は、食物消費を大幅に抑制しましたが、食物ゾーンへの入場時間は変化しませんでしたが、食物ゾーン内で過ごす時間は減少しました（図5F）。次に、時間的に正確な光遺伝学的サイレンシングを達成するために、LSNtsニューロンで抑制性オプシンeNpHR[27]を発現させました（図5D）。一貫して、接近段階中のLSNtsニューロンの光遺伝学的抑制は完了行動に影響を及ぼさなかったが、消費段階中の光遺伝学的抑制は総食物摂取量を強く促進した（図5E、F）。

ファイバー測光法は複数の LSNts ニューロンからの Ca2+ 活動を合計して記録するため、考えられる 2 つのシナリオにより、摂食中の LSNts ニューロンの二相反応を説明できる可能性があります。まず、LSNts ニューロンの異なる部分集団が活性化または抑制されました。第二に、LSNts ニューロンの単一集団は、食物の接近中に最初に活性化され、次に食物摂取中に抑制されました。これら 2 つの可能性を区別するために、我々は、頭部装着型小型顕微鏡と埋め込み型屈折率分布型 (GRIN) レンズを使用して、自由に動くマウスの個々の LSNts ニューロンの in vivo Ca2+ イメージングを実行しました [28] (図 6A、B)。

ヘッドマウント小型顕微鏡を使用した個々の LSNts ニューロンの Ca2+ イメージングを示す概略図。 B 摂食中の 10 個の代表的な LSNts 細胞の Ca2+ 動態。スケールバー: 1 z スコア。 C エンシュアの自由給餌中の最初の舐めに合わせた 290 個の LSNts 細胞の Ca2+ 応答。約 31% の細胞が活性化され、32% の細胞が阻害されました。 D 活性化細胞のピークまでの時間 (n = 88) は、阻害細胞の谷までの時間 (n = 86) より短かった。マン・ホイットニーの U 検定。 ***P < 0.001。 E 活性化細胞 (n = 88) の応答半値幅は、阻害細胞 (n = 86) の応答半値幅より短かった。マン・ホイットニーの U 検定。 ***P < 0.001。 F. 食物欠乏条件下での最初の舐めに合わせた 130 個の LSNts 細胞の Ca2+ 応答。約 40% の細胞が活性化され、11% の細胞が阻害されました。 G. 自由給餌条件（左パネル）および給餌省略条件（右パネル）における活性化細胞、阻害細胞、および非応答性細胞の割合。 H Ensureの自由給餌試験および食物省略試験中の活性化細胞（左パネル）および阻害細胞（右パネル）のCa2+活性の曲線下面積。マン・ホイットニーの U 検定。うーん、大きな違いはありません。 I. 抑制されたニューロン (左のパネル) と活性化されたニューロン (中央のパネル) の応答の半値幅と発作持続時間の間の相関関係。右パネル: 阻害された細胞の応答と行動の間の相関係数は、活性化された細胞の相関係数よりも大きかった。マン・ホイットニーの U 検定。 ***P < 0.001。 J Ensure を自由に与えている間の最後の舐めに合わせたときの活性化細胞 (右パネル) と阻害細胞 (左パネル) の Ca2+ 応答。 K. K 平均クラスタリングによってグループ化された、スクロース溶液および Ensure に対する LSNts ニューロンの Ca2+ 応答（マウス 4 匹からの n = 143 ニューロン）。縦の破線: 最初のなめ。 K 平均法クラスタリングによってグループ化された、Ensure および通常の餌に対する LSNts ニューロンの L Ca2+ 応答 (マウス 4 匹からの n = 124 ニューロン)。縦の破線: 最初のなめ。 K 平均クラスタリングによってグループ化された、Ensure および水に対する LSNts ニューロンの M Ca2+ 応答 (マウス 4 匹からの n = 161 ニューロン)。縦の破線: 最初のなめ。 N エンシュア、ショ糖溶液、通常の餌および水を自由に与えた際に特定された活性化細胞、抑制細胞、および非反応性細胞の割合。

