社会的トラウマは側方中隔回路を作動させて社会的報酬を遮断する

Nature volume 613、pages 696–703 (2023)この記事を引用

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223 オルトメトリック

メトリクスの詳細

人間の場合、トラウマ的な社会的経験が精神障害の一因となる可能性があります1。社会的トラウマにより脳の報酬機能が損なわれ、社会的行動に報酬が得られなくなり、重度の社会的回避につながることが示唆されています2,3。げっ歯類では、社会的トラウマ後のストレス感受性と回復力の根底にある神経生物学を理解するために慢性社会的敗北ストレス（CSDS）モデルが使用されていますが、社会的報酬に対するその影響についてはほとんど知られていません4,5。今回我々は、CSDS後、感受性（SUS）と呼ばれる雄と雌のマウスのサブセットが、攻撃性のない同性の幼若C57BL/6Jマウスとの社会的相互作用を回避し、C57BL/6Jマウスとの遭遇後に状況依存的な社会的報酬を獲得しないことを示す。彼ら。非社会的ストレス要因は、男女ともに社会的報酬に影響を与えません。次に、全脳 Fos マッピング、in vivo Ca2+ イメージング、および全細胞記録を使用して、SUS マウスでは幼若期の社会的相互作用によってのみ活性化されるが、幼若期の社会的相互作用によってのみ活性化されるストレス/脅威応答性側方中隔ニューロテンシン (NTLS) ニューロンの集団を特定しました。回復力のあるまたはストレスのない対照マウスにおいて。 NTLS ニューロンとその下流接続の光遺伝学または化学遺伝学的操作は、社会的相互作用と社会的報酬を調節します。これらのデータを総合すると、SUS マウスでは、社会的報酬の処理を妨げる NTLS ニューロンの活動亢進に起因して、以前は報酬を与えていた社会的対象が社会的脅威として認識される可能性があることが示唆されています。

社会的回避は多くの精神疾患に現れ、その原因は社会的接触に対する無関心6から社会的接触によって引き起こされる否定的な感情状態7まで多岐にわたります。社会的回避の原因は多様ですが8、過去の社会的トラウマにより、社会的報酬の減少を反映すると考えられる重度の社会的回避が生じる可能性があります2,9。社会的トラウマとその結果として生じる社会的行動への影響については臨床的に深い理解があるにもかかわらず、関係する根底にある神経回路についてはほとんどわかっていません。慢性社会的敗北ストレス（CSDS）などの前臨床社会的トラウマモデルは、感情的行動を制御する神経回路機構をよりよく理解するために使用されてきました4,5,10。 CSDS は探索行動やスクロースのような自然な報酬への選好を減少させ、社会的快感喪失と解釈される重度の社会的回避をもたらします5,10。しかし、過去のCSDS研究では、社会的トラウマを誘発する攻撃者として使用されたマウスと同様の、成体CD-1マウスとの社会的相互作用を評価した。このような状況下での社会的回避は、おそらく社会的報酬の低下ではなく、恐怖や従順な行動を反映していると考えられます。

社会的報酬の欠乏がCSDSによって誘発されるかどうかをより深く理解するために、我々は、制御条件下では報酬を与える非脅威の同性幼若C57BL/6Jマウスを用いて、社会的相互作用と社会的条件付け場所選好性（sCPP）をテストすることにより、社会的行動を評価した。。 CSDSは、慢性変動ストレス（CVS）のような非社会的慢性ストレス因子ではなく、感受性（SUS）と呼ばれるマウスのサブセットにおける社会的報酬をブロックする。次に、成人男性の攻撃者との過去のトラウマ的な社会的経験がその後の社会的報酬処理に影響を与えるメカニズムをよりよく理解するために、回路ベースのアプローチを採用しました。 CSDS後、SUSマウスは外側中隔ニューロテンシン（NTLS）神経回路内の活動の亢進を示し、これにより、脅威のない社会的状況にさらされた場合でも、社会的報酬が遮断され、持続的な社会回避行動が促進されます。

