嗅内層6bニューロンから海馬への直接的な興奮性投射は、空間コーディングと記憶に寄与する

Nature Communications volume 13、記事番号: 4826 (2022) この記事を引用

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メトリクスの詳細

哺乳類の海馬形成 (HF) は、空間コーディング、学習、記憶などのいくつかの高次脳機能において重要な役割を果たしています。その単純な回路アーキテクチャは、多くの場合、嗅内皮質 (EC) の表層から発生した入力を処理し、その深層に送り返す三シナプスループとして見なされます。今回我々は、マウスECの6b層の興奮性ニューロンがHFを構成するすべてのサブ領域に投射し、CA1、視床、および前腕から入力を受け取ることを示す。さらに、それらの出力は、シナプス後ターゲットのプラトー状の電位を駆動できる、独特のゆっくりと減衰する興奮性シナプス後電流によって特徴付けられます。 EC-6b 経路の光遺伝学的阻害は CA1 錐体ニューロンの空間コーディングに影響を与えますが、細胞の切除は新しい空間記憶の獲得だけでなく、以前に獲得した空間記憶の劣化も妨げます。我々の結果は、成人の脳における皮質層6bニューロンの機能的役割の証拠を提供するものである。

海馬は、記憶プロセスと空間関連行動に必要な哺乳類の脳の皮質領域です1。古典的な形態学の研究に基づいて、海馬形成 (HF) の回路は、多くの場合、嗅内皮質 (EC) の 2 つの表層 2 および 3 で始まり、中継された後、深層 2、3 で終わるループとして見なされます。海馬の主要なサブ領域である歯状回 (DG)、CA3、CA1 を一方向に通過します4,5。この回路構造を考慮すると、EC 表層に対するさまざまな操作が海馬の主なニューロンの活動とダイナミクスにわずかな変化しか生じないことは驚くべきことです 6、7、8、9、10、11。したがって、代替シナプス経路の存在を考慮する必要があります。

私たちは最近、信頼性が高く効率的な狂犬病ベースの経シナプス逆行性標識技術を開発しました 12。これは、既存の技術を改善します 13,14。この技術を使用することにより、海馬は EC の第 2 層と第 3 層からだけでなく、その深層、特に第 612 層からも標準入力を受け取っていることがわかりました。第 6 層は EC の主要部分を構成しており、大規模な興奮性ニューロンの割合に応じて、この脳領域は海馬ネットワークの活動に大きな影響を与える可能性があります。現在まで、この層のニューロンは、もっぱらその特徴的な多形性樹状突起形態によって分類されてきました 2,3,15,16。この層には、グリッド細胞の活動を彷彿とさせる空間的に選択的な発火パターンを持つ細胞が収容されていることが示されていますが 17 、この細胞集団の詳細な分子的、解剖学的、生理学的、または機能的特徴付けは行われていません。

レイヤ 6 の機能を分析する際の主な困難は、その構成が複雑であることです。皮質層 6 は単一の均一な層であると考えられることが多いですが、層 6b のニューロン（層 718 とも呼ばれます）は、発生学的、遺伝学的、形態学的に層 6a のニューロンとは異なります 19,20。層 6b のニューロンは層 6a のニューロンよりもはるかに早く分化し、コンプレキシン 3 (Cplx3)、ニューレキソフィリン 4 (Nxph4)、結合組織増殖因子 (Ctgf) などのサブプレートニューロン (SPN) に特異的ないくつかのマーカーを発現します 21,22。 23. 一般に、SPN は一過性の集団であると考えられています 24,25 が、SPN の持続的な部分が存在することが証明されています 22,26。特に、嗅内層 6 は層 6a28 よりもむしろ皮質層 6b27 に類似しており、多くの場合、サブプレートの残存物を表すと考えられる薄い細胞層と連続しているように見えます 18、24、26。これらの結果は、第 6b 層ニューロンが皮質発達における機能を超えて、成人の海馬の回路機能を調節している可能性を提起します。ただし、この仮説は直接検証されていません。

海馬へのEC深層入力の接続性とネットワーク機能を研究するために、狂犬病ウイルスに基づく経シナプス標識、分子特性評価、電気生理学、光遺伝学、および行動解析を組み合わせました。私たちは、成人の脳では、EC-6b ニューロンが海馬の主ニューロンと単シナプス的に接続されており、単一ニューロンから行動レベルに至るまで、海馬のネットワーク活動に驚くほど強力な影響を与えていることを発見しました。

EC-6ニューロンのより良い分子特性を達成するために、最初にいくつかのニューロンマーカーの発現を調べました（補足図1a〜c）。この層は、Ntsr1などの新皮質層6aの既知のマーカーを発現していませんが、Cplx3、Nxph4、Ctgf21、22、23などのSPNの既知のバイオマーカーが豊富であることがわかりました（補足図1a〜c）。我々は、単一細胞 RNA 配列データベース 32 と蛍光 in-situ ハイブリダイゼーション (FISH) を使用して、成人後皮質において、これらの特徴的な SPN 遺伝子が、皮質層内で両方とも固有の興奮性ニューロンの異なる集団に対する強力な選択マーカーであることを発見しました 6クラスター、および皮質プレート全体内（補足図1d–h）。これらの観察と一致して、CPLX3 の免疫標識は、層 6b またはサブプレート (白質の上の 50 μm 幅のバンドとして定義される 22) と呼ばれる最も深い皮質層の細胞体で強いシグナルを生成しましたが、皮質層および海馬層に沿っても強いシグナルを生成しました 1。、すなわち、分子層（SM）では、少数のCPLX3 +細胞体のみが検出できました（図1aおよび補足図2aおよびb）。

CPLX3およびDAPIで染色した代表的な水平切片（左）と皮質の拡大図（右）。 b VGluT1 (左上) または VGAT (左下) のいずれかと並んで CPLX3 について染色された、LEC-1 からの代表的な STED 画像。拡大されたインサートは、各画像の右側、対応するマスクの上に表示され、各マーカーの共局在化の計算を示しています。 c (a) の緑色の破線の四角で示されたフィールドから取得された STED 画像を使用したシナプス密度の分析。ここでは、シナプス密度を信号領域と総画像領域の比として計算しました。 d 全 VGluT1 または VGAT 信号領域の相対的な eCPLX3 および iCPLX3 信号密度。 e CA1へのretAAVの片側注入により、CA3錐体ニューロンの豊富な交連軸索を利用して、逆行性標識のための対側CA3の遺伝的標的化が可能になります（上の図）。 RetAAV-cre注射のための同側（左下）および対側（中央下）半球の背側海馬中央からの代表的な水平切片。拡大された挿入図 (右下) 内の二重標識ニューロンは、推定上のスターター細胞です。 f、g CA3特異的逆行性標識後の腹側海馬の代表的な水平切片は、ECの最深層にあるニューロンの集団（f）を明らかにし、サブプレート特異的マーカーCPLX3に対して陽性の免疫標識を示します（5から数えて72/78細胞）動物、g)。 h GAD1-EGFP マウスの CA3 ニューロンからの、CVS-N2c(deltaG)-tdTomato による逆行性標識後の層 6b の代表的な水平切片 (左)。右側のパネルのバーの上の数字は、調べた各領域ごとの合計 tdTomato+ 体細胞のうちの二重標識 tdTomato+/EGFP+ 体細胞の総数を示します (P = 1.2 × 10−9; 両側フィッシャーの直接確率検定)。。 i 海馬の急性切片 (左) と樹状突起部分の拡大 (右) から採取した 2 つのビオサイチン標識 CA3 投影 pSPN (マゼンタ)。実験は 12 個のセルで再現され、同じ結果が得られました。 j 自発的EPSCの代表的なトレース（上のトレース）と、-50 pA（青）、100 pA（赤）、および200 pA（黒、下のトレース）の電流注入後の膜電位。以下の概要プロットは、電流振幅の関数として点火周波数を示しています (N = 31 セル)。拡大された代表的な EPSC (上のトレース) およびレオベース電流での最初の AP (下のトレース) のスケールバーは、それぞれ 25 ms/20 pA および 2 ms/20 mV を示します。 c、dのNは、6匹の異なる動物からの個々の切片の数を表します。 c、d、j のデータは平均値および SEM として表示されます。

CPLX3 はシナプスタンパク質 33 であるため、SM に沿った CPLX3 免疫反応性は、持続性 SPN の集団から生じるシナプスの存在を示す可能性があると仮説を立てました。さまざまな海馬および海馬傍サブ領域から採取した SM の誘導放出枯渇 (STED) イメージングを使用して、これらの領域では、CPLX3 が小胞性グルタミン酸トランスポーター 1 (VGluT1) および小胞性 GABA トランスポーター (VGAT) と広範囲に共局在していることを確認できました。）、それぞれ。これらの興奮性または抑制性のCPLX3 +末端（eCPLX3 / iCPLX3）は、互いに同様の割合で検出されましたが、HFの異なるサブ領域全体ではさまざまな割合で検出されました（図1b、cおよび補足図2c、d）。 CA3 SMでは注目すべき例外が観察され、eCPLX3末端がすべてのグルタミン酸作動性末端のほぼ15%を占めたのに対し、iCPLX3末端はすべてのGABA作動性末端の5%未満でした。