私たちは LSNts ニューロンで GCaMP6s を発現させ、おいしいエンシュアを自由にアクセスし、自分のペースで給餌している間に、ヘッドマウント小型顕微鏡を介して個々の細胞の Ca2+ 活性を画像化しました。 LSNts ニューロンは、動物が近づいて食物を摂取し始めたとき (最初のなめるあたり) が最も反応性が高かった。ニューロンの 31% が有意に活性化され、32% が有意に阻害されました (図 6C、G)。活性化されたニューロンはより速く反応する傾向がありました。それらは最初のなめの0.3±0.1秒前にピークに達しましたが、阻害された細胞は最初のなめの3.6±0.3秒後に最下点に達しました(図6D)。活性化細胞はまた、阻害細胞（6.8±0.4秒）よりも有意に小さい半値幅（3.7±0.3秒）を有する、より狭い応答ウィンドウを示した（図6Eおよび図S6G）。 2 つのニューロン集団の時間動態におけるこれらの違いは、ファイバー測光記録で観察された二相性反応に寄与している可能性があります。この可能性をテストするために、各セルの応答を正規化し、それらを加算しました。合計された集団応答は、測光応答を彷彿させる二相応答を示すことがわかりました（図S7H）。

我々は、摂食における活性化および抑制されたLSNtsニューロン集団の正確な役割を、食物省略試験中に画像化を行うことによって調べた。食物を省略すると、阻害された LSNts ニューロンの割合は 11% に減少しましたが (図 6F、G)、活性化ニューロンの割合は依然として高かった (40%)。これは、阻害されたニューロンが主に摂食完了期に関与していることを示唆しています。行動。絶食条件下での活性化ニューロンと抑制ニューロンの両方の平均応答振幅は、自由摂食条件下での反応振幅と同様でした（図6H）。次に、抑制されたニューロンの反応が完了的な行動を追跡できるかどうかを調べました。我々は、各試験におけるCa2+反応と消費的舐め行動との関係を分析し、発作持続時間と抑制された神経細胞集団の反応持続時間との間に有意な相関関係を観察した（図6I）。発作持続時間と反応半値幅との間で計算された相関係数は、活性化集団（0.28 ± 0.05）よりも阻害集団（0.69 ± 0.05）の方が有意に高かった（図 6I）。行動。抑制されたニューロンが食物摂取を停止できるかどうかをさらに調べるために、最後のなめに対する反応を並べたところ、最後のなめの直後に反応がベースラインに戻ったことがわかりました（図6J）。したがって、阻害された LSNts ニューロンは主に食物の消費に寄与します。

次に、嗜好性の異なる食品を与えている間の LSNts ニューロンの活動をモニタリングしました。テストされた食品には、口当たりの良いエンシュアまたはスクロース溶液、中性の通常の食品または水が含まれていました。我々は、同じセッションで 2 つの異なる食品を連続して提供し、2 つの異なる食品に対する応答の教師なし K 平均法クラスタリングを使用して、異なる食品に対する同じ細胞の応答を正確に特定しました [25]。エンシュアとスクロース溶液を自由に与えた場合の反応を比較し、同様の反応を観察しました。 Ensure とスクロースの両方が、同様の割合の LSNts ニューロンを活性化および阻害しました (図 6K)。 Ensure とスクロースによって活性化および抑制された LSNts ニューロンは、ほぼ同じ部分集団でした。ただし、活性化細胞の割合は、通常の餌（11％）または水（9％）を与えた場合には大幅に低下しました（図6L-N）。これらの結果は、活性化された LSNts ニューロンが食品の美味しさとより密接に相関していることを示しました。

LSNts ニューロンによる摂食制御の回路機構をさらに調べるために、赤色蛍光タンパク質 tdTomato とシナプス小胞タンパク質シナプトフィジンに融合した強化緑色蛍光タンパク質 (EGFP) を共発現する SynaptoTag AAV を使用して、LSNts ニューロンからの投影を体系的にマッピングしました [19]。。 AAV-FLEX-tdTomato-T2A-シナプトフィジン-EGFPをNts-ires-creマウスのLSに注射しました（図7A）。 SynaptoTag AAV に感染したニューロンは、細胞質および軸索線維に tdTomato で満たされ、緑色蛍光シナプトフィジンが遠心性シナプスに局在しました。この追跡戦略により、LSNts ニューロンが、外側視索前野および内側視索前野 (POA)、結節核 (TU)、視床下部前核 (AHN)、および乳頭上核 (SUM) を含むいくつかの脳領域と主要なシナプス結合を形成していることがわかりました。図７Ｂ、Ｃ）。 LSNtsニューロンでChR2を発現させ、スライス内のTUニューロンから全細胞記録を実行して、機能的なシナプス接続を検証しました。 TUのLSNtの軸索終末の短い青色光刺激は、記録されたTUニューロンの約50％から強力なピクロトキシン感受性IPSCを誘発し（図S7C–E）、LSNtとTUニューロンの間の機能的なGABA作動性シナプス接続が確認されました。

