祖先の相互作用モジュールは、多様なミトコンドリア ATP シンターゼのオリゴマー化を促進する

Nature Communications volume 13、記事番号: 5989 (2022) この記事を引用

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ミトコンドリア ATP シンターゼは、効率的なエネルギー変換に不可欠な内膜湾曲を生成するオリゴマー集合体に配置された安定な二量体を形成します。今回我々は、ブルーセイトリパノソーマ由来の無傷のATPシンターゼ二量体の10の異なる回転状態における低温EM構造を報告する。このモデルは、9 つの系統特異的なサブユニットと 36 の脂質を含む 25 のサブユニットで構成されています。回転機構は末広がりの周囲の茎の影響を受け、より大きな構造の柔軟性をもたらします。内腔ハーフチャネル内のプロトン移動は、5 つの規則的な水分子の鎖を介して起こります。二量体化界面は、相互作用には重要ですが触媒活性には重要ではないサブユニット g によって形成されます。全体的な二量体の構造は真核生物によって異なりますが、サブユニット-gはサブユニット-eとともに、トリパノソーマと哺乳類の系統間で共有される祖先のオリゴマー化モチーフを形成していることがわかりました。したがって、我々のデータは、ATP シンターゼオリゴマー集合体を決定する構造成分としてサブユニット g/e モジュールを定義します。

ミトコンドリア ATP シンターゼは、可溶性 F1 サブ複合体と膜結合性 Fo サブ複合体から構成され、ダイマーとして存在し、オリゴマーに集合してクリステと呼ばれる内膜ひだの形成を誘導します。クリステは、真核細胞における酸化的リン酸化とエネルギー変換の部位です。 ATP シンターゼの二量体が単量体に解離すると、本来のクリステ構造が失われ、ミトコンドリアの機能が損なわれます 1,2。クリステの形態は、オピストコント類の平板状から繊毛虫類のコイル状管状、ミドリムシ類の円盤状まで、異なる系統の生物間で大きく異なりますが、ミトコンドリアATPシンターゼ二量体は膜の形状を維持するために普遍的に存在します4。

I 型から IV 型に分類されるさまざまなサイズと構造の ATP シンターゼ二量体が、最近高分解能クライオ EM 研究によって解明されました。哺乳動物の I 型 ATP シンターゼ二量体の構造では、単量体は弱く結合しているだけであり 5,6、酵母では膜サブユニットへの挿入によりより緊密な接触が形成されます 7。藻類ポリトメラ属の II 型 ATP シンターゼ二量体の構造は、二量体界面が門特異的な成分によって形成されていることを示しました8。繊毛虫テトラヒメナ・サーモフィラ由来のIII型ATP合成酵素二量体は、平行な回転軸を特徴とし、準化学量論的なサブユニットと複数の脂質が二量体界面で同定され、一方、単量体を結合する追加のタンパク質成分がマトリックス間に分布している、膜貫通領域、および内腔領域９．ユーグレナ・グラシリス由来の天然脂質を含むIV型ATP合成酵素の構造は、特定のタンパク質-脂質相互作用が二量体化に寄与していること、および中心茎と末梢茎が互いに直接相互作用していることも示した10。最後に、ユニークなアピコンプレクサ ATP シンターゼは、約 7000 Å2 の埋没表面積に寄与する 11 の寄生虫特異的成分を介して二量体化し 11、列に集合する他のすべての ATP シンターゼとは異なり、湾曲した頂端膜領域で五角錐のより高次のオリゴマー状態で会合します。。利用可能な構造データを総合すると、オリゴマー化の多様性が示唆されていますが、これらの相互作用を媒介する共通の要素が存在するのか、それとも ATP シンターゼの二量体化が進化の過程で独立して複数回起こったのかは不明のままです 4。

キネトプラスチドの代表であり、睡眠病を引き起こす確立された医学的に重要なモデル生物であるブルーセイトリパノソーマの ATP シンターゼは、門特異的なサブユニットを含むピラミッド型の F1 ヘッドによって例証されるように、高度に分岐しています 12,13。二量体はカルジオリピンの欠如に敏感であり 14、円板状クリステの膜隆起を横切って伸びる短い左巻きらせんセグメントを形成します 15。好気性真核生物の中でも特異的に、T. ブルーセイの哺乳類の生活環段階では、ATP シンターゼの逆モードを利用し、この酵素をプロトンポンプとして使用して、ATP を犠牲にしてミトコンドリア膜電位を維持します 16,17。対照的に、寄生虫の昆虫段階では、酵素の ATP 生成順方向モードが使用されます 18,19。

コアサブユニットの保存、オリゴマー化の異なる性質、および構造仮説を生化学的に検証できることを考慮すると、T. ブルーセイ ATP シンターゼの構造と機能を研究することで、モノマーがどのように相互作用してモノマーを形成するかを理解するための欠けている進化的つながりが得られると考えました。生理学的二量体。

今回我々は、T. ブルーセイ ATP シンターゼ二量体の構造解析、機能解析、進化解析を組み合わせて、この疑問に取り組みます。

我々は、組換え天然タンパク質阻害剤TbIF120を用いたアフィニティークロマトグラフィーによって培養T. ブルーセイ前環状トリポマスチゴートからATPシンターゼ二量体を精製し、サンプルをクライオEM分析に供しました（補足図1および2）。マスクされた改良を使用して、膜領域、ローター、および周囲の茎のマップが取得されました。 T. ブルーセイ ATP シンターゼの立体構造空間を記述するために、10 の異なる回転基質状態を解析し、3.5 ～ 4.3 Å の分解能まで精密化しました。最後に、両方のモノマーが回転状態 1 にある粒子が選択され、ダイマーのコンセンサス構造が 3.2 Å の解像度まで精密化されました (補足表 1、補足図 2 および 3)。

動物や菌類に見られる二量体の広角構造とは異なり、T. ブルーセイ ATP シンターゼは 2 つの F1/c 環サブ複合体間の角度が 60° です。 T. ブルーセイ ATP シンターゼのモデルには、25 の異なるサブユニットすべてが含まれており、そのうち 9 つは系統特異的です (図 1a、補足図 4、および補足ムービー 1)。以前に提案された命名法 21、22、23 (補足表 2) に従ってサブユニットに名前を付けました。さらに、24のカルジオリピンを含む36の結合リン脂質を特定し、モデル化しました（補足図5）。精製中に使用される両方の界面活性剤、n-ドデシルβ-D-マルトシド（β-DDM）とグリコジオスゲニン（GDN）も膜領域の周辺で分解されます（補足図6）。

a 両方のモノマーが回転状態 1 にある複合モデルの正面図と側面図。それぞれ門特異的な p18 サブユニットの 3 つのコピーによって増強された 2 つの F1/c10 環複合体は、60°の角度で結合されています。膜結合 Fo 領域は独特の構造を示し、保存されたサブユニットと門特異的なサブユニットの両方で構成されています。 b cリングの10本鎖βバレル（灰色）とATPTB12（淡い青色）の内腔相互作用を示すFo領域の側面図。脂質で満たされた末梢の Fo 空洞が示されています。 c クライオ EM 密度を示す、末梢 Fo キャビティ内の結合脂質の拡大図。 d ピリミジンリボヌクレオシド三リン酸が結合した十量体C環の上面図。実験的には検出されなかったものの、UTPとして割り当てられました。マップ密度は透明な青色で示され、相互作用する残基が示されます。