これらの末端が EC-6b ニューロンから生じているかどうかをテストするために、最初に tdTomato cre レポーター株 Ai9 の対側 CA1 に cre を発現する逆行性輸送性アデノ随伴ウイルス (retAAV)34 を注入することにより、CA3 錐体ニューロンを経シナプス逆行性標識の対象として遺伝子的に標的にしました。 -リコンビナーゼ、およびcre依存性TVA-2A-N2cGカセットを発現するアデノ随伴ウイルス（AAV）を伴う同側CA3。両方の AAV の適用から 2 週間後に、EGFP12、14 を発現する envA シュードタイプの G 欠失 CVS-N2c 狂犬病ウイルスベクター (RVdGenvA-CVS-N2c) を注入すると、CA3 錐体ニューロンからの広範かつ特異的な逆行性標識が誘導されました (図1dおよび補足図3a、b)。以前の知識35と一致して、広範なEGFPシグナルが内側および外側EC（それぞれMECおよびLEC）の層2に沿って観察され、CPLX3 + EC-6bニューロンでも我々の予測と一致しています（図1e、f）。発達中の脳では、サブプレート層が興奮性投射ニューロンと抑制性投射ニューロンの両方を生成する可能性があるため 36、GAD1-EGFP マウスを使用して追加の逆行性標識実験を行ったところ、EC-6b からの投射ニューロンの大部分が GAD1 であることが判明しました。 -陰性（図1hおよび補足図3c、d）。 EC-6bのビオシチンで満たされたCA3投影ニューロンの細胞内電気生理学的記録とそれに続く画像化により、密に棘のある樹状突起の多形性樹状突起（図1i）、自発的興奮性シナプス後電流（EPSC）、および電流注入に応答した中程度のスパイク活動が明らかになりました（図1jおよび補足表1)。これらの観察は、ECの最深層のニューロンが皮質層6bと連続する持続性SPNであることを示唆し、海馬CA3のSMへの直接的な興奮性投射の存在を確認する。対照的に、我々が検出したiCPLX3末端は、局所Cplx3+ SM介在ニューロンから生じている可能性があり、以前に説明した層1神経膠様細胞の分子プロファイルと一致します37（補足図4a、d）。総合すると、これらの結果は、EC-6b ニューロンから海馬への直接的な興奮性シナプス接続の存在を示しています。

CA3 投影 EC-6b ニューロンの解剖学的範囲を評価し、他の CA3 投影皮質集団との相対的な割合を定量化するために、共焦点顕微鏡を使用して HF 全体を解剖し、光学的に透明にし、画像化しました。 CA3 (図 2a、b)。結果の分析により、CA3投影ニューロンがEC-6bの背腹軸全体に沿って見つかり、LECの反対側の腹極付近で実質的により高密度であることが明らかになりました（図2c）。

海馬構造を構成するさまざまなコンポーネントの 3D 概略図。 A、D、M はそれぞれ前方、背方、内側を示します。 b 図1eに示すように、CA3ニューロンからのretAAV支援標識後の無傷の透明な皮質海馬標本（赤-tdTomato、シアン-N2c-EGFP、左上）と、トレースした線に沿ったXY平面の投影（左）、下）と、Z 平面でのプレパレーションの注釈付き画像（右）。 c CA3からの逆行性標識後のECおよびHCにおけるN2c-EGFP標識ニューロンの分布の視覚的表現。 d、CA1特異的な逆行性標識スキーム（左上）およびHC（左下）およびEC（右）の代表的な共焦点画像。 e c と同じですが、CA1 からの逆行ラベルが付いています。 f DGC 固有の逆行性標識スキーム (左上) と HC (左下) および EC (右) の代表的な共焦点画像。 g c と同じですが、DG からの逆行ラベルが付いています。 h CA1 IN 特異的な逆行性標識スキーム (左上) および HC (左下) および EC (右) の代表的な共焦点画像。 i、cと同じですが、海馬介在ニューロンからの逆行性標識が対象です。 j CA3、CA1、およびDGからの逆行性標識後の皮質海馬サブ領域全体の標識分布。各領域の割合は、2 次ニューロンの総数の条件ごとに個別に計算されました。 k CA3、CA1、DG、および海馬介在ニューロンからの逆行性標識後の、EC内の投射ニューロンの総数のうちの嗅内SPNの割合。 l 各スターター集団の 2 次および 1 次ニューロンの数 (左) と、計算された 2 次ニューロンと 1 次ニューロンの比率の概要プロット (右)。すべての計算では、交連投射ニューロンの数を考慮して、CA3 および苔状細胞の数に 2 を掛けました。 DG の場合、n = 6、他のすべての条件の場合、n = 4 マウス。特に指定のない限り、スケールバーは 200 μm を表します。 a の画像は、Allen Institute の Brain Explorer 2™ を使用して取得されました。 jl のデータは平均値および SEM として示され、各実験について個別のデータポイントが示されます。

eCPLX3 末端は、低密度ではあるものの、他のすべての海馬サブ領域の SM でも観察されたため、CA1、DG、および海馬介在ニューロンからの逆行性標識を含めるようにこのアプローチを拡張しました。 CA1錐体ニューロンのシナプス前パートナーを同定するために、CaMKIIaプロモーター12の制御下にあるcre-off AAVカセットをKA1-creマウスのCA1領域に注射してこれらの細胞を標的とした。この領域では、creはCA3およびDG38で選択的に発現する（図2d）、したがって、近くのCA3およびほとんどのCA2ニューロンからの逆行性標識が防止されます（補足図5a、b）。これらの実験により、最近詳細に説明されている主要な EC-3 および EC-5a 入力に加えて 39 (補足図 5c、d)、CA1 ニューロンが背極からの実質的な入力も受け取っていることが明らかになりました。 EC-6bは、MECの反対側にあり（図2d、e、j）、CA3へのEC-6bの投影と同様に、主に興奮性ニューロンで構成されています（補足図6a）。

歯状顆粒細胞（DGC）のシナプス前パートナーを同定するために、cre依存性AAVをDGC特異的Prox1-cre株に注入しました（図2f）。この集団はEC-6bから均一に分布したがまばらな興奮性入力を受け取ったことがわかりました（図2f–jおよび補足図6b）。最後に、EC-6b 投影が興奮に加えてフィードフォワード阻害を動員する可能性があるかどうかを判断するために、海馬 IN からの RVdGenvA-CVS-N2c-tdTomato を使用して、AAV を介した Flp 依存性タンパク質の発現によって逆行性標識を実行しました。 IN 特異的 DLX5/6-FlpE 株の海馬にあるカセットは、EGFP Flp レポーター株と交配されました 12 (図 2h および補足図 6c)。逆行性標識細胞には、EC-6b のニューロンの非常にまばらな標識とともに、海馬および表層皮質層の主要なニューロンが含まれていました（図2h–jおよび補足図6d、e）。この結果は、EC-6b ニューロンが EC-2/3 ニューロンよりも少ないフィードフォワード阻害を動員するため、海馬錐体ニューロンに対する全体的な外因性興奮性ドライブへの相対的な寄与が増加する可能性があることを示唆しています。

これらの海馬集団のそれぞれに対するEC-6bからの興奮性入力の相対的な寄与を決定するために、各マウスについて、すべてのEC層にわたる総標識集団のうち6b層の逆行性標識ニューロンの割合を計算しました（図2k）。この比率は、図1cに示す相対的なeCPLX3 / VGluT1シナプス密度推定値を追跡することがわかりました。図1cで報告された比率と図2kの比率は両方とも、正味の皮質入力に対するEC-6b投影の寄与に対する独立した、しかし非常に類似した推定値を提供し、それによってこれらの結果にさらなる裏付けを与えました。この相互検証により、局所的な eCPLX3 シナプス密度の定量化を使用して、逆行性標識では簡単に分析できない領域へのこの投影の相対的な寄与を近似することができます。興奮性ニューロンの集団の2次/1次ニューロン比をさらに定量化すると、すべての条件でハイスループットの標識が確認されましたが、DGからの逆行性標識後にはより低い比率が観察されました（図2l）。少数の EC ニューロンから多数の DGC への変換40。これらの結果は、EC-6b 投射がすべての海馬亜集団を標的とし、CA1 および CA3 の興奮性ニューロンを優先していることを示しています。