CSDS が社会的相互作用と社会的報酬にどのような影響を与えるかを調査するために、生後 7 ～ 8 週の野生型 (WT) 雄マウスと雌マウスに標準的な CSDS を受けさせた後、CD-1 または ERα-Cre F1 マウスを用いた社会的相互作用テストを実施しました10,11。前述したように、マウスは社会的相互作用行動（つまり、社会的相互作用（SI）比）に基づいて回復力（RES）またはSUSのいずれかに分類されました（図1a、b、gおよび拡張データ図1a、b、d）、e)。続いて、生後 4 ～ 6 週の同性幼若 C57BL/6J マウスを用いて常駐侵入者 (RI) テストと sCPP を実施しました。 RI 試験中、対照 (CTRL) マウスと RES マウスは、活発な相互作用 (つまり、近づく、近くを追いかける、匂いを嗅ぐなど) の量を含め、幼体に対して同様の社会的行動を示しました。これらのグループのマウスは、幼体が近づいて調査しても、ほとんど後ずさりしませんでした。これを受動的な社会的調査と定義します。逆に、SUS マウスは、幼体に対する受動的社会調査中に、積極的な社会調査がはるかに少なく、最初の社会的試合までの潜伏期間が長く、社会的回避が著しく多かった（図1c、d、h、iおよび拡張データ図1c、f）。社会的調査時間、社会的回避、および調査までの待ち時間は、CD-1 を使用したテスト中の SI 比と相関していました (拡張データ図 1g-l)。これらの結果は、SUS マウスが攻撃的な成体 CD-1 雄マウスだけでなく、脅威を与えない同性の C57BL/6J 幼若マウスに対しても回避行動を示すことを示しています。次に、sCPP テストを使用して社会的選好を評価しました。 CTRLマウスとRESマウスは侵入者とペアになった状況に対して社会的選好を形成しましたが、SUSマウスは形成しませんでした（図1e、j）。これは、幼若期の相互作用がSUSマウスに報酬を与えないことを示唆しています。 sCPPスコアは、SI比（図1f、k）、社会的調査時間、社会的回避回数、RI検査中の最初の社会的発作までの潜伏時間（拡張データ図1m〜r）と相関していました。女性の発情周期は、sCPP 形成の差異とは関連しませんでした (拡張データ図 1s)。興味深いことに、メスのマウスは、条件付け中に幼若マウスを金網カップに閉じ込めた場合にのみ有意なsCPPを形成することがわかりました（拡張データ図1t）ので、メスを対象としたすべての研究にこのデザインを使用しました。社会的回避を除いて、すべての行動パラメータは正規分布しました（拡張データ図 1u）。 sCPPが無傷の学習および記憶プロセスに依存していることを考慮して、新規物体認識および新規位置テストを実行したところ、CTRLマウスと比較してSUSまたはRESマウスでは学習および記憶障害の証拠は見つかりませんでした（拡張データ図2a〜c）。。行動テストの実行順序が社会的行動の側面に影響を与えるかどうかをテストするために、CSDS後のWTマウスでテストの順序（sCPP-RI-SI）を逆にしたところ、同様の効果が見つかりました（拡張データ図2d、e）。次に、最初にsCPPスコア（社会的嗜好）によってマウスをグループ化し、SI比の傾向とともにRIテストの社会的調査と同様の正の相関関係を発見しました（拡張データ図2f、g）。これは、これらの異なる社会的傾向が再び示唆されています。行動は主に相互に相関しています。これらのデータを総合すると、CSDS による社会的回避は社会的報酬処理の混乱に起因するという考えが裏付けられ、SUS マウスは実際に青少年の社会的対象を脅威やストレスとして認識しているのではないかと考えられるようになった。