触媒領域では、F1 はサブユニット p18 の 3 つのコピーによって増強され、それぞれがサブユニット α12、13 に結合します。我々の構造は、p18 が末梢茎への F1 の異常な結合に関与していることを示しています。膜領域には、中央のプロトン輸送サブユニット a の周囲に配置された 8 つの保存された Fo サブユニット (b、d、f、8、i/j、k、e、および g) が含まれます。我々は、それらのサブユニットを、対応する酵母との構造的類似性および一致するトポロジーに基づいて同定しました（図 2）。サブユニット-bの場合、単一の膜貫通ヘリックスが酵母由来のbH1とよく重なり、サブユニット-eおよび-gをFoに固定します（図2a、b）。酵母およびウシ ATP シンターゼ bH1 とサブユニット -e および -g の膜貫通ヘリックスは、我々の構造と同じように配置されており、膜ドメインの特徴的なくさびに寄与しています5。他の生物では末梢茎の中央部分を構成する長いヘリックス bH2 は、T. brucei には存在しません (図 2c)。私たちの構造には代替のサブユニット b24 は見つかりません。

a T. brucei サブユニット (色付き) と S. cerevisiae 構造 (灰色の透明) が重なった膜領域の上面図。緊密な構造の重ね合わせとトポロジーの一致により、トポロジーと位置の一致に基づいて保存されたサブユニットの割り当てが可能になりました。 b サブユニット-b、-e、-g とそれらの S. cerevisiae 対応物 PDB 6B2Z (S. cerevisiae ミトコンドリア ATP シンターゼ) の重ね合わせにより、それらの同一性が確認されます。 c T. brucei、E. gracilis PDB 6TDV (E. gracilis ミトコンドリア ATP シンターゼ、膜領域) 10 および S. cerevisiae PDB 6B2Z (S. cerevisiae ミトコンドリア ATP シンターゼ) 7 のサブユニット b および隣接するサブユニットの膜貫通ヘリックスの概略図ATP 合成酵素。 PC – ホスファチジルコリン。

膜領域には、主に門特異的なATPTB1、6、12およびATPEG3によって形成される周辺サブ複合体が含まれています（図1b）。それは膜固有の空洞によって保存されたコアから分離されており、そこでは9つの結合したカルジオリピンが分解され（図1c）、ATPTB12のC末端はc10リングの内腔βバレルと相互作用します。 E. gracilis10のATPシンターゼでも以前に報告されているβバレルは、c10リングから内腔まで約15Å伸びています（図1aおよび補足図7）。十量体 C リングの空洞には、他の ATP シンターゼ 5、6、7 で観察されるように、無秩序な脂質と一致する密度が含まれており、さらにマトリックス側近くの 10 個の Arg66c 残基がリガンド密度を調整しており、これはピリミジンリボヌクレオシド三リン酸と一致しています。 (図1d)。我々は、転写後RNA編集の基質であるアフリカのトリパノソーマのミトコンドリアRNA代謝においてウリジン三リン酸（UTP）が大きく必要とされること、およびgRNAおよびrRNAへのポリウリジン尾部の付加26,27のため、この密度をウリジン三リン酸（UTP）として割り当てます。また、シチジン三リン酸（CTP）の量が少ないことも原因です28。ヌクレオチド塩基は 2 つの Arg82c 残基の間に挿入されますが、三リン酸領域は別の 5 つの Arg82c 残基によって配位され、Tyr79δ と Asn76δ が非対称配位接触を提供します。哺乳類 5,6 および繊毛虫 9 の C リング内部のリン脂質に関する最近の報告を考えると、C リング内部のヌクレオチドの存在は驚くべきことであり、さまざまなリガンドが構造足場を提供できることが示されています。

トリパノソーマの末梢茎は、酵母や哺乳類の対応物と比べて著しく異なる構造を示します。オピストコント複合体では、末梢茎は長い bH2 の周囲に組織され、膜からマトリックス内に約 15 nm 伸び、F15,7 の上部で OSCP に付着します。対照的に、T. ブルーセイは標準的な bH2 を欠いており、代わりに分岐サブユニット d のヘリックス 5 ～ 7 と拡張サブユニット 8 の C 末端ヘリックスが、末梢茎の頂端部分にある OSCP の C 末端延長部分に結合します。 (図3a)。 OSCPとサブユニット-dおよび-8の間の相互作用は、可溶性ATPTB3およびATPTB4によって安定化されます。末梢茎はサブユニット 8 の膜貫通ヘリックスによって膜サブ複合体に根を下ろし、サブユニット d のヘリックス 8 ～ 11 によってマトリックス側で包まれています。 F1の上部にある標準的な接触とは別に、末梢茎は、ユーグレノゾア特有のOSCPのC末端延長部を介してF1に結合しており、OSCPには、F1に結合したp18とサブユニットの間に伸びる無秩序なリンカーと末端ヘリックスヘアピンが含まれています。周辺茎の -d および -8 (図 3a および補足ムービー 2、3)。 F1と末梢ストークとの別の相互作用は、サブユニット-βとサブユニット-dの積み重ねられたC末端ヘリックスの間で起こり（図3b）、後者は構造的にF1に属し、柔軟なリンカーを介して末梢ストークに接続されています。

N 末端 OSCP 伸長は永続的な中央茎の付着を提供し、一方、C 末端伸長は末梢末梢茎への門特異的な付着を提供します。 b サブユニット -β および -d の C 末端ヘリックスは、永久的な F1 結合を提供します。 c 回転状態 1 から 2 への遷移中の C リングのサブステップ。 d (c) に示す F1 動作に対応するステップ。 F1 はローターとともに状態 1e まで進んだ後、状態 2a に移行するときに逆方向に回転します。 e F1 の傾斜動作と周囲の茎の曲がりに対応します。

異常な周辺ストーク構造が回転機構に影響を与えるかどうかを評価するために、さまざまな回転状態を表す 10 のクラスを分析しました。 3 つの主要な状態 (1 ～ 3) は、静的 Fo に対するローターの 3 つの ~120° 回転ステップから生じます。すべてのクラスにおいて、F1 は同様の立体構造をとり、T. ブルーセイ F1-ATPase13 の結晶構造でも以前に観察された触媒滞留に対応します。中央の茎の約120°の回転に応じて、個々のαβ二量体の触媒界面の立体構造とヌクレオチド占有率は主要な状態間で異なり、ADPとATPがそれぞれ「緩い」および「密な」閉じた立体構造にあることが示されています。、および「開いた」立体構造の空のヌクレオチド結合部位。それぞれの主要な状態の 5 つのクラス (1a ～ 1e)、4 つのクラス (2a ～ 2d)、および 1 つのクラスを特定しました。回転状態１ａ、２ａ、３のロータ位置は、それぞれ１１７°、１３６°、１０７°ステップで対応付けられている。回転状態 1 (クラス 1a から 1e) の特定されたすべてのサブステップを通じて、ローターは約 33°回転します。これは、c10 リングの 1 つのサブユニット c の前進にほぼ対応します (図 3c)。ローターと一緒に回転している間、F1 ヘッドピースは遅れて、わずか 13° しか前進しません。次の 1e から 2a への移行中に、ローターは約 84°前進しますが、F1 ヘッドピースは反対方向に約 22°回転します (図 3d)。これにより、2 つのモーター間に逆方向のトルクが生成され、これはパワーストローク機構と一致します。この逆方向のトルクは、3 つの主要な回転状態遷移すべてで発生する可能性があります。しかし、それは主状態 1 でのみ観察されました。これは、おそらく十量体 C 環とα3β3 六量体間の対称性の不一致の結果として、残りの 2 つの状態よりも多くのサブステップで捕捉されたためです 29。状態 2 の 4 つのクラス内で、ローターは 23° 進み、F1 はクラス 1a で観察された位置近くに戻ります。この位置は、状態 3 の唯一観察されたクラスでも見られます。ステップサイズには小さな違いがありますが、これはこのメカニズムは、Polytomella ATP シンターゼにおける以前の観察と一致しています8。ただし、その大きくて硬い周辺ストークのため、ポリトメラATPシンターゼは主に回転サブステップを示しますが、トリパノソーマF1は回転状態1aおよび1bによって明らかにされる〜8°の傾斜運動も示します（図3eおよび補足ムービー2）。以前に報告された OSCP8 の N 末端ドメインと C 末端ドメイン間のヒンジ運動は、我々の構造では見出されず、その代わりに、F1/c10 環サブ複合体の構造変化は、末梢の頂端部分の 5° の屈曲によって適応されます。茎。 (図 3e および補足ムービー 2、3)。総合すると、構造データは、分岐した末梢茎の付着が T. ブルーセイ ATP シンターゼに大きな立体構造の柔軟性を与えることを示しています。