我々の結果は、EC-6b 海馬投影の詳細な説明を提供します。ただし、これらの細胞がどのような種類の情報を中継しているかを理解するには、そのシナプス入力の機能的特徴付けを並行して行う必要があります。我々は、抗生物質トリメトプリム（TMP）の投与時に、Ctgf-2A-dgCreドライバーライン41、42が興奮性Cplx3+ EC-6bニューロンの誘導的遺伝的解剖を可能にするが、Cplx3+ EC層1 INまたは海馬SM INでは不可能であることを発見した（図3a）および補足の図7a〜c）。次に、これらのマウスを使用して、拡張された接続ネットワークを再構築するために、cre依存性AAVベクターとRVdGenvA-CVS-N2cベクターの組み合わせを介して、二重順行性および逆行性標識のEC-6bを標的にしました（図3bおよび補足）図7d、e)。

a Ai9 tdTomato レポーター系統と交雑した Ctgf-2A-dgCre マウスの代表的な水平切片は、皮質層 6b における Cplx3+ ニューロンの効率的な TMP 誘導性遺伝的解剖を示しています。 b サブプレート固有の二重順行性および逆行性標識のための AAV 注入スキームの図。 c、d 嗅内サブプレートからの逆行性標識とNeuNの免疫標識後の代表的な水平断面図（c）および代表的な冠状断面図（d）。皮質領域および皮質下領域への、および皮質下領域からの投影を示しています。 e CPLX3について免疫標識した代表的な水平断面図（左）と、PCP4について免疫標識した後のCA3-CA1移行領域およびECの深層の拡大図。 ld - ラミナ切開。 f 無傷および透明な皮質および脳幹組織から測定された、各調製物でカウントされたEGFP +ニューロンの総数と比較した、嗅内サブプレートに突き出ているすべての領域からのニューロン数を示す要約プロット（n = 6マウス）。 g、それぞれの総 NeuN 数と比較した、主要領域における NeuN+ + EGFP+ 核の標識密度 (n = 5 マウス)。 f、g のデータは、個々のデータ点 (白丸)、平均 (黒丸)、および SEM として表示されます。

tdTomato+ ニューロンからの軸索追跡により、以前に CPLX3 に対して免疫反応性であることが判明した HF 内の構造とは別に、この集団が外側中隔 (LS) 核および前視床核 (ATN) の層状領域にもまばらに投影していることが明らかになりました。 RVdGenvA-CVS-N2c-EGFPを併用した逆行性追跡により、内側中隔核（MS）およびブローカ対角帯（DBB）、ならびにATN（AD-前背側）を構成する視床核からEC-6bニューロンへの投射が明らかになりました。 ; AM - 前内側; AV - 前腹側）と再会核（Re）（図3d）。皮質板からは、帯状皮質 (Cg)、脾後皮質 (RSC)、および皮質扁桃体基底部 (CoA) に由来するまばらな投射が見られました。これらの領域はすべて、以前は拡張された海馬ネットワークと関連付けられていましたが、HFとの関連がほとんど注目されない前肢（Cla）の前後範囲全体からの顕著な投影も発見しました（図3c、d、図3c、d、図3c、d、図3c、d、 f、g)。 EC-6b ニューロンは、HF 内の特定の部分集団から広範な入力も受け取りました。本来の海馬からの興奮性入力はもっぱらCA1と海馬台から生じ、CA3層のオリエンスと放線板にある推定上の抑制性ニューロンの集団からもたらされる。 EC内からは、5a層がEC-6bへの主な入力源として出現し、他の皮質層からの入力はまばらであり、EC-3およびEC-5bニューロンで選択的に発現されることが判明したPCP4の標識によって区別された。、ただし EC-2 と EC-5a43 はそうではありません (図 3e–g)。

これまでに提示されたすべての証拠は、EC-6b ニューロンと海馬主ニューロンの間に構造的なシナプス結合が存在することを示しています。しかし、これらの接触は発達初期段階の構造的残存物にすぎず、成人の脳の機能的なシナプスを表していない可能性は依然としてあります。この可能性に対処するために、Ctgf-2A-dgCre系統と条件付きでChR2(H134R)-EYFPを発現するAi32マウスを交配することにより層6bに光遺伝学的アクチュエーターを発現させ、CA3bの錐体ニューロンからの光遺伝学的に誘導される応答を測定した(図1)。 4aおよび補足図8a〜c）。 CA3へのEC-6b投射の生理学的特性を他の既知の経路と比較するために、我々はまた、EC-2ニューロンおよびDGCにおいて特異的にアクチュエーターを発現させた。前者はDGからの逆行性標識によって達成され、EC-2の広範な標識が行われましたが、EC-6bのまばらな標識のみにつながりました（図4bおよび補足図8d–j）、後者はProx1-cre マウスの DG への AAV-EF1a-DIO-ChIEF-2A-dTomato 注射 (図 4c)。 EC-6b経路の刺激後にシナプス後反応が観察されましたが、これらはCA3への穿孔経路（PP）または苔状線維（MF）投影の反応とは著しく異なりました（図4d–i）。 EC-6b-CA3 EPSCのEPSCピーク振幅と開始までの潜時はPP-CA3 EPSCのものと同一でしたが（図4j、k）、20〜80％の立ち上がり時間、減衰時定数、および持続時間は大幅に遅かった、そして短期的なうつ病はほぼ絶対的でした（図4l–o）。同様に、EC-6b-CA3 興奮性シナプス後電位 (EPSP) は時間経過が遅く、海馬ニューロンにおける以前に記載されたプラトー電位に似ています 44 (図 4p)。光遺伝学的に誘発された電流と電位をさらに記録したところ、EPSC は負の保持電位 (-60 mV) では AMPAR および KAR アンタゴニスト 6-シアノ-7-ニトロキノキサリン-2,3-ジオン (CNQX) に対して感受性があるが、NMDAR が大きいことが確認されました。電流は正の保持電位 (+40 mV) の下でも観察できます。これは、これらの電流が主にグルタミン酸放出によって媒介され、遅い反応速度はCNQXによってブロックされるため、多シナプス活性の結果ではないという追加の確認を提供します（図4q〜rおよび補足図9a〜f）。総合すると、これらの結果は、EC-6b ニューロンが CA3 錐体ニューロンとの独特で強力なグルタミン酸作動性シナプス結合を確立していることを示しています。

a – c CA3bのニューロンからのシナプス後反応を記録しながら、特にEC-6b（a）、EC-2（b）、またはDG（c）における光遺伝学的アクチュエーター（黄色）の特異的発現後の急性海馬スライスの代表的な画像（赤紫色）。白い破線の円は光刺激の対象となる領域を示し、スケールバーは 200 μm を表します。 d – f 6b-CA3（d）、PP-CA3（e）、またはMFの5ms光パルスの10Hz列後の、光遺伝学的に誘発されたEPSCの代表的な個別（灰色）および平均化された（黒色）トレース。 -CA3 (f) 投影。 g–i 6b-CA3 (g)、PP-CA3 (h)、または MF-CA3 (i) 刺激に対する 10 個の重ね合わせた電圧応答。 j–o 各経路の EPSC 特性を比較する要約プロット: 最初の応答のピーク振幅 (j)、刺激開始から EPSC 開始までの潜時 (k)、20 ～ 80% の上昇時間 (l)、減衰時定数 (m)、半値での持続時間 (n)、および 100 ms の刺激間間隔でのペアパルス比 (o)。個々のデータポイントは白丸で示され、バーは各条件の平均値と SEM を示します。プロットの上の概略図は、それぞれに示されている測定された EPSC 特性を示しています。 p – r 単一の切断型APを持つプラトー状のEPSPを示す代表的な6b-CA3応答（p;灰色、個々のトレース;黒、平均）、EPSCは100μMガバジンおよび25μM CNQXの存在下で負の保持電位で記録されました（ q）およびEPSCは、100μMガバジン、25μM CNQX、および50μM D-AP5の存在下で正の保持電位で記録されました（r）。各条件からの測定値の数は凡例の括弧内に示されています (k を参照)。プロット j ～ o は個々のデータポイントを示し、平均値と SEM は垂直および水平の黒い線で示されます。両側マン・ホイットニー検定（ホルム・ボンフェローニ調整）を使用した P < 0.05 の統計的差異は、有意であるとみなされました。一重 (*)、二重アスタリスク (**)、三重アスタリスク (***) は、それぞれ P < 0.05、P < 0.01、および P < 0.001 を示します。