LSNts ニューロンの投影をマッピングするための SynaptoTag AAV 戦略を示す概略図。 B Nts-ires-Cre マウスのLSにおける注射部位とウイルス発現の代表的な画像。 C 異なる領域の tdTomato 発現軸索と GFP 発現軸索末端を示す代表的な画像。スケールバー: 200 μm。 D 化学遺伝学的アプローチを通じて 1 つの特定の下流標的に投射する LSNts ニューロンを活性化するために使用されるウイルス戦略を示す概略図。各 LSNts 投影の化学遺伝学的活性化後の、標準的な固形飼料 (E)、高スクロース (F)、および高脂肪 (G) 食品の摂取量の定量化。対照群、n = 7。 LSNts→POA グループ、n = 6; LSNts→AHN グループ、n = 6; LSNts→TU グループ、n = 7; LSNts→SUM グループ、n = 8。二元配置分散分析 (標準飼料、F(4,68) = 2.854、P < 0.05; 高スクロース食品、F(4,58) = 9.145、P < 0.0001、高-脂肪食品、F(4,58) = 4.541、P < 0.0001) に続いて Sidak の事後テストを行った。 *P < 0.05、**P < 0.01、***P < 0.001、****P < 0.0001。平均値 ± sem H 上のパネル: 光遺伝学的アプローチを通じて TU に投射する LSNts ニューロンを阻害するために使用されるウイルス戦略を示す概略図。下のパネル: TU に投射している LSNts ニューロンにおける eNpHR-EYFP の発現を示す代表的な画像。スケールバー: 200 μm。 I TU 投影 LSNts ニューロンの光遺伝学的阻害は、通常の食物摂取に影響を与えませんでした。 EYFP 対照群、n = 5。 eNpHR グループ、n = 6。二元配置分散分析 (F(1,18) = 0.2096、P > 0.05)。平均値 ± sem J TU 投影 LSNts ニューロンの光遺伝学的阻害により、Ensure の摂取量が大幅に増加しました。 EYFP 対照群、n = 5。 eNpHR グループ、n = 6。二元配置分散分析 (F(1,18) = 5.341、P < 0.05) に続いて Sidak の事後検定。 **P < 0.01。平均値±標準誤差 K SUM におけるニューロテンシン受容体 1 (NtsR1) mRNA シグナルの in situ ハイブリダイゼーション結果を示す代表的な画像。 L SUMへのNtsペプチドの局所注入の実験デザインを示す概略図。 M SUM への生理食塩水 (灰色のバー、n = 8) または Nts (青色のバー、n = 8) 投与後の 2 時間の標準食摂取量の定量化。ウィルコクソンの符号付き順位テスト。 ***P < 0.001。 N SUM への生理食塩水 (灰色のバー、n = 8) または Nts (青色のバー、n = 8) 投与後の 2 時間の高脂肪食品摂取の定量化。ウィルコクソンの符号付き順位テスト。 **P < 0.01。 ○通常の餌（左パネル）またはエンシュア（右パネル）の自由給餌中にファイバー測光法によって記録されたLSNts→TUの平均Ca2+活性。上のパネル: 5 匹のマウスからの母集団の平均。下のパネル: 個々のマウスにおける Ca2+ 活性。 P 通常の餌(左パネル)またはEnsure(右パネル)の自由給餌中にファイバー測光法によって記録されたLSNts→SUM回路の平均Ca2+活性。上のパネル: 3 匹のマウスからの母集団の平均。下のパネル: 個々のマウスにおける Ca2+ 活性。