プロトン移動のメカニズムには、サブユニット c の E102 の連続的なプロトン化、リン脂質二重層に露出した中和された E102c による c10 リングの回転、および膜の反対側でのプロトンの放出が含まれます。プロトンの結合および放出の部位は、サブユニット-aの水平ヘリックスH5によって寄与される保存されたR146によって分離されており、水性ハーフチャネルによってクリステ内腔およびミトコンドリアマトリックスからアクセス可能です（図4a）。 R146と隣接するN209は一緒になって、ヘリックスH5とH6の間の一対の水分子を調整します（図4b）。同様の調整が Polytomella ATP シンターゼでも観察されています 8。水の配位により、R146 は相互作用すると考えられている C 環に向かって伸びる回転異性体に制限される可能性があります。

マトリックス (オレンジ) チャネルと内腔 (水色) チャネルを備えたサブユニット-a (緑色)、および規則正しいホスファチジルコリン (PC1; 青色)。 c10 リングの E102 を灰色で示します。 b ヘリックス H5-6a の間で 2 つの水分子を調整する、高度に保存された R146a と N209a の拡大図。 c プロトン経路（水色）とホスファチジルコリンを閉じ込めた内腔チャネル（青色）の側面図。 d 内腔チャネル内の秩序立った水分子の鎖。 W1 ～ W5 (赤) 間の距離は、それぞれ 5.2、3.9、7.3、4.8 Å です。 e 秩序ある水は H155a まで伸びており、これがプロトンの D202a への移動を媒介している可能性があります。

私たちの構造では、2.55 Åの局所分解能を示す内腔ハーフチャネル（補足図3）は、5つの順序付けられた水分子の鎖（W1〜W5;図）で終わる、分解された水密度のネットワークで満たされています。 .4c–e)。水流路における秩序立った水分子の存在は、水分子の長距離拡散を必要としないグロッタス型のプロトン移動機構と一致している5。ただし、観察された水分子間の距離によっては直接水素結合するには大きすぎるため、プロトン移動には配位水分子と無秩序水分子の両方が関与する可能性があります。最後に分解された水 (W1) と、プロトンを c 環に移動させると考えられる保存された残基である D202a との間の 7 Å の距離は、直接プロトン移動するには長すぎます。代わりに、隣接する H155a を介して発生する可能性があります。したがって、私たちの構造は、プロトン輸送に関与する個々の要素を分解します（図4d、e）。

哺乳類 5,6 およびアピコンプレックス 11 ATP シンターゼの内腔プロトンハーフチャネルは、bH2 の膜貫通部分によって裏打ちされていますが、これは T. ブルーセイには存在しません。代わりに、bH2 の位置は、構造内の完全に規則正しいホスファチジルコリンによって占められています (PC1、図 4a、c)。したがって、結合した脂質がプロトン経路内のタンパク質要素と置き換わります。

保存された Fo サブユニットのセットを共有しているにもかかわらず、T. ブルーセイ ATP シンターゼ二量体は、以前に決定された構造と比較して著しく異なる二量体構造を示します。第一に、その二量体化界面 3600 Å2 は、E. gracilis タイプ IV (10,000 Å2) および T. サーモフィラ III 型 ATP シンターゼ (16,000 Å2) よりも小さいです。第二に、哺乳類や真菌の ATP シンターゼでは、周囲のストークが 2 つの回転軸によって定義される平面内に伸びますが、本発明の構造では、周囲のストークが平面の反対側で横方向にオフセットされるようにモノマーが回転します。回転したモノマーのため、この構造は特定の二量体化界面に関連付けられており、2つのサブユニット-gコピーがC2対称軸上で同型的に相互作用します（図5aおよび補足ムービー1）。 H1-2gの両方のコピーは、膜のマトリックス側に沿って水平に伸び、互いにクランプします（図5c、e）。これにより、サブユニット-eの会合膜貫通ヘリックスと、膜内のサブユニット-a'および内腔内のサブユニット-f'を介した隣接するモノマーとの接触の形成が促進され、それによって界面にさらに寄与します（図5b）。したがって、ATP シンターゼ二量体はサブユニット e/g モジュールを介して組み立てられます。サブユニットeヘリックスのC末端部分は、cリングの10本鎖βバレルに向かって内腔内に伸びています（補足図7a）。末端の23残基は、c環βバレルの界面活性剤プラグに接続する、分解能の低い密度で無秩序です（補足図7b）。これはウシの構造におけるサブユニット e の内腔 C 末端に似ており 5、C リングとの相互作用が保存されていることを示しています。哺乳類では、カルシウム曝露時のサブユニットeの収縮により脂質プラグが引き抜かれ、Cリングの分解が誘導され、これにより透過性遷移孔（PTP）の開口が引き起こされるというメカニズムが提案されている6。

a 二量体化サブユニットを着色した側面図。二量体界面は、膜内のサブユニットaと内腔内のサブユニットfに接触するbサブユニットe'、結合した脂質とサブ複合体を形成する両方のモノマーからのcサブユニットeおよびgによって構成されます。 d サブユニット-g および -e はトリパノソーム (IV 型) ATP シンターゼ二量体で二量体化モチーフを形成し (この研究)、同じ構造要素がブタ ATP シンターゼ四量体でオリゴマー化モチーフを形成します。ブタの構造における擬似二量体（すなわち、隣接する二量体からの対角線にある2つの単量体）とトリパノソーマ二量体の構造類似性は、I型およびIV型ATPシンターゼ二量体が共通の祖先からの分岐を通じて進化したことを示唆しています。 e 二量体サブユニット-e/g構造は、Sus scrofa PDB 6ZNA（S. scrofaミトコンドリアATPシンターゼ）およびT. brucei（この研究）で保存されており、膜貫通ヘリックスの相互作用を媒介する保存されたGXXXGモチーフ（オレンジ）を含んでいます。 f 短いオリゴマーのサブトモグラム平均に当てはめた ATP シンターゼ二量体のモデル 15: マトリックス図、左。断面図、中央、内腔図、右。 EMD-3560 (T. ブルーセイミトコンドリア ATP シンターゼの in situ 構造)。

e/gモジュールは、マトリックスリーフレット内の4つの結合したカルジオリピンによって一緒に保持され、残りのFo領域に固定されています（図5c）。脂質の頭部基は、二量体界面の膜領域の中央空洞を埋めるアシル鎖を持つ極性および荷電残基によって配位されています（図5cおよび補足図5f）。カルジオリピンの結合は二次輸送体における二量体化に必須であることが以前に報告されており 30 、カルジオリピンシンターゼの枯渇により血流トリパノソーマの ATP シンターゼレベルが低下する 14 。