プラトー状のシナプス後電位を生成できる興奮性投射の存在は予測されていないが、同様の活動パターンが CA1 錐体ニューロンにおける新しい場所場の生成に十分であることが以前に示されており 44,45 、これは EC-6b 経路が機能する可能性があることを示唆している空間情報 (SI) 処理において重要な役割を果たします。この仮説を検証するために、Ctgf-2A-dgCreドライバーラインとArchT-EGFPが条件付きで発現するAi40レポーターマウスを交配することにより、層6bニューロンで光遺伝学的阻害剤ArchTを特異的に発現させました（図5a）。次に、CA1 SM の上に光ファイバーをこれらの動物に慢性的に移植し、CA1 錐体層の 6 つの独立して可動な四極管を移植しました（補足図 10a）。 EC-6b-CA1 シナプスを介した直接効果と間接的なネットワーク効果 (EC-6b–DG–CA3–CA1 および EC-6b–CA3–CA1) から、実験操作の最大の効果が期待される CA1 領域に焦点を当てました。溜まるかもしれない。次に、動物を正方形のアリーナに配置し、30 分間の慣れセッション (S1) の後、ランダムに割り当てられた 1 つの象限でのみ光阻害を活性化してさらに 30 分間探索を続けました (S2)。これに続いて 3 回目の 30 分間のセッションが行われ、その間も光阻害は適用されませんでした (S3) (図 5b)。その後の推定錐体細胞の SI スコアの分析により、光阻害セッション中に操作された四分円のみで光阻害が SI の急性低下を引き起こし、光阻害が解除されると大幅に回復したことが明らかになりました (ターゲット四分円: P = 1.02 × 10−23;アリーナの残りの部分: P = 0.01; 両側マン・ホイットニー検定、図 5c)。このSIの減少は、占有率や移動速度などの観察可能な行動相関によって説明できず、同様に、CA1錐体細胞層の興奮性ニューロンまたは抑制性ニューロンの基本的な発火特性の変化とは関連していませんでした（補足図1）。 10b–j)。すべての海馬投射ニューロンの中で、EC 層 6b のみが Ctgf を発現しました（補足図 8a-c）。これらの結果は、EC-6b ニューロンが空間コーディングを制御していることを示しています。

ArchT-EGFP (Ai40) cre レポーターマウスと交配した Ctgf-2A-dgCre の層 6b における ArchT-EGFP の特異的発現と光ファイバーの位置を示す代表的な傍矢状断面。 b 3 つの連続した露光セッションの代表的な位置プロット (上) と、S3 での空間情報スコアによってランク付けされた、12 の代表的なユニットの対応する発射レートマップ。各プロットの上の数字は、ピーク点火速度 (Hz) を示しています。 c 各曝露セッション（左）における、照明された四分円（緑色）内の CA1 錐体細胞の平均空間情報をアリーナの残りの部分（灰色）と比較して示した概要プロットと、S2-S2 間の SI の中央値変化を示す箱ひげ図ターゲット領域の内側と外側のセルの S1 および S3-S1 (右)。箱ひげ図の中心、箱の境界、およびひげは、それぞれ中央値、上位と下位の 25 パーセンタイル、および上位と下位の 10 パーセンタイルを表します。 4 匹の動物からの合計 184 単位が分析に含まれました。単一アスタリスク (*) および三重アスタリスク (***) は、それぞれ P < 0.05 および P < 0.001 を示します。 d Rosa(stop)DTAマウスと交配したCtgf-2A-dgCreの海馬の代表的な画像（CPLX3で免疫標識）、TMP投与なし（左上）またはTMP投与9日後（右上）のいずれかであり、以下から撮影した代表的なSTED画像。以下の CA3 SM は、各時点での VGluT1 と eCPLX3 の密度を示しています。 VGluT1 と eCPLX3/VGluT1 の両方の密度の変化を、TMP 投与後のさまざまな時点で CA1 および CA3 SM について定量化します。各点は個々の動物 (グループあたり n = 3 匹) を表し、線は各条件の平均を表します (下のプロット）。 e インテリケージにおける実験プロトコルの概略図。 f 各実験日における平均グループ誤り率の時間プロット。 TMP は実験 0 日目に投与されました (黒い矢印で示されています)。 g STED画像から計算されたCA3 SMの生存しているeCPLX3端末の密度と、最終的な新規位置の最終日に対応する実験8日目と9日目のTMPグループの各動物のエラー率との間の散布図( D) と慣れ親しんだ場所への復帰初日 (A*) です。片側スピアマンの順位相関係数 (rs) とその対応する P 値を以下に示し、破線の回帰線を各グループに示します。 (c、左) および f のデータは平均値として示され、画像上の SEM およびスケールバーは 200 μm を表します。

これらの発見に基づいて、私たちは、この新しいシナプス経路が空間記憶の形成と保持の媒介においても同様に重要である可能性があると仮説を立てました。この疑問に対処するために、Ctgf-2A-dgCreマウスとRosaStopDTAマウスを交配させ、他のすべての長距離興奮性海馬投射を温存しながら、成体脳のEC-6b集団の選択的条件付きアブレーションを可能にしました（図5dおよび補足）図 8a ～ c)。その後、二重トランスジェニック動物をインテリケージ環境 46 で共同飼育し、各動物が利用できる水の位置を個別に遠隔制御し、その探索行動を監視することができました。馴化期間の後、各動物に水に無制限にアクセスできる特定のポート（図5e;「A」）を割り当て、5日後、層6bの特異的切除を誘導するためにTMPを動物に注射しました。ビヒクル溶液を使用します。この操作の直後に、我々は各動物を異なる水ポートに割り当て、3 日間、異なる隅と側面に対称的に回転させました。動物を元のポートに再割り当てする前に、このプロセスを合計 3 回繰り返しました (図 5e、「B」、「C」、および「D」)。動物は操作前にその位置を学習しました (図 5e、「」)。 A*」）。 EC-6bでアブレーションされた動物が新しい報酬の場所を学習する能力が、アブレーションプロセスの速度にほぼ続く速度で損なわれることがわかりました（「D」対「A」）（図5d）。予想外なことに、これらのマウスは、操作の直前に学習した位置を忘れるという困難にも遭遇しました（「A*」対「A」）。

整列順位変換の三元配置分散分析により、セッションと実験日の有意な効果が明らかになり、グループ (TMP 対ビヒクル) とセッション (A、D、A*; P = 1.3 × 10−4) の間の非常に有意な相互作用がさらに実証されました。これは、細胞アブレーションが新規セッションとおなじみのセッションでの学習に有意ではあるが異なる影響を与えたことを示しています（図5e）。新しいセッション「D」とおなじみのセッション「A*」の両方で、EC-6b アブレーション動物は学習の低下を示しました（「D」：TMP、P = 0.036 対 Veh、P = 1.8 × 10−4;「A*」： TMP、P = 0.116 対 Veh、P = 2.2 × 10−4）。個々の動物における効果はさまざまであるため、動物の成績はアブレーションの程度と相関するのではないかという仮説を立てました。この仮説を検証するために、3 番目の新規ポートの最終日と慣れたポートに戻った後の最初の日に対応する、行動テストの 8 日目と 9 日目の個々のエラー率を、層 6b のアブレーションの程度に対してプロットしました。 CA3内の総VGluT1密度に対する残りのeCPLX3末端の密度によって測定される（図5g）。新しい空間記憶の獲得はeCPLX3密度と有意に相関しているのに対し、以前に獲得した記憶の保持については逆方向の傾向があることがわかりました（図5g; rs = −0.91、P = 3×10−5対rs = 0.46、P = 0.11)。したがって、最も重度の切除を受けた動物は、8 日目に最もパフォーマンスが悪く、9 日目に最もパフォーマンスが良かった動物であり、またその逆も同様でした。これらの結果は、新しい空間記憶の形成と古い空間記憶の保持の両方に EC-6b が関与していることを裏付けています。

私たちの結果は、皮質層6bの分子プロファイル21、22、23、形態学的プロファイル26、27、および電気生理学的プロファイル47と一致する最も深い嗅内層のニューロンが、特徴的な双方向接続パターンを示しながら、すべての海馬、およびおそらく海馬傍のサブ領域に投射していることを示しています。視床核との関係は、新生児の脳のSPNについて以前に報告されています26、48、49、50（図1〜3および補足図1、2）。したがって、複数の証拠は、我々が成人の脳で同定した海馬に投影する EC-6b ニューロンが、持続的な SPN 集団に対応することを示唆しています。これは、EC におけるそのような細胞の存在がこれまで報告されていなかっただけでなく、より深い層が海馬出力を選択的に処理し、再分配すると考えられていたため、予期せぬ発見でした 2,3。

SPN は、E11.5 ～ E12.529 の胚発生中に生成される最初のニューロンであり、細胞遊走、分化、皮質層の配線など、皮質発生に関連するさまざまなプロセスにおいて重要な役割を果たしていることが広く受け入れられています 24 、51、52、53。この提案された機能と一致して、SPN は皮質形成が完了した直後に、おそらくプログラムされた細胞死によって死滅すると広く考えられています 24,25,54。しかし、SPN の部分集団、特に Cplx3 および Ctgf を発現する部分集団が成人期まで存続するという証拠が蓄積されており 18,22,26,55 、我々の結果はこれらの以前の発見を裏付け、拡張するものである。成人における皮質発達に対する SPN の寄与と回路ダイナミクスに対する層 6b の寄与は相互に排他的ではない可能性があり、将来的に 2 つのプロセス間の相互作用の可能性を調べることは興味深いでしょう。