a、慢性的な社会的敗北後の社会的行動テストの実験タイムライン。 b、g、女性のSI比（Tukeyの多重比較検定による一元配置分散分析（ANOVA）、F（2、31）= 53.96、P < 0.0001、n = 10（CTRL）、12（RES）、 12（SUS）（b）;および男性（一元配置分散分析、F（2、46）= 24.36、P < 0.0001、n = 10（CTRL）、13（RES）、26（SUS）（g）。 c、h、女性のRIテストからの社会的調査時間（一元配置分散分析、F（2、31）= 6.755、P = 0.0037）（c）;および男性のRIテスト（F（2、46）= 14.82、P < 0.0001) (h). d,i、女性 (F (2, 31) = 33.13、P < 0.0001) (d) および男性 (F (2, 46) = 15.37、P < 0.0001) (i) の社会的回避e、sCPPテスト中にペアおよび非ペアのチャンバーで費やした時間（女性CTRL（二元配置反復測定ANOVAとそれに続くシダックの多重比較テスト、F（1、18）= 7.023、P = 0.0163、n = 10）; RES マウス (F (1, 22) = 4.598、P = 0.0433、n = 12);および SUS マウス (F (1, 22) = 0.08155、P = 0.7779、n = 12)) f、SI 比間の相関女性のsCPP (R2 = 0.1474、P = 0.025) j、sCPPテスト中にペアおよびペアになっていないチャンバーで費やした時間(二元配置反復測定分散分析: 男性CTRL (F (1, 18) = 6.074、P = 0.0240) 、n = 10); RES マウス (F (1, 26) = 7.499、P = 0.0110、n = 13)。および SUS マウス (F (1, 50) = 0.4818、P = 0.4908、n = 26))。 k、男性におけるSI比とsCPPの間の相関関係(R2 = 0.08939、P = 0.0369)。 NS、重要ではありません。 *P < 0.05、**P < 0.01、***P < 0.001、****P < 0.0001。すべてのデータは平均値 ± 標準誤差として表されます。

ソースデータ

SUS マウスの社会的報酬欠乏を媒介する回路機構を調査するために、iDISCO+ 法 12 を使用して明確な全脳 Fos マッピング手順を実行し、マウスが幼体の侵入者に曝露されたときの CSDS 後に差次的に変調された脳領域を調べました（図 2a および拡張データ図.3a–h)。透明化された脳（図2b）をライトシート顕微鏡（図2c）で画像化し、続いてClearMap12を使用して登録と注釈を付けました（拡張データ図3i）。まず、関連する可能性のある脳領域をスクリーニングするために、CTRL、SUS、および RES マウス間で Fos+ 細胞を比較し、雌雄で差次的に調節されている脳領域を特定しました（図 2d、拡張データ表 1-5 および補足表 1）。興味深いことに、RES マウスと SUS マウスを比較すると、両性とも同様の社会的欠陥を示しているにもかかわらず、Fos 活性に劇的な性別ベースの違いがあることがわかりました。 RES雄と比較して、SUS雄は47領域でFos+細胞の有意な増加を示したが、SUS雌は22領域のみで有意な増加を示した。特に、外側中隔（LS）は、RESマウスと比較してSUSの雄と雌の両方で最も高度に活性化された脳領域の1つであるため、さらなる調査のためにそれを選択しました。 SUS マウスにおける Fos の活性化が社会的標的の存在によるものであることを確認するために、我々は CSDS 後に新規の物体と幼い侵入者を使って追加の RI テストを実行しました。これらの条件下では、新規オブジェクトとの相互作用と比較して、若齢動物との相互作用後の SUS マウスでは Fos 活性が有意に高いことがわかりました。 RESマウスにおける新規物体と幼体の両方の相互作用後のFos活性のわずかな増加が観察されましたが、それらの間に費やされた時間には有意な差はありませんでした（拡張データ図3j、k）。