興味深いことに、酵母については、初期のブルーネイティブゲル電気泳動 31 およびサブトモグラム平均化研究 2 により、サブユニット g が二量体媒介の可能性があることが示唆されましたが、e/g モジュールは複合体の周囲で二量体長軸の両側に横方向に対向して位置しています。相互の間隔は約 8.5 nm です。 e/g モジュールは酵母 ATP シンターゼ二量体内で直接相互作用しないため、主要な二量体接触はサブユニット-a と -i/j7 によって形成されるのに対し、膜屈曲要素として機能すると提案されています。哺乳動物では、e/g モジュールは酵母と同じ位置を占め、四量体 5、6、32 の 2 つの対角線にある単量体間、および平行二量体間の相互作用を形成します 33。私たちの構造との比較は、二量体内トリパノソーマモジュールと二量体間哺乳類 e/g モジュールの全体的な構成が構造的に類似していることを示しています（図 5d）。さらに、キネトプラスト寄生虫と哺乳類は、サブユニット-e34および-gに保存されたGXXXGモチーフを共有しており（補足図8）、膜貫通ヘリックスの密接な相互作用を可能にし（図5e）、サブユニット相同性のさらなる証拠を提供します。しかし、哺乳類のATP合成酵素二量体はクリステの端に沿って列の長軸に対して垂直に配置されているのに対し、円盤状クリステの縁にあるT. ブルーセイ二量体は列軸に対して約45°傾いています15。したがって、e / gモジュールは、両方の進化的に遠いグループの行で同等の位置を占めます（図5fおよび参考文献33）。

構造的洞察を検証するために、誘導性 RNA 干渉 (RNAi) によって個々の Fo サブユニットをノックダウンしました。すべての標的mRNAは、誘導の2日および4日後に元のレベルの5〜20％に低下しました（図6aおよび補足図9a）。変性電気泳動によって分離された全細胞溶解物のウェスタンブロット分析により、Fo サブユニットATPB1および-dのレベルの低下が明らかになり、Fo部分の完全性が他のFoサブユニットの存在に依存していることが示唆されました（図6c、d）。 F1 および Fo サブユニットに対する抗体を用いたブルーネイティブポリアクリルアミドゲル電気泳動 (BN-PAGE) によって分離されたミトコンドリア複合体のイムノブロッティングにより、ほとんどのサブユニットの RNAi 誘導の 4 日後に、ATP シンターゼの二量体および単量体の大幅な減少またはほぼ完全な消失が明らかになりました (b 、e、f、i/j、k、8、ATPTB3、ATPTB4、ATPTB6、ATPTB11、ATPTB12、ATPEG3、およびATPEG4)、酵素の不安定性の増加またはそのアセンブリの欠陥が証明されています。 BN-PAGEで観察されたF1-ATPaseへの同時蓄積は、末梢茎または膜サブ複合体の破壊後も触媒部分が無傷のままであることを実証しました（図6b〜dおよび補足図9b）。

a グルコースの存在下 (黒色) または非存在下 (茶色) で増殖させた非誘導 (実線) およびテトラサイクリン誘導 (破線) RNAi 細胞株の増殖曲線。挿入図は、18S rRNA (黒色のバー) または β-チューブリン (白色のバー) のレベルに対して正規化した、誘導後指定日数 (DPI) におけるそれぞれの標的 mRNA の相対レベルを示しています。 b 示されたATPシンターゼサブユニットに対する抗体でプローブされたBN-PAGEによって分解された、示されたRNAi細胞株からのミトコンドリア溶解物の免疫ブロット（n = 2）。分子量（MW）マーカーの位置を示します。 c 示された抗体でプローブされた、示された RNAi 細胞株からの全細胞溶解物の免疫ブロット (n = 3)。 MWマーカーの位置を示します。 d (c) の免疫ブロットの 3 つの独立した複製の定量化。値は、ローディングコントロール Hsp70 のシグナルおよび非誘導細胞に対して正規化されました。プロットには、個々の値、平均、標準偏差 (SD; エラーバー) が表示されます。

他の標的とされたFoサブユニットとは対照的に、RNAiによるサブユニット-gの下方制御は、単量体の蓄積を伴う二量体複合体の特異的な損失をもたらした（図6b）。これは、それが二量体化には必要であるが、集合と結合には必要ではないことを示している。単量体 F1Fo ATP シンターゼユニットの安定性。薄い細胞切片の透過型電子顕微鏡検査により、サブユニット-gRNAi 細胞株における ATP シンターゼの単量体化が、サブユニット 8 のノックダウンによる単量体および二量体のほぼ完全な喪失と同じ効果をミトコンドリアの超微細構造に及ぼすことが明らかになりました。両方の細胞株は、Saccharomyces cerevisiae1のサブユニット-gまたは-eの欠失によって検出される構造を思い出させる丸い形状の外観を含む、クリステ数の減少と異常なクリステ形態を示しました（図7a、b）。これらの結果は、他の真核生物の対応物におけるオリゴマー化障害が報告されているように、トリパノソーム ATP シンターゼが円盤状クリステの縁で短い螺旋列に集合することをモノマー化が妨げていることを示しています 15。

a 非誘導または4日間誘導したRNAi細胞株の切片の透過型電子顕微鏡写真。各カテゴリで少なくとも 70 枚の顕微鏡写真が得られました。ミトコンドリア膜とクリステは、それぞれ青と赤の矢印でマークされています。上のパネルは、(b) で定量化されたミトコンドリアの不規則で細長い、丸い断面の例を示しています。スケールバー: 500 nm。 b 示された誘導（IND）または非誘導（NON）細胞株からの小胞あたりのクリステ数を、不規則で細長く丸いミトコンドリア断面で個別にカウントしました。ボックスとひげは、それぞれ 25 ～ 75 パーセンタイルと 5 ～ 95 パーセンタイルを示します。分析された断面の数がデータポイントごとに示されます。対応のない両側 t 検定、p 値がグラフに表示されます。 c サフラニンOによって測定された、非誘導またはRNAi誘導細胞株2および4 DPIのミトコンドリア膜分極能。黒と灰色の矢印は、それぞれATPとオリゴマイシンの添加を示します。 d 示された基質および阻害剤の存在下での、透過処理された非誘導細胞（0）またはRNAi誘導細胞2および4DPIにおけるATP産生。グラフは、n = 2 (サブユニット-8)、n = 3 (ATPTB4)、または n = 4 (サブユニット-g) の独立した実験の 2 つの技術的反復の個々の値と、その平均値 (バー) および SD (誤差バー) を示しています。テクニカルレプリケートの平均値。 Gly3P DL-グリセロールリン酸; KCN シアン化カリウム; CATRカルボキシアトラチロシド。