Santiago Ramón y Cajal による古典的な研究以来、EC 海馬回路は、主要な回路要素が直線的に接続された 3 シナプスループとして見られることがよくあります。小規模な追加は行われましたが、基本的な接続スキームは変更されていません5。私たちの結果は、この十分に確立された回路における新しい接続を特定しました。 EC-6b ニューロンの数は EC-2/3 ニューロンよりもはるかに少ないですが、独特の機能的および構造的特性が収束して、これらのニューロンにその数に不釣り合いな影響力を与えます。まず、EPSCは遅い減衰と絶対的なシナプス抑制を示し、シナプス後標的細胞でプラトー状のEPSPを引き起こします。その開始は、特定のバーストにおける最初のスパイクイベントにタイミングが合わせられています（図4d、p）。第二に、EC-6bニューロンは、複数のソース、特に中央の高度に相互接続された皮質ハブである前蓋から収束入力を受け取り（図3）、HFを構成するすべてのサブ領域をターゲットとします（図1d）。最後に、発達中の皮質で観察される化学シナプスと電気シナプスの両方によって媒介される SPN 間の高度な相互接続性 53,58,59 は成人期まで持続し、相互接続された少数の SPN が皮質海馬サブ領域全体で活動を同期できるようにする可能性があります。総合すると、これらのユニークな特性は、行動におけるこれらのニューロンの強力な役割を説明し、皮質板全体にわたって均一に重要な機能を示唆している可能性があります。

EC-6b-CA3 EPSC のゆっくりとした減衰は、いくつかのメカニズムで説明される可能性があります。グルタミン酸受容体の動態が時間経過の遅さに寄与している可能性はあるが、同じ細胞型の遠位樹状突起で終わる EC-2 と EC-6b の入力の動態が異なるため、この可能性に反対する可能性がある。あるいは、非同期送信機のリリース、送信機のスピルオーバー、および大量の送信が役割を果たす可能性もあります。 EC-6b ニューロンが、特にシナプス事象の遅い時間経過 60 と、他の皮質細胞タイプでは発現されないシナプスタンパク質 CPLX3 の発現に関して、GABA 作動性 Ndnf+ 神経膠細胞様細胞 37 と類似点を示すことは興味深いことです (補足図4)。 2 種類のシナプスを単一レベルで比較するには、さらなる研究が必要です。

我々の結果は、EC-6bが海馬における空間コーディングと記憶形成に寄与していることを示唆しています。深部EC-6bニューロンの急性光遺伝学的サイレンシングは、CA1錐体ニューロンのSIの急激な減少を引き起こしました（図5a〜c）が、平均発火頻度の減少は最小限でした（補足図10）。したがって、光遺伝学的阻害の効果は、まだSI6、7、8、9、10、11にわずかな変化しか生じていない表層ECニューロンの急性または慢性操作後に観察される効果とは異なります。さらに、この効果は、発火率の顕著な低下を引き起こすが、CA1 錐体ニューロンにおける SI の増加をもたらす CA3-CA1 投影の急性光遺伝学的阻害の効果とは異なります 61。第6b層ニューロンからの発散出力が海馬ネットワークにおけるスパイクのコヒーレンスに影響を及ぼし、遅いデルタ（0.5〜3 Hz）およびシータ（3〜8 Hz）周波数範囲における主要なニューロンの同期に寄与している可能性があります。このモデルによれば、場所特有の発火パターンは、弱いながらも高度に組織化されたネットワークの活性化の結果として発生し、海馬のすべてのサブ領域にまたがって安定化される可能性がある。 CA1では、EC-6bからCA3への投影の刺激後に観察されたようなプラトー電位が、場所フィールド44,45、さらに最近では連想記憶62の形成の根底にあることが示されており、この仮説にさらなる支持を提供している。 EC-6b からのマルチユニット記録では、細胞のサブセットが格子状の発火パターンを示すことが以前に示されました 17。したがって、海馬への層6bの接続は、海馬の場所場がEC-2グリッド細胞の活動に先立って、およびEC-2グリッド細胞の活動の非存在下で発生する可能性があるという以前の観察の説明を提供する可能性があります8、63、64。

空間記憶形成に対する EC-6b ニューロンの寄与を調査するために、私たちはインテリケージシステムを使用した実験を設計しました。これにより、ホームケージ内で、共同飼育された動物のコホートに対する水報酬の位置を同時にかつ差動的に制御できるようになります。しかも実験者の物理的な存在はありません。自然の生息地の状況をある程度模倣したこのデザインは、空間記憶に対する層 6b アブレーションの二重の効果を明らかにしました。アブレーションは、新しい報酬の位置を学習する能力を損なう一方、以前の位置を忘れる能力にも影響を及ぼしました。

EC-6b ニューロンを標的とするために使用された操作は、この層内の影響を受ける細胞の数を最大化するのに効率的であり、それにより、行動タスクにおける堅牢な効果を観察することができました。しかし、この操作は EC に特異的なものではなかったため、他の皮質領域の第 6b 層ニューロンの切除も関与していた可能性があります。運動障害や感覚障害は場所に依存せずに行動能力が低下するため、除外することはできますが、EC を超えたより複雑なネットワーク効果を除外することはできません。これらは前頭前皮質の活動の変化から生じる可能性があり、前頭前皮質は認知の柔軟性を必要とする空間課題に関与していることが以前に示されています65,66（ただし参考文献67も参照）。しかし、行動課題には主に EC-海馬軸が関与する主要な空間要素が含まれているため、最も簡潔な説明は、嗅内層 6b ニューロンがこれらの行動効果において重要な役割を果たしているということです。観察された行動効果が海馬形成の関与なしで前頭前皮質のみを必要とすることが示されるというありそうもないシナリオであっても、現在まで細胞には行動機能や認知機能が割り当てられていないため、私たちの発見は依然として関連性を保持するはずです任意の皮質領域の層6bの。

この双方向効果は逆説的に見えるかもしれませんが、記憶力の低下は記憶の符号化と同様に活発で適応的な記憶プロセスであり、忘れる能力の低下も記憶力の欠如であると考えられるべきであることが示唆されています68。これらの発見は、これら 2 つの相反するプロセスが関連しているだけでなく、海馬回路における活動の同期と非同期の両方が可能なニューロンの単一集団の活動パターンから生じているという興味深い可能性を提起します。

我々は、嗅内層 6b ニューロンが、空間コーディングや記憶などの成体げっ歯類の海馬の適切な機能の中心であると結論付けています。他の皮質領域の第 6b 層ニューロンも同様の機能を持っている可能性があり、複雑な脳全体のネットワーク計算における一般的な役割を示唆しています。サブプレート層は哺乳類の種全体で高度に保存されており、ヒトの脳で最も発達していると思われるため 69,70,71 、我々の発見はモデル生物を超えて外挿される可能性があります。今後の研究では、健康と病気における人間の脳の高次回路機能に対するレイヤー6bニューロンの寄与が特定されるでしょう。

HEK293-GT 細胞および BHK-eT 細胞は、以前に公開されたアプローチに基づいて RVdG-CVS-N2c 狂犬病ウイルスベクターをレスキュー、シュードタイピング、および増幅するために使用されました 12。簡単に説明すると、SAD B19 最適化糖タンパク質と最適化 T7 RNA ポリメラーゼを安定して発現する HEK293-GT 細胞を、ポリエチレンイミンを使用して SADB19 ヘルパープラスミド pTIT-N、pTIT-P、および pTIT-L とともに RVdG-CVS-N2c ベクタープラスミドでトランスフェクトしました。 (PEI)。培養中のすべての細胞が蛍光標識されると、通常はトランスフェクションから 5 ～ 6 日後、蛍光が最初に検出された時点から 1 ～ 2 日後に培地を回収し、濾過し、等分して、少量 (100 ～ 200 μl) を採取します。）を、ベクターのシュードタイピングと増幅を同時に行うために、envA 糖タンパク質と TVA 受容体を安定して発現する BHK-eT 細胞を含むディッシュに移しました。偽型ベクターを形質導入の 3 日目から開始して 3 日間毎日収集し、ウイルスをプールして 70,000 × g で 1.5 時間遠心分離しました。遠心分離後、培地を吸引し、ウイルスペレットを200μlのリン酸緩衝食塩水(PBS)、pH7.4に再懸濁し、等分して、使用するまで-80℃で保存した。偽型 RVdG-CVS-N2c 狂犬病ウイルスベクターの最終力価は、HEK293-TVA の連続形質導入を使用して決定され、以前に公開された式 72 を使用して計算されました。この研究で使用した RVdG-CVS-N2c プラスミドの完全なリストについては、補足表 2 を参照してください。