LSNts投影の解剖学的組織を明らかにするために、TUおよび他のLSNtsの下流ターゲットに逆行性トレーサーCTB555およびCTB647/488を注入し、異なるターゲットに投影するCTB標識LSNtsニューロン間の重複を調べました（図S9）。 TU投影LSNtsニューロンのわずか6.0％がPOAに投影され、TU投影LSNtsニューロンの8.3％がAHNに投影され、TU投影LSNtsニューロンの11.3％がSUMに投影され（図S9B–E）、重複がほとんどないことを示唆していますTU 投影ニューロンと POA 投影ニューロン、AHN 投影ニューロン、SUM 投影 LSNts ニューロンの間。予想通り、CTB555 と CTB647 を TU に同時注入すると、高い割合の共同標識が得られました (CTB555 では 92.9%、CTB647 では 66.0%) (図 S9F)。同様の方法を使用して、LSNts下流投影の他のすべてのペアの間でほとんど重複が観察されず（図S9B）、LSNtsニューロンの1対1の投影パターンがサポートされます。

我々は、retroAAV-FLEX-FlpOを下流投影標的の1つに注射し、AAV-fDIO-hM3DをNts-ires-CreマウスのLSに注射することにより、どのLSNts投影が快楽摂食の調節に重要であるかを調べた（図7D）。この戦略により、特定の下流標的に投影するLSNtsニューロンにおけるhM3Dの選択的発現がもたらされ、hM3D発現LSNtsニューロンの数は異なる経路間で同等であった（図S7A、B）。 CNO注入によるLSNts→POA、LSNts→AHNおよびLSNts→SUM回路の活性化は、食物の種類に関係なく、食物摂取を有意に抑制しました（図7E–G）。しかし、LSNts→TU経路の活性化は、味のよい高脂肪および高スクロース食品の摂取を特異的に抑制したが、標準的な固形飼料の摂取は抑制しなかった（図7E-G）。 LSNts→TU経路の活性化は、オープンフィールドテストでは一般的な運動活動や不安様行動に影響を与えませんでした（図S7H-J）。快楽摂食におけるLSNts→TU経路の特定の役割のため、我々は次に、この経路をサイレンシングすることで快楽摂食が強化されるかどうかをテストした。我々は、LSNts→TU経路を阻害するために経路特異的な光遺伝学的戦略を採用した（図7H）。実際、LSNts→TU経路の阻害は、味のよいEnsureの給餌を促進しましたが、標準的な飼料の摂取は促進しませんでした（図7I、J）。 TU のソマトスタチン (SST) 陽性ニューロンは、状況に応じた過剰な摂食、主に快楽的な摂食を媒介することが最近報告されています [8]。また、TU内のLSNts軸索終末の分布を調べ、LSNtsからのシナプトフィジン陽性シナプスボタンとTU内のSST陽性ニューロンの間の広範な重複を検出しました（図S7F、G）。

われわれは、LSNts ニューロンの下流投射領域がニューロテンシン受容体を発現し、したがってニューロテンシンシグナル伝達の食欲抑制効果を媒介する可能性があるかどうかを、in situ ハイブリダイゼーションを実行して 4 つの主要な投射標的におけるニューロテンシン受容体 1 (NtsR1) mRNA を検出することによって調べた。 SUM では強力な NtsR1 mRNA シグナルが観察されましたが、POA、AHN、および TU では NtsR1 mRNA がほとんど、またはまったく検出されませんでした。 (図7KおよびS8A)。 SUM へのニューロテンシンペプチド (1 μg) の局所注入は、食物の種類に関係なく摂食を抑制しました。これは、SUM のニューロテンシンシグナルが摂食全体を抑制するのに十分であることを示しています (図 7L-N)。対照的に、TUへのニューロテンシンの注入は摂食の影響を及ぼさなかった(図S8A-C)。これはニューロテンシン受容体発現の欠如と一致している。ニューロテンシンがニューロン活動にどのような影響を与えるかを調べるために、TU および SUM ニューロンからの全細胞パッチクランプ記録を実行しました。スライスの調製では、ニューロテンシン（2μM）の適用により、SUMの記録されたニューロン3/6の活動電位発火が増加しました（図S8H）。ただし、TU (0/7) のニューロンはスライスでのニューロテンシンの適用に対する応答を示しませんでした (図 S8G)。また、生体内でニューロテンシン（1μg）をSUMに局所注入し、強力なc-fos発現を観察し（図S8D–F）、ニューロテンシンシグナルがSUMニューロンを活性化することをさらに確認しました。