ミトコンドリア超微細構造が変化したにもかかわらず、サブユニット gRNAi 細胞は、RNAi 誘導後 3 日目から 4 日目にかけて着実に成長の鈍化を示した他のすべての RNAi 細胞株とは対照的に、非常に穏やかな成長表現型のみを示しました（図 7a および補足図 9a）。）。これは、Ｆ０サブユニットＡＴＰＴＢ１１９およびＦ１サブユニットαおよびｐ１８１２の切除後に観察された成長欠陥と一致する。したがって、サブユニット g の除去による ATP シンターゼの単量体化は、基質レベルのリン酸化による ATP 産生が酸化的リン酸化の低下を部分的に補う、グルコースに富んだ培地で培養されたトリパノソーマの適応度に対して無視できる程度の影響しかありませんでした 37。

透過処理された細胞におけるサフラニン O アッセイによるオリゴマイシン感受性 ATP 依存性ミトコンドリア膜分極の測定により、誘導サブユニット gRNAi 細胞における ATP シンターゼのプロトンポンピング活性はほとんど影響を受けないことが示され、単量体化酵素が触媒機能があることが実証されました。対照的に、サブユニット-8、ATPTB4、ATPTB11、およびATPTB1のRNAiの下方制御は、単量体および二量体のATPシンターゼ形態の両方の喪失と一致して、ミトコンドリア膜分極能力の大幅な低下をもたらしました（図7c）。したがって、同じサブユニットをノックダウンすると、酸化的リン酸化によるATPの産生ができなくなりました（図7d）。しかし、サブユニット g を除去すると、ATP 生成は部分的にのみ影響を受け、単量体化された ATP シンターゼが触媒活性を維持していることが確認されました。サブユニット gRNAi 細胞の ATP 産生の約 50% の低下は、クリステ形態の障害による酸化的リン酸化効率の低下に起因すると考えられます。実際、グルコースの非存在下で細胞を培養すると、酸化的リン酸化の必要性が強制され、サブユニット-gのノックダウンは、試験した他のすべてのサブユニットのノックダウンより1〜2日遅れたにもかかわらず、増殖停止をもたらしました（図6a）。データは、酸化的リン酸化が ATP の主な供給源である場合、二量体化が重要であることを示しています。

哺乳類の寄生虫 T. ブルーセイに由来するミトコンドリア ATP シンターゼ二量体の我々の構造は、膜形成、回転触媒作用、およびプロトン移動の機構についての新たな洞察を提供します。トリパノソーマが進化的に分岐したキネトプラスティダのグループに属していることを考慮すると、ATP シンターゼの二量体は他の二量体構造とは異なるいくつかの興味深い特徴を持っています。細菌および他のミトコンドリアの F 型 ATP シンターゼに見られるサブユニット b は、単一の膜貫通ヘリックス bH1 に高度に還元されているようです。他の生物では末梢茎の中央部分を構成し、内腔プロトンハーフチャネルの構成にも関与する長いbH2は、T. bruceiには完全に存在しない。興味深いことに、プロトンハーフチャネル内の bH2 の位置は、プロトン経路内のよく保存されたタンパク質性要素と置き換わる、完全に秩序化されたホスファチジルコリン分子によって占められています。しかし、E. gracilis のサブユニット b には標準的な bH2 が含まれているものの、bH110 が欠如しているため、この置換はすべての IV 型 ATP シンターゼに共通する性質ではありません。したがって、サブユニット-bはユーグレノゾアでは保存されていますが、T.ブルーセイとE.グラシリスの系統は、その異なる重複しない構造要素を保持していました（図2c）。 T. brucei における bH2 の欠如は、分岐したサブユニット d とサブユニット 8 が OSCP の C 末端伸長部に直接結合する末梢ストークの組成にも影響を及ぼし、これは再構築された末梢ストーク構造を示しています。末梢茎はいくつかの位置で F1 ヘッドピースと接触し、ATP シンターゼに大きな立体構造の柔軟性を与えます。

構造および機能データを使用して、多量体化に関与する ATP シンターゼの保存された構造要素も特定しました。特に、サブユニット g は二量体化に必要ですが、F1Fo モノマーの集合には必要ありません。単量体化酵素は触媒能力を持っていますが、二量体を形成できないため結晶構造に欠陥が生じ、その結果、酸化的リン酸化が損なわれ、増殖が停止します。ミトコンドリアATPシンターゼ二量体のクリステ形成特性は、酸化的リン酸化による十分なATP産生にとって重要ですが、グルコースの存在下ではサブユニットgRNAi細胞の増殖表現型が欠如していることからもわかるように、他のミトコンドリア機能にとっては重要ではありません。したがって、トリパノソーマのサブユニット g 枯渇株は、酵素の一次触媒機能とミトコンドリア特異的な膜形成活性の役割を評価するための実験ツールとなり、酸化的リン酸化における後者の重要性が強調されます。

私たちのデータと以前に公開された構造に基づいて、我々は、縦方向にはe/gモジュールによって、横方向には他のFoサブユニットによって接続された2列のATPシンターゼモノマーを備えた祖先状態を提案します。進化の過程で、隣接する ATP シンターゼ単量体単位の異なるペアが、個々の系統で安定な二量体を形成しました (図 8)。これにより、それぞれオリゴマー化または二量体化の動機として機能するサブユニット e/g モジュールを備えた、高度に分岐した I 型および IV 型 ATP シンターゼ二量体が生じました。トリパノソーマは深部に分岐した真核生物のスーパーグループ Discova に属しているため、提案された配置は真核生物の最後の共通祖先に存在していた可能性があります。サブユニット-gの配列類似性は低く、単一膜貫通ヘリックスに限定されていますが、我々は、オピストコンタとディスコバに加えて、他の真核生物のスーパーグループを代表するアーキプラスティダとアメーボゾアにもサブユニット-gの相同体を発見し、オリゴマー化における祖先の役割を裏付けています(補足図8)。総合すると、我々の分析により、著しく分岐した構造を示すミトコンドリアATP合成酵素は、オリゴマー化を促進する祖先の構造モジュールを共有していることが明らかになった。

I 型および IV 型 ATP シンターゼの進化の概略モデル。ミトコンドリア ATP シンターゼは、プロテオバクテリア起源の単量体複合体に由来します。ミトコンドリアの祖先では、サブユニット-e/gモジュールを含むミトコンドリア特異的サブユニットの獲得により、クリステ生合成の構造基盤であるATPシンターゼ二重列の集合が生じた。分岐を通じて、サブユニット-e/g モジュールがオリゴマー化 (I 型) または二量体化 (IV 型) モチーフとして機能する、異なる ATP シンターゼの構造が進化し、その結果、ミトコンドリア系統間に異なる列集合が形成されました。