AAV 産生は、以前に公開されたプロトコールに基づいて HEK293T 細胞で実行されました 73。簡単に言うと、完全にコンフルエントな HEK293 細胞を、PEI を使用して、pAdenoHelper および AAV-dj RepCap プラスミドとともに AAV2 ベクタープラスミドでトランスフェクトしました。トランスフェクションの 36 時間後、細胞を回収し、ペレット化し、3 回の凍結融解サイクルを使用して溶解しました。溶解した細胞をベンゾナーゼヌクレアーゼ (Sigma-Aldrich) とともに 1 時間インキュベートし、その後破片をペレットにし、ウイルスを含む上清を収集し、0.22 μm フィルターに通しました。続いて、収集した上清を等量のヘパリン-アガロース (Sigma-Aldrich) と混合し、一定に撹拌しながら 4 °C で一晩維持しました。翌日、アガロース-ウイルス混合物をクロマトグラフィーカラムに移し、アガロースを沈降させた。次いで、上清を重力によってカラムから排出し、アガロース結合ウイルスをＰＢＳで１回洗浄し、次いで、０．５ＭＮａＣｌを補充したＰＢＳを使用して溶出した。次に、溶出したウイルスを再度濾過し、脱塩し、100 kDa 遠心フィルターを使用して濃縮し、小分けして使用するまで -80 °C で保存しました。この研究で使用した AAV プラスミドの完全なリストについては、補足表 2 を参照してください。

この研究で使用されたすべてのトランスジェニックマウス系統は、以前に特徴付けられています（補足表3）。すべての実験において、1 か月から 6 か月までの年齢範囲で、雄と雌のマウスを同量交換して使用しました。行動実験では、おそらく TMP の効果がより強いため、女性の方が TMP の効果がわずかに大きいことが認められましたが、この観察はさらに追求されませんでした。 C57BL/6 野生型およびトランスジェニックマウスの実験は、動物実験に関する施設、国、および欧州のガイドラインに厳密に従って実施され、それぞれオーストリアのヴィッセンシャフト・フォルシュング・アンド・ヴィルシャフト連邦およびビルドゥング・ヴィッセンシャフト・アンド・フォルシュング連邦の承認を受けました。 (A. ハスリンガー、ウィーン; BMWF-66.018/0010-WF/V/3b/2015; BMBWF-66.018/0008-WF/V/3b/2018)。

ウイルスベクターの in vivo 送達では、マウスをイソフルランで麻酔し、ブプレノルフィン 0.1 mg kg-1 を注射し、定位固定フレームに配置し、酸素中で気化させた 1 ～ 5% イソフルランを 1 l の固定流量で受け取り続けました。分−1。麻酔の深さを評価するために脚を引っ込める反射をテストし、反射が観察されない場合には、頭皮を切開して頭蓋骨を露出させた。次に、ブレグマの位置を特定し、その座標を前部-後部 (AP) および内側-外側 (ML) 座標の基準として使用し、注射部位の硬膜の表面を背腹部 (DV) 座標の基準として使用しました。私たちの実験では、次の AP/ML/DV 座標セット (mm 単位) を使用しました。 DG: -1.9/1.3/-1.9。 CA3: -1.9/±2.5/-2; CA1: -1.9/1.5/-1.2; 海馬 IN: -1.9/1.8/-1.6; EC: -4/3.5/-3。まず、AAV ベクターを PBS で 1:5 に希釈し、ハミルトンシリンジと 32G 針を使用して、0.3 μl の量、0.06 μl/分の速度で注射部位に送達しました。注射が完了した後、ウイルスを組織内に拡散させるために針をさらに 1 ～ 2 分間留置し、その後ゆっくりと引っ込めました。注射セッションの終わりに、頭皮を接着して戻し、マウスをホームケージに戻して回復させた。偽型狂犬病ウイルスベクターの注射は、TVA 受容体と狂犬病糖タンパク質を含む AAV ベクターの最初の注射の 2 ～ 3 週間後に行われました。シュードタイプの狂犬病ベクターを最初に最終濃度が約 2 ～ 5 × 108 TU ml-1 になるように希釈し、次に AAV と同じ方法で注射しました。 Ctgf-2A-dgCreトランスジェニック動物のProx1-creのDGまたはECへの狂犬病注射を除いて、他のすべての狂犬病ウイルス注射は、APが-0.2mm、MLが-0.2mmシフトされた。これは、KA1-cre および DLX5/6-Flp トランスジェニックにおける Cre リコンビナーゼ発現の完全な特異性の欠如により、最初の注射の針路に沿った非特異的標識を可能な限り回避するために行われました。線。

同定された逆行性標識細胞の電気生理学的記録は、CVS-N2c ベクターの注射後 5 ～ 7 日後に実行されました。操作された動物は、メデトミジン（0.5 mg kg-1）、ミダゾラム（5 mg kg-1）およびフェンタニル（0.05 mg kg-1）からなるMMF混合物を使用して麻酔され、87 mMを含む20 mlの氷冷解剖溶液で経心臓的に灌流されました。 NaCl、25 mM NaHCO3、2.5 mM KCl、1.25 mM NaH2PO4、10 mM D-グルコース、75 mM スクロース、0.5 mM CaCl2、および 7 mM MgCl2 (95% O2/5% CO2 中で pH 7.4、325 ～ 327 mOsm)。次に脳を取り出し、隣接する皮質組織とともに海馬を切り出し、組織を安定化するように設計された 4% アガロースで作られたプレキャスト型に配置しました。型を VT1200 ビブラトーム (Leica Microsystems) のチャンバーに移し、氷冷切片溶液の存在下で組織を 350 μm 厚のスライスに横方向に切片化しました。横方向の皮質海馬スライスを〜31℃で〜30分間回復させ、その後、実験の間室温（RT、22±1℃）に維持した。記録中、スライスは、125 mM NaCl、2.5 mM KCl、25 mM NaHCO3、1.25 mM NaH2PO4、25 mM D-グルコース、2 mM CaCl2、および 1 mM MgCl2 (95% O2/5% 中で pH 7.4) を含む記録溶液で灌流されました。 CO2、316 mOsm)、重力流を使用して約 1 ml min-1 の速度で。対象領域のニューロンには、125 mM グルコン酸 K、20 mM KCl、0.1 mM EGTA、10 mM ホスホクレアチン、2 mM MgCl2、2 mM Na2ATP、0.4 mM Na2GTP、10 mM HEPES (pH 調整済み) を含むプルパッチピペットを使用してパッチを適用しました。 KOH で 7.28 まで、約 300 mOsm)。 0.3% ビオシチンが記録のサブセットに追加されました。パッチされた細胞は、ニューロンの静止膜電位で電流クランプモードで維持されました。パッチを適用した細胞からのシグナルは、Axon Axopatch 200 A 増幅器 (Molecular Devices) を使用して取得し、CED Power 1401 アナログ-デジタルコンバーター (Cambridge Electronic Design) を使用してデジタル化しました。光遺伝学的刺激は、記録されたニューロンの上に配置された×63の対物レンズを通過させ、強度4.5 mW mm-2の青色フィルター付き白色LED（イリノイ州Prizmatix）を使用して送達されました。すべての記録では、持続時間 5 ms の光パルス 2 ～ 5 個が 10 Hz の周波数で送達され、刺激間の間隔は 20 秒でした。 AMPA および NMDA 受容体媒介電流の分離には、145 mM CsCl、10 mM HEPES、2 mM MgCl2、5 mM ホスホクレアチン、2 mM Na2ATP、0.3 mM Na2GTP、および 5 mM QX-314 で構成される内部 CsCl ベースの溶液を使用しました。 (KOH で pH 7.28 に調整、約 310 mOsm)、以下の薬理学的薬剤とともに: 100 μM ガバジン、25 μM CNQX、および 50 μM D-AP5 を記録のさまざまな段階で適用しました。各記録セッションの終わりに、電極をゆっくりと後退させてアウトサイドアウトパッチを形成した。続いて、スライスを記録チャンバーから取り出し、4% パラホルムアルデヒド (PFA) に浸し、さらに処理するまで 0.1 M リン酸緩衝液 (PB) に保管しました。その後の EPSC および膜特性の分析は、Stimfit (バージョン 0.15.8; https://github.com/neurodroid/stimfit)74 を使用して実行され、代表的なトレースは Igor Pro 6 (Wavemetrics、オレゴン州、米国) を使用して処理および視覚化されました。

画像化の目的で、RVdGenvA-CVS-N2c ベクターの注射後 5 ～ 7 日後に動物を屠殺しました。まず、前のセクションで説明したように動物を麻酔し、15 mlの0.1 M PB、続いて30 mlの4% PFAで経心臓的に灌流しました。灌流後、脳を取り出し、4% PFA 中に 4 °C で一晩保存し、その後 0.1 M PB に置き換えました。固定した脳を冠状面、傍矢状面、または横断面のいずれかで 100 μm の厚さに切片化し、0.1 M PB 中に 4 °C で保存しました。