a、CSDS後のRI検査からのiDISCO+ Fos分析のタイムライン。時限嚢、マウスは RI テストの 90 分後に灌流されました。 b、iDISCO+ クリア前後のマウスの脳。 c、ライトシートイメージングからの自己蛍光およびFosシグナル。 d、RESマウスとSUSマウスの区別して活性化された脳領域を示すClearMap分析。矢印はLSを示します。 e、Allen Brain Atlas ISH データからのニューロテンシン発現。 f、ISHのタイムライン。 g、h、女性のNTニューロンにおけるFos発現（h）を示すマルチプレックスISH（g）（一元配置分散分析、F（2、6）= 7.887、P = 0.0209、n = 1グループあたり3匹のマウス、マウスあたり3つのスライス） ) および雄 (F (2, 10) = 13.13、P = 0.0016、n = 3 (CTRL)、4 (RES)、6 (SUS)、マウスあたり 3 つのスライス)。スケールバー、50μm。 LV、側心室。 i、CSDS後のスライス電気生理学(ePhys)のタイムライン。 j、全細胞構成でパッチされた eYFP+ NTLS ニューロン。 k、注入電流の増分ステップによって誘発される活動電位のカウントを示す電流-周波数曲線。 SUS マウスの NTLS ニューロン (n = 55 ニューロン) を RES マウスと比較した (二元配置分散分析、P < 0.0001、n = 19)。 l、SUS および RES マウスの静止膜電位 (RMP) (両側マン・ホイットニー検定、P = 0.0336、n = 4 (RES)、9 (SUS)。 m、SI 比と発火率との相関100 pA ステップ電流 (ピアソン相関、R2 = 0.34、P = 0.0351) 各ドットは、RES (赤、n = 4) および SUS (黒、n = 9) マウスのマウスあたりの平均値を表します。n、サンプルトレース100 pA 電流注入後の RES (赤) および SUS (黒) マウスの興奮性 *P < 0.05、**P < 0.01. すべてのデータは平均値 ± sem として表されます。

ソースデータ

脳の一次報酬中枢全体にわたる相互接続が密に行われているため、LS は気分 13、14、15、16、モチベーション 17、18、および空間情報処理 19 との関連性があると考えられています。興味深いことに、若年性RI後のSUSマウスでは、ほとんどのFos発現ニューロンがLSの側腹側部分に特異的に位置していることがわかりました。 Allen Brain Atlas in situ hybridization（ISH）データベース20を使用して、ニューロテンシン（Nt）（図2e）やコルチコトロフィン放出ホルモン受容体2（Crhr2）など、LSの側腹側部分で特異的に発現するいくつかの遺伝子を発見しました。オキシトシン受容体（Oxtr）は外側部分で特異的に発現し、ソマトスタチン（Sst）は主に背外側部分で発現し、ドーパミン受容体D3（Drd3）はLSの内側部分でのみ発現しました。いくつかの最近の研究では、恐怖条件付けにおける Sst+ ニューロン 21、ストレス抑制摂食における vGAT+ および Nt+ ニューロン 22,23、不安様行動における Crhr2+ ニューロン 24、ならびに Oxtr+ および社会的恐怖25および社会的機能障害26におけるDrd3+ニューロン。どの細胞タイプがSUSマウスの若年社会的相互作用によって活性化されたかを決定するために、若年性RI後のCSDSマウスの脳スライスに対してマルチプレックスISHを実行しました（図2f）。 SUS マウスでは Nt と Fos の 94% 以上の共局在が見られましたが、Nt 細胞では Fos の発現は非常に限られていました（図 2g、h および拡張データ図 4a）。すべての Nt+ 細胞の約 100% が GABA 作動性でした (拡張データ図 4b、c)。興味深いことに、NtおよびCrhr2メッセンジャーRNAは主にLSの前部に共局在していましたが、後部ではそうではなく、SUSマウスの若年性RI後のFosレベルの有意な増加が見つかりました（拡張データ図4d、e）。 Nt+ ニューロンは、Drd3+ と約 5%、Oxtr+ ニューロンと約 20% の重複がありました (拡張データ図 4f–i)。興味深いことに、CTRLマウスと比較して、幼若社会的相互作用後のSUSマウスではSst + Fos +ニューロンの増加も見つかりましたが、RESマウスとSUSマウスの間ではそうではありませんでした（拡張データ図4j、k）。最後に、CTRL、RES、SUS マウスの間で Nt-Fos+ ニューロンに違いは見つかりませんでした（拡張データ図 4l）。これらのデータを総合すると、SUS マウスの社会的報酬欠損に NTLS ニューロンが潜在的に強く関与していることが強調されます。