T. ブルーセイ前環状株を、10% (v/v) ウシ胎児血清を補充した SDM-79 培地で培養しました。グルコースフリー条件での増殖曲線の場合、細胞は 10% 透析 FBS を含む SDM-80 培地で増殖させました。 RNAi細胞株を2.5μg/mlのフレオマイシンおよび1μg/mlのピューロマイシンの存在下で増殖させた。 ATP シンターゼ精製のために、ミトコンドリアを Lister 株 427 から単離しました。通常、1.5 × 1011 個の細胞を収集し、150 mM NaCl および 20 mM グルコースを含む 20 mM リン酸ナトリウム緩衝液 pH 7.9 で洗浄し、低張緩衝液 1 mM Tris-HCl に再懸濁しました。 pH 8.0、1 mM EDTA、40 ml ダウンスホモジナイザーで 10 ストロークにより破砕しました。スクロースを 0.25 M まで直ちに添加することで溶解を停止しました。粗ミトコンドリアをペレット化し (16,000 × g、4 °C で 15 分間)、20 mM Tris-HCl pH 8.0、250 mM スクロース、5 mM MgCl2、0.3 mM に再懸濁しました。氷上で60分後、1容量のSTE緩衝液（20mM Tris-HCl pH 8.0、250mMスクロース、2mM EDTA）を加え、ミトコンドリアをペレット化した（室温で15分間）。 16000 × g、4 °C)。ペレットを STE 中の 60% (v/v) Percoll に再懸濁し、SW28 ローター (Beckman) 用のポリカーボネートチューブ内の STE 中の 6 つの直線 10 ～ 35% Percoll 勾配にロードしました。勾配を 104000 × g、4 °C で 1 時間遠心分離しました。ミトコンドリア小胞を含む中間相 (チューブあたり 15 ～ 20 ml) を収集し、STE バッファーで 4 回洗浄し、ペレットを液体窒素中で瞬間冷凍し、-80 °C で保存しました。

RNAiによってATPシンターゼサブユニットを下方制御するために、それぞれ制限部位XhoI&KpnIおよびXbaI&BamHIで伸長したフォワードプライマーおよびリバースプライマーを使用して、個々の標的配列に対応するDNA断片をLister 427株ゲノムDNAからPCRによって増幅した(補足表3)。各断片を、制限酵素KpnI/BamHIおよびXhoI/XbaIをそれぞれ用いて、ハイグロマイシン耐性遺伝子をフレオマイシン耐性遺伝子に置換することによってpRPHYG-iSL（Sam Alsfordの提供）に由来するpAZ0055ベクターのマルチクローニングサイト1および2に挿入した。。得られたテトラサイクリン誘導性 T7 ポリメラーゼ駆動 RNAi カセットを含むコンストラクトを NotI で直線化し、T7 ポリメラーゼ発現用の SmOx コンストラクトとテトラサイクリンリプレッサー 38 を β チューブリン遺伝子座に組み込むことにより、Lister 株 427 由来の細胞株にトランスフェクトしました。 RNAiは、1μg/mlのテトラサイクリンの添加により選択されたセミクローン集団において誘導され、標的mRNAの下方制御は、誘導の2日後および4日後に定量的RT-PCRによって検証された。 RNeasy Mini Kit (Qiagen) で単離した全 RNA を 2 μg の DNase I で処理し、TaqMan Reverse Transcription キット (Applied Biosciences) で cDNA に逆転写しました。 qPCR 反応は、Light Cycle 480 SYBR Green I Master mix (Roche)、2 μl の cDNA、および 0.3 μM プライマー (補足表 3) で設定し、LightCycle 480 (Roche) で実行しました。標的遺伝子の相対発現は、内因性参照遺伝子として 18S rRNA または β-チューブリンを使用した -ΔΔCt 法を使用して計算され、非誘導細胞に対して正規化されました。

変性ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミド電気泳動 (SDS-PAGE) 用の全細胞溶解物は、3 × Laemmli 緩衝液 (150 mM Tris pH 6.8、 300 mM 1,4-ジチオスレイトール、6% (w/v) SDS、30% (w/v) グリセロール、0.02% (w/v) ブロモフェノールブルー) を 30 μl 中に最終濃度 1 × 107 細胞まで加えます。ライセートを 97 °C で 10 分間煮沸し、-20 °C で保存しました。イムノブロットでは、3 × 106 細胞のライセートを 4 ～ 20% 勾配トリス-グリシンポリアクリルアミドゲル (BioRad 4568094) で分離し、PVDF 膜 (Pierce 88518) にエレクトロブロットし、それぞれの抗体でプローブしました (補足表 4)。膜をClarity Western ECL基質(BioRad 1705060EM)とともにインキュベートし、化学発光をChemiDoc装置(BioRad)で検出した。バンド強度は、ImageLab ソフトウェアを使用して濃度測定により定量化されました。個々のサブユニットのレベルは、mtHsp70 のシグナルに対して正規化されました。

ブルーネイティブ PAGE (BN-PAGE) は、以前に説明したように 12、次の変更を加えて実行しました。 2.5 × 108 細胞からの粗ミトコンドリア小胞を 40 μl の可溶化バッファー A (2 mM ε-アミノカプロン酸 (ACA)、1 mM EDTA、50 mM NaCl、50 mM Bis-Tris/HCl、pH 7.0) に再懸濁し、 2% (w/v) ドデシルマルトシド (β-DDM) を氷上で 1 時間。ライセートを 16,000 × g、4 °C、30 分間で清澄化し、ビシンコニン酸アッセイを使用してタンパク質濃度を推定しました。各時点で、総タンパク質の 4 μg に相当する量のミトコンドリアライセートを、1.5 μl のローディングダイ (500 mM ACA、5% (w/v) クーマシーブリリアントブルー G-250) および 5% (w/v) と混合しました。 v) グリセロールと 1 M ACA を最終容量 20 μl/ウェルになるまで加え、ネイティブ PAGE 3 ～ 12% Bis-Tris ゲル (Invitrogen) で分離します。電気泳動 (3 時間、140 V、4 °C) 後、エレクトロブロッティングによってタンパク質を PVDF 膜に転写し (2 時間、100 V、4 °C、撹拌)、続いて適切な抗体で免疫検出を行いました (補足表 4)。。

ミトコンドリア膜を分極させる能力は、透過処理された細胞においてサフラニン O 色素 (Sigma S2255) を使用して蛍光分析的に測定されました。各サンプルについて、2 × 107 個の細胞を収集し、ANT バッファー (8 mM KCl、110 mM グルコン酸 K、10 mM NaCl、10 mM 遊離酸 Hepes、10 mM K2HPO4、0.015 mM EGTA カリウム塩、10 mM マンニトール) で洗浄しました。、０．５ｍｇ／ｍｌの脂肪酸を含まないＢＳＡ、１．５ｍＭのＭｇＣｌ２、ｐＨ７．２５）。細胞を、5μMサフラニンOを含むANT緩衝液2ml中の8μMジギトニンによって透過処理した。蛍光は、Hitachi F-7100分光蛍光計(Hitachi High Technologies)で、495および585nmを使用し、5Hzの取得速度で700秒間記録した。それぞれ励起波長と発光波長。 1 mM ATP (PanReac AppliChem A1348,0025) および 10 μg/ml オリゴマイシン (Sigma O4876) をそれぞれ 230 秒後および 500 秒後に添加しました。脱共役剤 SF 6847 (250 nM; Enzo Life Sciences BML-EI215-0050) の最終添加は、最大脱分極のコントロールとして機能しました。すべての実験は室温で一定の撹拌下で実施されました。

ジギトニンで単離されたミトコンドリアにおける ATP 産生は、以前に記載されているように実行されました 39。簡単に説明すると、各時点あたり 1 × 108 細胞を、0.015% (w/v) ジギトニンを含む SoTE バッファー (600 mM ソルビトール、2 mM EDTA、20 mM Tris-HCl、pH 7.75) 中で氷上で 5 分間溶解しました。遠心分離 (3 分、4000 × g、4 °C) 後、可溶性サイトゾル画分を廃棄し、細胞小器官ペレットを 75 μl の ATP 生成アッセイ緩衝液 (600 mM ソルビトール、10 mM MgSO4、15 mM リン酸カリウム緩衝液 pH) に再懸濁しました。 7.4、20 mM トリス-HCl pH 7.4、2.5 mg/ml 脂肪酸フリー BSA）。 ATP産生は、20mM DL-グリセロールリン酸（ナトリウム塩）および67μM ADPの添加によって誘導された。対照サンプルを、阻害剤シアン化カリウム(1 mM)およびカルボキシトラトラチロシド(6.5 μM)とともに室温で10分間プレインキュベートした。室温で３０分後、１．５μｌの７０％過塩素酸を添加して反応を停止させた。 ATP の濃度は、Tecan Spark プレートリーダーで Roche ATP 生物発光アッセイキット HS II を使用して推定されました。 RNAi 誘導サンプルの発光値を、対応する非誘導サンプルの発光値に対して正規化しました。