興奮性および抑制性応答が異なる下流標的に投射する LSNts ニューロンから生じる可能性を調べるために、TU または SUM を投射する LSNts ニューロンで GCaMP を発現させることにより、LSNts→TU および LSNts→SUM 経路からの Ca2+ 動態を記録しました。 LSNts集団と同様に、LSNts→TUは、自由なEnsure摂食中に二相性反応を示した(図7O)。しかし、LSNts→SUMは純粋な阻害反応を示し、マウスが通常の餌を摂取したときよりもEnsureを摂取したときの反応振幅が大きかった(図7P)。

LSNts ニューロンの活性化は摂食を抑制しましたが、LSNts ニューロンの操作はエネルギー消費に影響を与えませんでした。私たちは、LSNtsニューロンの活性を高めることで高脂肪食誘発性肥満を予防できるのではないかと考え、化学遺伝学的アプローチでLSNtsニューロンを慢性的に活性化しました（図8A）。対照マウスでは、高脂肪食の導入により体重が急速に増加し、6週間後には37%±4%増加しました(図8B、赤線)が、標準的な固形飼料のみを与えたマウスの体重は維持されました。 14% ± 1% 増加しました (図 8B、灰色の線)。 CNOの毎日の腹腔内注射によるLSNtsニューロンの化学遺伝学的活性化は、体重の増加を逆転させた(10%±1%)(図8B、緑色の線)。交差ウイルス戦略を使用して、Nts-ires-CreマウスのTUにretroAAV-FLEX-FlpOを注入し、LSにAAV-fDIO-hM3Dを注入することにより、TU投影LSNtsニューロンにhM3Dを選択的に形質導入しました。 LSNts→TUの化学遺伝学的活性化も、高脂肪食によって誘発される体重増加を有意に減少させた(21%±3%)(図8B、オレンジ色の線)。 LSNts→TU経路の慢性活性化は、オープンフィールド試験において運動活動または不安関連行動に影響を与えなかった(図8D、E)。これらの結果に基づくと、LSNts ニューロンまたは LSNts→TU 回路の活性化は、高脂肪食誘発性肥満を軽減するのに十分です。

高脂肪食誘発性肥満モデルにおけるLSNtsニューロンの慢性化学遺伝学的活性化の実験デザインを示す概略図。 B 標準的な食事を与えられたコントロールマウス (灰色、n = 5)、高脂肪食を与えられたコントロールマウス (赤、n = 5)、高脂肪食を与えられた LSNts::hM3D マウス (緑、 n = 7) および LSNts→TU::hM3D マウスには、数週間にわたって高脂肪食 (オレンジ色、n = 9) が与えられました。二元配置分散分析 (F(3,22) = 13.74、P < 0.0001)。平均±標準誤差 C 標準食を与えた対照マウス (灰色、n = 5)、高脂肪食を与えた対照マウス (赤、n = 5)、高脂肪食を与えた LSNts::hM3D マウスの体重変化(緑色、n = 7) および LSNts→TU::hM3D マウスには 6 週間後に高脂肪食を与えました (オレンジ、n = 9)。二元配置分散分析 (F(3,22) = 11.4、P < 0.001) に続いて Tukey の事後検定。 *P < 0.05 および ***P < 0.001。平均±標準誤差 D 標準的な食事を与えられたコントロールマウス (灰色、n = 5)、高脂肪食を与えられたコントロールマウス (赤、n = 5)、高脂肪食を与えられた LSNts::hM3D マウスの平均運動活動 (緑色、n = 7) および LSNts→TU::hM3D マウスには高脂肪食を与えました (オレンジ、n = 9)。一元配置分散分析 (F(3,22) = 0.15、P > 0.05)。平均値 ± sem E 標準食を与えたコントロールマウス (灰色、n = 5)、高脂肪食を与えたコントロールマウス (赤、n = 5)、LSNts::hM3D マウスのオープンフィールドテストの中心での継続時間高脂肪食 (緑色、n = 7) および高脂肪食を与えた LSNts→TU::hM3D マウス (オレンジ、n = 9)。一元配置分散分析 (F(3,22) = 1.19、P > 0.05)。平均値 ± sem F LSNts ニューロンが快楽的な摂食と体重を調節する分子機構と回路機構の作業モデル。