幼体との相互作用後のSUSマウスでNTLSニューロンが実際に過剰活性化されたことを確認するために、全細胞スライス電気生理学的アプローチを使用して、幼体RIテスト後に敗北した雄マウスのNTLSニューロンを記録しました（図2i、j）。 SUSマウスのNTLSニューロンは、RESマウスと比較して、興奮性の増加（図2k、n）、および静止膜電位の減少（図2lおよび拡張データ図5a）を示すことがわかりました。興味深いことに、これらの細胞の興奮性は、CSDS後に観察されるSI比と負の相関があることもわかりました（図2m）。 NTLS ニューロンの固有の特性におけるこれらの変化は、CSDS がこれらの細胞に永続的な適応を誘導し、それが社会的機能不全を媒介することを示唆しています。興味深いことに、これらの細胞の他の特性（活動電位閾値、振幅、半値幅または高速過分極、拡張データ図5a）に違いは見出されず、CSDSがSUSマウスのこれらの細胞の興奮性を特異的に増加させることが確認されました。

幼体との社会的接触中の in vivo での NTLS ニューロン活動をさらに調査するために、Cre 依存性アデノ随伴ウイルス (AAV)-DIO-GCaMP6 を Nt-Cre トランスジェニックマウスの LS に注射して、NTLS ニューロンを標識しました（図 3a）。次に、若年性RI中のCTRL、RESおよびSUSマウスの蛍光Ca2+活性をファイバー測光法（FP）によって測定しました（図3bおよび拡張データ図5b）。 CTRL（図3c、d）およびRES（図3e、f）マウスでは、若年性アプローチに応答したNTLSニューロン活性の増加は見つかりませんでしたが、SUSマウスは有意に高い活性を示しました（図3g、h）。驚くべきことに、幼若期のアプローチ中のNTLSニューロン活動の増加の大きさ（蛍光の約5〜10％の変化（ΔF/F））は、ストレスを受けていないCTRLマウスが攻撃的な攻撃を受けるなどの嫌悪体験に遭遇したときに観察されたものと同様でした。 CD-1 マウス (図 3i、j)、または研究者が尾をつまむと痛みを感じる (図 3k、l)。さらに、NTLS ニューロン活動は、おいしい食物を摂取しても変化を示さなかった（拡張データ図 5c）。これらの発見は、NTLS ニューロンは嫌悪刺激には反応するが、報酬刺激には反応しないという考えと一致しています。さらに、sCPP条件付け中のNTLSニューロン活性をテストしたところ、SUSマウスのNTLSニューロンは、幼若ペアの条件付けセッション中により高い活性を示し、CTRLマウスまたはRESマウスでは変化が観察されないことがわかりました（拡張データ図5d）。これらのデータに基づいて、我々は、CSDS後、SUSマウスは社会的脅威の手がかりを過度に一般化し、非常に攻撃的なCD-1マウスによって攻撃されたときに観察されるのと同様に、幼体を社会的脅威として認識する可能性があることを示唆しています。