サンプルを遠心分離し、ペレットを 20% BSA で完成した標本キャリアに移し、高圧冷凍庫 Leica EM ICE (Leica Microsystems) を使用して直ちに凍結しました。凍結置換は、100％アセトンで希釈した2％四酸化オスミウムの存在下、-90℃で実施した。 96 時間後、試験片を 5 °C/h の勾配で -20 °C まで温めました。次の 24 時間後、温度を 3 °C まで上昇させました (3 °C/h)。室温で、サンプルをアセトンで洗浄し、25、50、75% アセトン/樹脂 EMbed 812 (EMS) 混合物を各ステップで 1 時間浸透させました。最後に、サンプルを 100% 樹脂に浸透させ、60 °C で 48 時間重合させました。ダイヤモンドナイフを使用して超薄切片 (70 nm) を切断し、銅グリッド上に置き、酢酸ウラニルとクエン酸鉛で染色しました。 TEM 顕微鏡写真は、80 kV の加速電圧で動作する JEOL 1010 TEM を使用する Mega View III カメラ (SIS) で撮影されました。

3 × 1011 個の細胞からのミトコンドリアを、10% グリセロールおよび EDTA フリーの完全プロテアーゼ阻害剤 (Roche) を含む 60 ml の 20 mM Bis-tris プロパン pH 8.0 中の 1% (w/v) β-DDM によって 4 ℃で 20 分間溶解しました。 ℃。溶解物を4℃、30,000×gで20分間遠心分離して清澄にし、1M 3-(N-モルホリノ)プロパンスルホン酸pH5.9を滴下してpH6.8に調整した。二量体化領域を持たない組換え TbIF1。F1-ATPase に対する親和性は、N 末端切断およびチロシン 36 のトリプトファン 20 への置換により増加し、C 末端グルタチオン S-トランスフェラーゼ (GST) タグが付いています (TbIF1(9-64)-Y36W- ＧＳＴ）を、ＡＴＰシンターゼの推定含量より約１０倍モル過剰に添加した。 TbIF1の結合は、4 mM 硫酸マグネシウムを含む中和された2 mM ATPの添加により促進されました。 5分後、塩化ナトリウムを100 mMまで添加し、溶解物を0.2 μmシリンジフィルターで濾過し、0.1%を含む20 mM Bis-Tris-Propane pH 6.8結合緩衝液で平衡化した5 ml GSTrap HPカラム(Cytiva)に直ちにロードした。 (w/v) グリコジオスゲニン (GDN; Avanti Polar Lipids)、10% (v/v) グリセロール、100 mM 塩化ナトリウム、1 mM トリス(2-カルボキシエチル) ホスフィン (TCEP)、1 mM ATP、2 mM マグネシウム硫酸塩、15 μg/ml カルジオリピン、50 μg/ml 1-パルミトイル-2-オレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン (POPC)、25 μg/ml 1-パルミトイル-2-オレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン(POPE) および 10 μg/ml 1-パルミトイル-2-オレオイル-sn-グリセロ-3-[ホスホ-rac-(1-グリセロール)] (POPG)。すべてのリン脂質は Avanti Polar Lipids から購入しました (それぞれ、カタログ番号 840012C、850457C、850757C、および 840757)。 ATPシンターゼは、結合緩衝液と同じ成分を含むトリスpH8.0緩衝液中の20mM還元グルタチオンの勾配で溶出させた。 ATPシンターゼを含む画分をプールし、分子量カットオフ30kDaのVivaspin遠心濃縮器で150μlに濃縮した。サンプルを、20 mM Tris pH 8.0、100 mM 塩化ナトリウム、2 mM 塩化マグネシウム、0.1% (w/v) GDN を含む緩衝液で平衡化した Superose 6 Increase 3.2/300 GL カラム (Cytiva) でのサイズ排除クロマトグラフィーによって分画しました。、３．７５μｇ／ｍｌのカルジオリピン、１２．５μｇ／ｍｌのＰＯＰＣ、６．２５μｇ／ｍｌのＰＯＰＥおよび２．５μｇ／ｍｌのＰＯＰＧを０．０３ｍｌ／分で。 ATPシンターゼに対応する画分をプールし、我々や他の研究者らが実験的にダイマー集合体をcryo-EM40中でより良く保存することを発見した0.05%(w/v)β-DDMを補充し、50μlに濃縮した。

サンプルは、3 秒間のブロッティング後、グロー放電 Quantifoil R1.2/1.3 Au 300 メッシュグリッド上でガラス化され、続いて Vitrobot Mark IV を使用して液体エタンに浸されました。スリット幅 20 eV の Quantum K2 カメラ (Gatan) を使用し、公称倍率 165 kx (0.83 Å/ピクセル) で 300 kV で動作する Titan Krios (ThermoFisher Scientific) 上の EPU 1.9 を使用して、5199 本のムービーが収集されました。データは、3.6 電子/ピクセル/秒の露光速度、合計 33 電子/Å2 の露光、およびムービーあたり 20 フレームで収集されました。

画像処理は、特に指定がない限り、RELION-3.0 を使用して、Scipion 2 フレームワーク 41 内で実行されました。ムービーは、MotionCor2 の RELION 実装を使用してモーション修正されました。最初に、Gautomatch (http://www.mrc-lmb.cam.ac.uk/kzhang/Gautomatch) の参照ベースのピッキングを使用して 294,054 個の粒子が選択され、コントラスト伝達関数パラメーターは GCTF42 を使用しました。その後の画像処理は RELION-3.0 で実行され、2D および 3D 分類を使用して 100,605 個の粒子が選択され、ビン化されていない 560 ピクセルのボックスに抽出されました (図 S1)。 ATP シンターゼ二量体の初期モデルは、de novo 3D モデル生成を使用して取得されました。 C2 対称性を適用したマスクされたリファインメントを使用し、粒子ごとの CTF リファインメントとベイジアン研磨の後に膜領域の 2.7 Å 構造が得られました。 C2 対称拡張と 1 つのモノマーのシグナル減算の後、周辺ストークの 3.7 Å マップが得られました。 F1/c リング領域のマスクを使用して、整列した粒子の 3D 分類 (T = 100) を使用して、10 の異なる回転サブステートを分離し、3D リファインメントを使用して 3.5 ～ 4.3 Å の解像度のマップを取得しました。著者らは、この研究で特定されたクラスの数は、複合体の完全な構造空間ではなく、限られた数の粒子を反映している可能性が高いと指摘しています。主回転状態 1 に属するすべての状態からの粒子を組み合わせることで、ローターの 3.7 Å マップと、両方のローターが主回転状態 1 にある完全な ATP シンターゼ二量体の 3.2 Å コンセンサスマップが得られました。