本研究では、快楽摂食の調節に重要な役割を果たすLSのニューロテンシン発現GABA作動性ニューロンのグループを同定した。 LSNts ニューロンをサイレンシングすると、TU への GABA 作動性投射によって媒介される快楽摂食が促進されました。 LSNts ニューロンの活性化は、SUM、AHN、および POA への投影によって媒介される全体的な食物消費を抑制しました。 SUM におけるニューロテンシンシグナル伝達は、摂食全体を抑制するのに十分です。恒常性回路を標的とする現行薬の望ましくない副作用を考慮すると、快楽摂食の調節に関与する正確な分子、細胞型、回路の同定は、より優れた抗肥満薬の開発に役立つ可能性がある。

LS は、ストレスや不安などのさまざまな生理学的プロセスに関与していると考えられています [16、29、30、31]。 LS には、多くの分子的に異なる細胞型が含まれています [32]。興味深い仮説は、異なる細胞タイプが異なる生理学的機能に寄与しているということです。 Crhr2 を発現する LS ニューロンのサブセット (LSCrhr2) は、持続的なストレス誘発性の不安行動を媒介することが示されています [16]。我々の結果は、不安ではなく快楽摂食の調節においてLSNtsニューロンが重要な役割を果たしていることを明らかにし、LSの異なるニューロンサブタイプが異なる生理学的プロセスを媒介するという仮説をさらに裏付けるものである。

LSNts ニューロンは、ニューロテンシンを発現する LS の GABA 作動性ニューロンのサブセットです。我々の結果は、LSNtsニューロンの短時間の光遺伝学的活性化が強力なピクロトキシン感受性の抑制性シナプス後電流を誘発するため、LSNtsニューロンがGABAを放出して下流の脳標的に作用することを示した。ニューロテンシンを発現するニューロンの化学遺伝学的活性化により、下流の脳領域へのニューロテンシンの放出が引き起こされます[33]。したがって、LSNts ニューロンは標準的な神経伝達物質 GABA とペプチドニューロテンシンの両方を放出します。 CRISPR/Cas9 媒介遺伝子ノックダウンを使用して、快楽摂食の調節における GABA とニューロテンシンのシグナル伝達の異なる役割を明らかにしました。 vGAT ノックダウンはおいしい食物の摂取を促進するが、通常の食事の摂取は促進しないため、基礎的な生理学的レベルでは、GABA シグナル伝達は快楽的な摂食を特異的に抑制しました。しかし、LSNtの化学遺伝学的活性化は、vGATノックダウンマウスにおける嗜好性食品と固形飼料の両方の摂取を依然として抑制しており、摂食全体の抑制にニューロテンシンシグナル伝達が関与していることが示唆された。 in situ ハイブリダイゼーション技術を使用して、LSNts ニューロンの下流投射標的の 1 つである SUM におけるニューロテンシン受容体 1 の発現を検出しました (図 7K)。さらに、SUMへのニューロテンシンの局所注入により、おいしい食べ物と通常の食事の両方の摂取が抑制されることを示し、摂食全体の抑制におけるLSNts→SUM経路のニューロテンシンシグナルの関与を示唆しました。