形質導入組織の免疫組織化学的標識には、標準プロトコルを使用しました。まず、切片を PB で 10 分間 3 回洗浄しました。次に、切片を 10% 正常ヤギ血清 (NGS) および 0.3% Triton X-100 とともに室温で一定に撹拌しながら 1 時間インキュベートし、続いて CPLX3 に対するウサギ抗体 (Synaptic Systems、カタログ番号 122 302、1:500) とともにインキュベートしました。、5% NGS および 0.3% Triton X-100 を含む PB 中で、4 °C で一晩。洗浄後、スライスをアイソタイプ特異的二次抗体（Alexa Fluor 488 または 647 と結合したヤギ抗ウサギ）とともに、5% NGS および 0.3% Triton X-100 を含む PB 中で室温で 2 時間、一定に撹拌しながらインキュベートしました。もう一度洗浄した後、スライスをマウントし、Prolong Gold Antifade マウンタント (Thermo-Fisher Scientific、カタログ番号 P36930) に埋め込み、0.17 mm のカバースリップで密封しました。 VGLUT1 または VGAT による CPLX3 の二重標識にはモルモット抗体を使用し (Synaptic Systems、カタログ番号 135304 および 131004、それぞれ 1:200)、PCP4 および NeuN の標識にはウサギ抗体を使用しました (Novus Biologicals、カタログ番号) NBP1-80929 と NBP1-92693、それぞれ 1:500)。 STED 画像の取得には、抗ウサギ Star580 および抗モルモット Star635P 二次抗体 (Abberior、ドイツ、1:200) を使用しました。

ビオシチン (0.3%) で満たされたニューロンは、形態学的分析のために処理されました。ピペットを引き抜き、ピペットチップにアウトサイドアウトパッチが形成された後、スライスを 4% PFA を含む 0.1 M PB 溶液中で 4 °C で 12 ～ 24 時間固定しました。樹状突起の形態を再構築するために、固定スライスを Alexa-Fluor 647 結合ストレプダビジン (Invitrogen、カタログ番号 S32357: 1:200) および 5% NGS および 0.4% Triton X-100 で約 2 時間処理し、その後 3 回の洗浄サイクルを行いました。 PBで。次いで、染色された切片をスライド上に載せ、Mowiol (Sigma-Aldrich) に包埋し、0.17 mm のカバースリップで密封しました。

成体の野生型マウス (P60) を断頭して安楽死させ、脳をすぐに取り出し、冷 4% PFA で 4 時間固定し、さらに冷 30% スクロース溶液で 24 時間インキュベートしました。次に、脳を最適切断温度化合物 (OCT、Tissue-Tek) に包埋し、ドライアイスで凍結し、クライオスタット (Leica CM1950、Leica Biosystems) で 16 μm の切片にスライスしました。まず、切片を 4% PFA で 15 分間固定し、PBS で洗浄し、EtOH の上昇勾配 (25%、50%、75%、および 100%、各ステップで 5 分間、その後 15 分間乾燥) を使用して脱水しました。。次いで、製造業者のプロトコール７５（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）に従って、マウント前にＤＡＰＩを補充して、スライスを染色した。 Cplx3 および Ctgf (Ccn2 とも呼ばれる) を検出するための ISH プローブは、製造業者によって商業的に設計されました。

共焦点画像は、LSM 800 顕微鏡 (Zeiss) を使用して取得されました。 Andor Dragonfly スピニングディスク共焦点顕微鏡 (Andor technology) を使用して、透明な組織サンプルのサブセットを取得しました。この原稿に表示されているすべての代表的な共焦点画像は、4 ～ 12 枚の個別の画像の画像スタックの最大強度投影として示されています。無傷の組織のイメージングのために、海馬と隣接する EC を含む皮質プレートが形質導入された半球から除去され、その後 CUBIC 法を使用して除去されました 76。組織が半透明に見えたら、CUBIC 溶液に浸したままのチャンバーに取り付け、組織を平らにするためにわずかに押し、その上にカバースリップをかぶせました。次に、透明になった組織を CA3 側を上にして共焦点顕微鏡に移し、そこで一晩画像化しました。この原稿で使用されているすべての画像では、チャネル間のクロストークの可能性が注意深く監視され、信号のオーバーラップを分析する前に除外されました。

デュアルカラー STED 顕微鏡検査は、パルス励起と STED レーザーを備えた市販の倒立 STED 顕微鏡 (Abberior Instruments、ドイツ) で実行されました。励起には561 nmおよび640 nmのレーザーを使用し、誘導放出枯渇には775 nmのレーザーを使用しました。画像取得には、開口数 1.4 の油浸対物レンズ (UPLSAPO 100XO、オリンパス、日本) を使用しました。蛍光シグナルは、STAR 580 または STAR 635P 検出用にそれぞれ 605/50 nm および 685/70 nm バンドパスフィルターを備えたフォトンカウンティングアバランシェフォトダイオードを使用して、ピンホールサイズ 0.6 エアリーユニットの共焦点配置で収集されました。パルス繰り返し率は 40 MHz で、蛍光検出は時間ゲートで行われました。デュアルカラー STED 画像の取得に使用したイメージングパラメータは、ピクセル滞留時間 15 μs、励起レーザー出力 ~4.5 μW (561 nm) および ~3.8 μW (640 nm)、STED レーザー出力 ~75 mW でした。チャネルは、チャネルごとに 2 ラインの累積を伴うラインステップとして連続的に取得されました。 3 色画像の場合、滞留時間 25 μs、励起出力約 40 μW の 488 nm レーザーを使用し、回折限界解像度の 3 番目のカラーチャネルで同じ関心領域を記録しました。ここでは、1.0 エアリーユニットのピンホールサイズと 2 ラインの累積が使用されました。信号は、525/50 nm バンドパスフィルターを備えたフォトンカウンティングアバランシェフォトダイオードを使用して収集されました。すべての画像のピクセルサイズは 40 nm でした。倍率値は、対物レンズの後部開口部での倍率を指します。海馬SMからの画像は、MECからの投影に対応する領域、すなわち、DG、CA3、およびCA2の内側分子層、CA1の近位分子層、および海馬台の遠位SMから撮影された。

透明な組織標本中の細胞数の定量化、および薄切片における共局在の定量化は、Imaris ソフトウェア (Oxford Instruments) を使用し、共局在の最大距離を 2 μm に設定して実行しました。 STED 画像の端末共局在解析は、カスタム作成スクリプト (https://github.com/sommerc/coloco3surf) を介してフィジー (「フィジーは単なる ImageJ」) 77 を使用して実行されました。この目的のために、しきい値を手動で調整した後、個々のチャネルごとにマスクが作成され、0.1 µm2 未満の表面は破棄されました。次に、各チャネルの信号密度が、マスク内のピクセルの総数と画像内のピクセルの総数の間の比率として計算されました。次に、2 つのチャネルからの重なり合うピクセルのみを含む新しいマスクが作成され、0.1 µm2 未満の表面は再び破棄され、一次マスクで説明したように密度が計算されました。

EC-6bニューロンにおけるArchT-GFPの発現を促進するために、Ctgf-2A-dgCre//Ai40マウスにTMP 150 mg kg-1を投与した。 Cre 誘導の 2 ～ 3 日後、イソフルラン (0.5 ～ 3%) を使用した深い麻酔下で、光ファイバー (コア直径 240 μm、NA 0.63、45° 円錐先端、ドーリックレンズ) を囲む 6 つの独立して可動な四極管を動物に移植しました。）、酸素（1〜2 l min−1）、およびブプレノルフィンの初回用量（0.1 mg kg−1）。四極管は、対応する 4 本の 12 μm タングステンワイヤ (ブチラールボンドコートを施した H-Formvar 絶縁体、California Fine Wire、カリフォルニア州グローバービーチ) から構成され、撚り合わせてから加熱して 1 つの束にまとめました。次に、チップを金メッキして、電極インピーダンスを 200 ～ 400 kΩ に下げました。手術中に、背側 CA1 の上の中心で開頭し、光ファイバーの先端を次の座標に移植しました:ブレグマから AP が -1.9 mm、ML が 1.6 mm、軟膜表面から 1.2 mm。四極管の先端は、最初はファイバーの先端から約 300 µm 上に配置されました。小脳の上に配置された 2 本のネジは、接地電極および参照電極として機能しました。追加の 2 本のステンレス鋼アンカーネジを使用して、マイクロドライブアセンブリを頭蓋骨に永久的に取り付けました。次に、パラフィンワックスでコーティングされた電極とマイクロドライブ装置に歯科用アクリルを塗布して、電極とマイクロドライブのアセンブリを包み込み、頭蓋骨内のネジに固定しました。 7 日間の回復期間の後、さらに 7 ～ 14 日間かけて四極管を毎日 50 ～ 150 μm ステップで CA1 領域に下げました。