静的 Fo 膜領域の初期原子モデルは、Bucaneer43 を使用して自動的に構築されました。その後、サブユニットがクライオ EM マップから直接割り当てられ、そのうち 15 個は以前に同定された T. ブルーセイ ATP シンターゼサブユニット 21 に対応し、ここでは 3 つのサブユニット (ATPTB14、ATPEG3、および ATPEG4) が BLAST 検索を使用して同定されました。手動モデル構築は、T. brucei F1 PDB 6F5D [https://www.rcsb.org/structural/6F5D] (T. brucei F1)13 と E. gracilis OSCP および E. gracilis の相同性モデル 45 を使用して、Coot 0.9.544 で実行されました。 c-ring PDB 6TDU [https://www.rcsb.org/structural/6TDU] (E. gracilis ミトコンドリア ATP シンターゼ)10 を開始モデルとして使用します。リガンドはマップに手動で適合され、制約は GRADE サーバー (http://grade.globalphasing.org) によって生成されました。カルジオリピンは、中央のグリセロール橋によって結合された 2 つのホスファチジル基に対応する、両末端で分岐した特徴的な細長い密度の存在に基づいて割り当てられました。モノホスファチジル脂質は、その頭部基密度に基づいて割り当てられました。コリン基の密度の特徴的な四面体形状は、ホスファチジルコリンを伸長したホスファチジルエタノールアミン頭部基から区別するのに役立ちました（補足図5g、h）。実空間リファインメントは、PHENIX 1.17.1 で、膜領域、周辺ストーク先端、C リング/中央ストーク、および異なる回転状態の F1Fo モノマーの、それぞれ自動鮮明化され、ローカル解像度でフィルター処理されたマップを使用して実行されました。構造上の制約。モデル統計は、MolProbity46 および EMRinger47 を使用して生成されました。最後に、それぞれの洗練されたモデルが複合 ATP シンターゼ二量体モデルに結合され、両方のモノマーが回転状態 1 にあるローカル解像度フィルター処理されたコンセンサス ATP シンターゼ二量体マップに対して参照を適用して実空間で洗練されました。拘束。構造の図は ChimeraX 0.9148 を使用して作成され、プロトンのハーフチャネルは HOLLOW49 を使用して追跡されました。

研究デザインの詳細については、この記事にリンクされている Nature Research レポートの概要をご覧ください。

この研究で生成された原子座標は、アクセッションコード: 8AP7 (膜領域)、8AP8 (周縁茎)、8AP9 (ローター)、8AP6 (F1Fo 二量体)、8APA (回転) の下でタンパク質データバンク (PDB) に寄託されています。状態1a)、8APB(回転状態1b)、8APC(回転状態1c)、8APD(回転状態1d)、8APE(回転状態1e)、8APF(回転状態2a)、8APG(回転状態2b)、8APH(回転状態) 2c)、8APJ (回転状態 2d)、8APK (回転状態 3)。局所解像度でフィルタリングされたクライオ EM マップ、ハーフマップ、マスク、および FSC 曲線は、アクセッションコード EMD-15560 (膜領域)、EMD-15561 (周辺茎)、EMD-15562 で電子顕微鏡データバンクに寄託されています。（ローター）、EMD-15559（F1Foダイマー）、EMD-15563（回転状態1a）、EMD-15564（回転状態1b）、EMD-15565（回転状態1c）、EMD-15566（回転状態1d）、EMD- 15567 (回転状態 1e)、EMD-15568 (回転状態 2a)、EMD-15570 (回転状態 2b)、EMD-15571 (回転状態 2c)、EMD-15572 (回転状態 2d)、EMD-15573 (回転状態 3) ）。薄い細胞切片の TEM 顕微鏡写真は、ご要望に応じて著者から入手できます。他のすべてのデータは、記事、補足情報、またはソースデータファイルで入手できます。ソースデータはこのペーパーに付属しています。

この研究で使用された原子座標: 6TDU (E. gracilis ミトコンドリア ATP シンターゼ)、6TDV (E. gracilis ミトコンドリア ATP シンターゼ、膜領域)、6B2Z (S. cerevisiae ミトコンドリア ATP シンターゼ)、6F5D (T. brucei F1) 、6ZNA (S. スクロファミトコンドリア ATP シンターゼ) ソースデータはこの論文に提供されます。

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プロジェクトの初期段階で ATP シンターゼ精製に関して貴重なご支援をいただいた John E. Walker および Martin G. Montgomery に感謝いたします。我々は、MEYS CR (LM2018127) の支援を受けている CIISB の低温電子顕微鏡および断層撮影の中核施設、Instruct-CZ センターに感謝します。この研究は、チェコ科学財団の助成金番号 18-17529S (AZ へ) および 20-04150Y (OG へ)、および欧州地域開発基金 (ERDF) および教育・青少年・スポーツ省 (MEYS) プロジェクト CZ.02.1.01/0.0 によって支援されました。 /0.0/16_019/0000759 から AZ、スウェーデン戦略研究財団 (FFL15:0325)、ラグナルセーデルバーグ財団 (M44/16)、欧州研究評議会 (ERC-2018-StG-805230)、クヌートおよびアリスワレンバーグ財団 (2018.0080) 、および EMBO 若手捜査官プログラムから AA へ

ストックホルム大学が提供するオープンアクセス資金。

これらの著者は同様に貢献しました: Ondřej Gahura、Alexander Mühleip。

寄生虫学研究所、生物学センター、チェコ科学アカデミー、37005、チェスケーブジェヨヴィツェ、チェコ共和国

オンドジェ・ガフラ、カロリーナ・イエロ・ヤップ、ブライアン・パニクッチ、ミナル・ジェイン、マルティナ・スラップニチコヴァ、アレナ・ジーコヴァ

Science for Life Laboratory、生化学および生物物理学科、ストックホルム大学、17165、ソルナ、スウェーデン

アレクサンダー・ミューリップ & アレクセイ・アムント

南ボヘミア大学理学部、37005、チェスケー・ブジェヨヴィツェ、チェコ共和国

カロリーナ・ヒエロ・ヤップ、ミナル・ジェイン、デヴィッド・ホラウス、アレナ・ジコバ

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AZ と AA がこの作品を考案し、デザインしました。 OG はクライオ EM 用のサンプルを準備しました。 OG と AM は初期スクリーニングを実施しました。 AM はクライオ EM データを処理し、モデルを構築しました。 OG、AM、AA が構造を解析しました。 BP、CHY、MJ、MS、OG、DH、および AZ は生化学分析を実行しました。 OG、AM、AA、AZ がデータを解釈しました。 OG、AM、AA、AZ が原稿を執筆し、改訂しました。著者全員が分析に貢献し、原稿の最終版を承認しました。

Alena Zíková または Alexey Amunts への通信。

著者らは競合する利害関係を宣言していません。

Nature Communications は、この研究の査読に貢献してくれた匿名の査読者に感謝します。査読者レポートが利用可能です。

発行者注記 Springer Nature は、発行された地図および所属機関の管轄権の主張に関して中立を保っています。

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転載と許可

Gahura, O.、Mühleip, A.、Hierro-Yap, C. 他祖先の相互作用モジュールは、多様なミトコンドリア ATP シンターゼのオリゴマー化を促進します。 Nat Commun 13、5989 (2022)。 https://doi.org/10.1038/s41467-022-33588-z

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受信日: 2021 年 12 月 22 日

受理日: 2022 年 9 月 22 日

公開日: 2022 年 10 月 11 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-022-33588-z

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