最近の研究では、LSのニューロテンシンニューロンが食欲抑制に関連していることが報告されました[31]。 LSNts ニューロンはストレスによって活性化され、LSNts の化学遺伝学的活性化は一般的な食物抑制につながったため、この研究はストレス誘発性食物抑制に寄与する LSNts ニューロンの重要な役割を示唆しました [31]。しかし、私たちの実験で観察された食欲抑制効果は、以下に説明する理由から、ストレスによる食物の抑制によるものである可能性は低いです。まず、我々の快楽摂食モデルでは、マウスは少なくとも 3 日間、おいしい食事に慣れさせられていました。したがって、ストレスの影響は最小限に抑えられたと考えられます。第二に、TeNTを介したLSNtのシナプスサイレンシングは、高脂肪食を与えたマウスの体重を増加させたが、通常の固形飼料を与えたマウスの体重には影響を及ぼさなかった。両方の動物は同じ条件下で飼育され、同様のストレスレベルを持っていたため、この違いはストレスによるものではありませんでした。むしろ、この結果は、LSNts ニューロンが生理学的条件下で快楽摂食を制限していることを示しています。第三に、in vivo の小型顕微鏡 Ca2+ イメージングを使用して、おいしい食べ物の自由摂取中に LSNts ニューロンの 31% が活性化される一方、ニューロンの 32% が抑制されることを観察しました。さらに、同じグループのLSNtsニューロンのストレス（フットショック）に対する反応も調べたところ、LSNtsニューロンの大部分（74％）がストレスによって活性化されることがわかりました（図S6I）。したがって、ストレスによる LSNts ニューロンの強力な活性化は、ニューロテンシンの放出を促進し、全体的な食物摂取を抑制する可能性が非常に高いです。 LSNts ニューロンはストレスと摂食抑制を関連付けている可能性がありますが、我々の研究により、ストレスのない環境における快楽摂食の調節における LSNts ニューロンの重要な役割が明らかになりました。さらに、我々の小型顕微鏡 Ca2+ イメージング実験により、これまでの文献では特徴づけられていなかった摂食中の LSNts ニューロンの不均一性が明らかになりました。

私たちの回路追跡実験により、LSNts ニューロンが POA、AHN、TU、SUM などの複数の下流ターゲットに投影していることが明らかになりました。 POA、AHN、およびSUMへの投射を活性化すると摂食全体が抑制されましたが、LSNts→TU回路の活性化はおいしい食物の摂取を特異的に抑制しました。これらの結果は、快楽摂食の調節における LSNts→TU 経路の独特の役割を示唆しています。興味深いことに、結節核の SST 陽性ニューロンは、環境状況に応じた非恒常性摂食、主に快楽摂食を媒介することが最近報告されています [8]。 SynaptoTagを介した順行性追跡により、LSNtsニューロンのシナプスボタンとTU内のSST陽性ニューロンの間の強力な接触が明らかになりました。したがって、もっともらしい仮説は、快楽摂食の抑制に対するLSNts→TU回路の効果は、TU内のSSTニューロンによって少なくとも部分的に媒介されるということである。

私たちのミニスコープ画像実験により、摂食中に活性化および抑制される LSNts ニューロンの 2 つの集団が明らかになりました。この発見は、ファイバー測光実験で観察された二相応答を説明します。阻害された LSNts 亜集団は、活性化された LSNts 亜集団よりも遅い応答潜時と広い応答窓を示しました。これら 2 つの LSNt 集団の時間動態の違いにより、集団レベルで二相反応が生じました。ニューロンの動態と摂動実験の我々の分析は、食物摂取に対する阻害された LSNts 部分集団の支配的な効果を示しています。我々の結果はまた、LSNts ニューロンの不均一性を明らかにし、生理学的プロセス中の個々のニューロン活動をモニタリングすることの重要性を強調しています。将来の重要な目標は、これらの活性化および阻害された LSNt 亜集団が異なる分子プロファイルを持っているかどうか、およびシナプス入力と投影パターンが異なるかどうかを判断することです。

要約すると、我々の結果は、快楽摂食と肥満の調節に重要な役割を果たす新規なLS回路を特定した。 LSNts ニューロンから TU への投射は、GABA シグナル伝達を介した快楽摂食を抑制しますが、LSNts ニューロンから POA、AHN、および SUM への投射は全体的な摂食を抑制します。 LSNts→SUM経路におけるニューロテンシンシグナルは、摂食全体を抑制するのに十分である(図8F)。これらの発見は、古典的な中脳辺縁系のドーパミン作動性報酬系を超えた快楽摂食の根底にある神経回路についての理解を広げ、食物のおいしさとその結果として生じる過剰な摂食に対する介入の開発に役立つだろう。