細胞外データは、Intan RHD2000 評価システムおよび RHD2132 ヘッドステージ (Intan Technologies、カリフォルニア州、米国) と拡張バージョンの Ktan ソフトウェア (https://git.ist.ac.at/alois.schloegl/ktan) を使用して取得しました。ギット）。電気信号は 20 kHz でサンプリングされました。軌道は、ヘッドステージに取り付けられた 2 つの LED ライトを記録するビデオカメラ (FL-HC0614-2M; RICOH) で追跡され、Positrack ソフトウェア (https://github.com/kevin-allen/positrack) を使用して記録されました。スパイク抽出は、Mountainsort ソフトウェア 78 を実装することによって実行され、クラスターのクリーニングと改良にはカスタマイズされたソフトウェアが使用されました (https://github.com/igridchyn/lfp_online)。 ArchT 活性化のための緑色光は、2.5 mW mm-2 の 535 nm 緑色 LED (Prizmatix、IL) によって提供されました。光源は 0.48 NA 光ファイバーパッチコード (長さ 4.5 m、0.37 NA; Doric Lenses) に結合され、光がマイクロドライブに送信されました。光パルスは、コンピュータのパラレルポートを介して送信される TTL パルスによってトリガーされ、取得およびリアルタイム信号デコードソフトウェアを実行します。

データ分析のために、オープンフィールド環境は、それぞれ約 11.1 cm2 の等しいサイズの 15 × 15 の空間ビンに分割されました。位置追跡を使用して、動物が走行期間中に各空間ビンで費やした時間を計算することによって占有マップを生成しました（速度フィルター > 3 cm s-1）。次に、各空間ビンでセルが発射したスパイクの数をカウントし (これもスピードフィルター、>3 cm s-1)、占有時間で割りました。次に、レートマップを、標準偏差 1 ビンのガウスフィルターで平滑化しました。細胞の空間調整を測定するために、SI 測定値が計算されました 79。平均発火速度が 0.2 ～ 5 Hz の細胞のみがこの分析に含まれており、それによって推定上の錐体細胞を構成しています。さらに、安定して記録されたセルのみを確実に含めるためには、記録の最初と最後の 15 分間でセルの発火速度が少なくとも 0.2 Hz である必要がありました。各セルについて、レートマップは 4 つの等しいサイズの象限に分割されました。 SI は各象限について個別に計算され、明るい象限と非明るい象限の間の平均 SI が比較されました。次の定義を使用しました。

ここで、λx は空間ビン x における平均発火率、λ は環境全体にわたる平均発火率、P は占有率です79。

空間記憶に対する EC-6b ニューロンの寄与を評価するために、Ctgf-2A-dgCre マウスと RosaStopDTA マウスを交配して、サブプレート層の条件付きアブレーションを可能にしました。 RosaStopDTA マウスは、ジフテリア毒素の機能的な受容体を欠き、DTA には細胞膜の透過に必要な B サブユニットが欠如しているため、高度に特異的な細胞切除を誘導すると考えられています 80。生後 2 ～ 5 か月の二重トランスジェニック雄と雌の子に識別トランスポンダーを皮下移植し、1 週間後にインテリケージ環境 (TSE-Systems、ドイツ) に置きました。同性のマウスを最大 8 匹同時に、一定温度で飼育しました。、12時間の明周期と食物への随意アクセス。インテリケージに入った動物は5日間の馴化期間を経て、その間にすべての水ポートが利用可能となり、ポートに鼻を突っ込んだ瞬間から10秒の遅れを経て徐々に水ボトルへのアクセス方法を学習した。次に、各動物を 5 日間、各ケージ内にある 8 つの給水ポートの中からランダムに個別の給水ポートに割り当てました。この初期訓練期間の終了時に、動物をランダムに実験群に分け、実験群には 150 mg g-1 TMP を腹腔内投与し、対照群にはビヒクルを注射した。個々のエラー率は、24 時間の割り当てられたポートへのノーズポークと総ノーズポーク数の比率として測定されました。初期学習期間の最終日までにエラー率が 70% 未満に達しなかったマウスは、研究およびその後のすべての分析から除外されました。この操作の直後に、マウスを知性領域に戻し、3 日間、異なる水ポートを割り当てました。このような回転を３回行った後、すべて角と側面の両方に同一の変更を加え、動物を操作前に割り当てられていた元のウォーターポートに再度割り当て、さらに５日間追加した。この試験の終了時に、動物をケージから取り出し、PB中のPFA 4%を経心的に灌流し、CPLX3シナプス密度をさらに分析するために実験グループの脳を100μmで切片にしました。 TMP またはビヒクルの投与を除いて、動物との直接的または間接的な接触は行われませんでした。

すべての値は平均値として、誤差範囲は±SEMとして報告されました。統計的有意性は、ノンパラメトリックな片面クラスカル・ウォリス検定とその後の事後比較用の両面マン・ホイットニー検定、またはグループ比率の差の分析用のフィッシャーの直接確率検定を使用して検定されました。多重比較はホルム・ボンフェローニ補正を使用して調整されました。表現として使用された共焦点画像は、異なる動物に対して首尾よく複製され、同一の結果が得られた。インテリジェンスデータの分析では、セッション A、D、および A*81 を比較するために片面ノンパラメトリック整列順位変換三元配置分散分析テストを使用し、学習時間の経過を調べるために片面ノンパラメトリックフリードマンテストを使用しました。。計算は Microsoft Excel、Python、または R (バージョン 4.1.0) で実行されました。 p < 0.05 の統計的差異は有意であるとみなされました。図中、一重アスタリスク (*)、二重アスタリスク (**)、三重アスタリスク (***) はそれぞれ p < 0.05、p < 0.01、p < 0.001 を示し、原稿全体で使用されます。

研究デザインの詳細については、この記事にリンクされている Nature Research レポートの概要をご覧ください。

追加の画像データファイルは、合理的な要求に応じて対応する作成者から入手できます。ソースデータはこのペーパーに付属しています。

次のカスタムコードはこの研究用に生成され、次のリンクから入手できます: Coloco3surf — https://github.com/sommerc/coloco3surf。 Ktan — https://git.ist.ac.at/alois.schloegl/ktan.git 分析ルーチンは、合理的な要求に応じて対応する著者から入手できます。

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技術支援については F. Marr 氏と A. Schlögl 氏、原稿編集については E. Kralli-Beller 氏、画像解析スクリプトと顕微鏡サポート。単一ユニットデータの取得に関する技術支援については J. Wallenschus と D. Rangel Guerrero に、また単一ユニットクラスタリングについては I. Gridchyn に感謝の意を表します。最後に、議論をしてくれた B. Suter 氏、原稿の初期のバージョンを批判的に読んでくれた A. Saunders 氏、M. Jösch 氏、および H. Monyer 氏、清算プロトコルを共有してくれた C. Petersen 氏、効率的なサポートを提供してくれた ISTA の科学サービス部門にも感謝します。。このプロジェクトは、欧州連合の Horizon 2020 研究およびイノベーションプログラム (ERC 先行助成金 No 692692 を PJ に) に基づく欧州研究評議会 (ERC) と、Fond zur Förderung der Wissenschaftlichen Forschung (Z 312-B27、PJ および Wittgenstein 賞) によって資金提供されました。 JGD および PV の場合は I3600-B27)。

ヨアヴ・ベン・シモン

現在の住所: ウィーン医科大学神経生理学および薬理学部、ウィーン、オーストリア

キャロル・ケーファー

現在の住所: オランダ、ナイメーヘン、ラドボウド大学神経情報学部

オーストリア科学技術研究所 (ISTA)、クロスターノイブルク、オーストリア

ヨアヴ・ベン＝シモン、カロラ・ケーファー、フィリップ・ヴェリッキー、ヨゼフ・チチクスヴァリ、ヨハン・G・ダンツル、ピーター・ジョナス

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YB がプロジェクトを発案し、すべての実験を設計および実行し、YB と PV が JGD、KK のアドバイスを受けた STED 画像を取得し、YB が単体データを分析、JC が四極管記録用の設備と機器を提供、YB がデータを分析、YB と PJ が文書を作成しました。原稿を作成し、PJがプロジェクトを監修しました。著者全員が原稿を読んでコメントしました。

ヨアヴ・ベン・シモンへの通信。

著者らは競合する利害関係を宣言していません。

Nature Communications は、この研究の査読に貢献してくれた匿名の査読者に感謝します。査読者レポートが利用可能です。

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転載と許可

Ben-Simon, Y.、Kaefer, K.、Velicky, P. 他嗅内層 6b ニューロンから海馬への直接的な興奮性投射は、空間コーディングと記憶に寄与します。 Nat Commun 13、4826 (2022)。 https://doi.org/10.1038/s41467-022-32559-8

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受信日: 2022 年 4 月 11 日

受理日: 2022 年 8 月 3 日

公開日: 2022 年 8 月 16 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-022-32559-8

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