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この原稿に関して洞察力に富んだコメントを提供してくださった Erwin Neher 博士、Yu-Tian Wang 博士、Xiaoke Chen 博士、Lei Yuan 博士に感謝します。 CRISPR/Cas9 実験にご協力いただいた Minmin Luo 博士、Yang Dan 博士、Chenyan Ma 博士に感謝します。 Jian Zhang 博士、血圧測定にご協力いただきました。ミニスコープ画像実験にご協力いただいた Cheng Wang 博士と Zhen Zhang 博士。 Qingfeng Wu 博士と Si Li 氏には、in situ ハイブリダイゼーション実験にご協力いただきました。 Fan Yang 博士と Dashuang Gao 博士には代謝測定にご協力いただきました。この研究は、科学技術イノベーション 2030 - 主要プロジェクト (2021ZD0202103)、中国国家自然科学財団 (81922024、82171492 & 31900735)、深セン市科学技術イノベーション委員会 (RCJC20200714114556103、JCYJ2018) からの助成金によって支援されました。 0507182420114 & ZDSYS20190902093601675) 、バイオランド研究所のフロンティア研究プログラム（広州再生医療および健康広東研究所）（2018GZR110105006）、および広東省脳コネクトームおよび行動重点研究所（2017B030301017）。 ZL は、中国国家重点研究開発プログラム (2016YFD0400800) および中国国家自然科学財団 (11079019 & 31070616) からの助成金によって支援されました。

これらの著者は同様に貢献しました: Zijun Chen、Gaowei Chen。

深セン薬物中毒重点研究所、深セン神経可塑性研究所、脳認知・脳疾患研究所、深セン先端技術研究所、中国科学院。深セン・香港脳科学研究所・深セン基礎研究機関、深セン、518055、中国

Zijun Chen、Gaowei Chen、Jiafeng Zhong、Shishi Lai、Hua Xu、Xiaofei Deng、Fengling Li、Shanshan Lu、Kuikui Zhou、Yingjie Zhu

中国科学院大学、100049、北京、中国

Gaowei Chen、Jiafeng Zhong、Shanshan Lu、Xu Zhang、Yingjie Zhu

河南理工大学、河南省、450001、中国

シャオレイ・ジャン＆ジョンドン・リウ

上海科学技術大学、上海、200093、中国

ジャン・シャオレイ

中国科学院深セン先進技術院生命健康科学部、深セン、518055、中国

周クイクイ＆朱英傑

広東省知能科学技術研究所、横琴区、珠海、広東省、519031、中国

Changlin Li & Xu Zhang

中国医学科学院疼痛医学研究ユニット。 SIMR Joint Lab of Drug Innovation、上海先進研究所、中国科学院、上海、201210、中国

徐張

CAS Center for Excellence in Brain Science and Intelligence Technology、中国科学院、上海、200031、中国

朱英傑

CAS 脳コネクトームおよび操作の主要研究所、脳認知および脳疾患研究所 (BCBDI)、深セン先端技術研究所 (SIAT)、中国科学院、深セン、518055、中国

朱英傑

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YZがこの研究を発案した。 ZC、GC、YZ が実験を設計し、データを分析しました。 ZC は、JZ、SL、SJ の協力を得て、トレース、行動テスト、スライス生理学を実施しました。 GC は、SL、HX、FL、XD の支援を受けて、in situ ハイブリダイゼーション、ファイバー測光記録、およびミニスコープイメージング実験を実施しました。 YZ は ZC と GC からの情報をもとに原稿を書きました。 KZ、CL、ZL、XZ が原稿を修正しました。著者全員が原稿をレビューしました。

Yingjie Zhu への通信。

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Chen, Z.、Chen, G.、Zhong, J. 他外側中隔ニューロンから結節核への回路は、快楽摂食を制御します。モル精神医学 27、4843–4860 (2022)。 https://doi.org/10.1038/s41380-022-01742-0

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受信日: 2022 年 3 月 22 日

改訂日: 2022 年 8 月 8 日

受理日: 2022 年 8 月 10 日

公開日: 2022 年 8 月 26 日

発行日：2022年12月

DOI: https://doi.org/10.1038/s41380-022-01742-0

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