a、LSにおけるAAV-DIO-GCaMP6sの注入および発現。 b、FP実験のタイムライン。 c〜h、左、居住者侵入者テスト中のNTLSニューロンの代表的なCa2+トレース（ピンクのストリップは受動的社会調査を示します）。中央は、侵入者接近の 2 秒前と 2 秒後の NTLS ニューロン活動のイベント周辺プロット。右、CTRL女性（対応のある両側t検定、t6 = 3.379、P = 0.0149、n = 7）（c）および男性（t6 = 0.5081、P）における社会的イベントの2秒前と2秒後のニューロン活動の統計。 = 0.6295、n = 7) (d); RES女性（t4 = 0.6528、P = 0.5495、n = 5）（e）および男性（t4 = 0.2939、P = 0.7834、n = 5）（f）。 SUS の女性 (t4 = 3.772、P = 0.0196、n = 5) (g) と男性 (t4 = 4.844、P = 0.0084、n = 5) (h)。 i-l、左、社会的敗北と尻尾のつねり時のCTRLマウスのNTLSニューロンの代表的なCa2+トレース。中央は、攻撃/テールピンチの 2 秒前と 2 秒後の NTLS ニューロン活動のイベント周辺プロット。右、女性の敗北におけるイベントの 2 秒前と 2 秒後のニューロン活動の統計 (t7 = 6.852、P = 0.0002、n = 8) (i)、男性の敗北 (t6 = 6.973、P = 0.0010、n = 7) ( j)、女性の尾部ピンチ (t4 = 3.988、P = 0.0163、n = 5) (k)、および男性の尾部ピンチ (t5 = 6.137、P = 0.0017、n = 6) (l)。すべてのデータは、対応のある両側 t 検定を使用して分析されました。 *P < 0.05、**P < 0.01、***P < 0.001。すべてのデータは平均±標準誤差として表されます。スケールバー、100 μm。 b のイラストは BioRender (https://biorender.com) で作成されました。

ソースデータ

NTLSニューロンがCSDS後の社会的行動を調節するかどうかを評価するために、デザイナードラッグによってのみ活性化されるデザイナー受容体（DREADD）を発現するウイルスベクターを利用して、CD-1マウスによるSI中、および若年性RIおよびsCPP中のNTLSニューロンの活動を双方向的に操作しました。。 CSDSの約3〜4週間前に、生後4週間のNt-CreマウスのLSにAAV-DIO-hM3Dq、AAV-DIO-hM4Di、またはAAV-DIO-mCherryウイルスを注射しました（図4aおよび拡張データ図。 6a)。マウスはランダムに CTRL 条件または CSDS 条件に割り当てられました。必要性を示すための hM4Di による阻害研究では SUS マウスのみを使用しましたが、十分性を示すことを目的とした活性化研究では RES マウスのみを使用しました（注: 図 4 のビヒクル処理 SUS hM4Di マウスと RES hM3Dq マウスではベースライン SI が異なります）。試験は、ビヒクル注射の30分後に最初にマウスのSIを試験する被験者内デザインを使用して実施した。次に、2 回目の SI の 30 分前に、マウスにクロザピン N-オキシド (CNO) を腹腔内注射しました。我々は、雌雄両方のSIに対するNTLSニューロン調節の双方向効果を発見し、RESマウスでは活動の増加によりSIが減少し、SUSマウスでは活動の減少によりSIが増強された（図4b、i）。次に、マウスを RI のために 2 つのグループに分け、SI 比がグループ間でバランスがとれていることを確認しました。マウスには、RI 試験中にビヒクルまたは CNO のいずれかを投与しました。 NTLSニューロンを阻害すると、社会的調査時間が増加し、男女ともに回避行動が正常化されました（図4c、d、j、k）。 sCPPについては、社会的条件付けセッション中に、hM4Diを注射したSUSマウスおよびhM3Dqを注射したRESマウスをビヒクルまたはCNOで処理しました。 SUSマウスのNTLSニューロンを阻害することにより、男女ともCTRLまたはRESレベルに対する社会的条件付けコンパートメントの選好を正規化できることがわかりました（図4e、f、l、m）。逆に、RESマウスのNTLSニューロンを活性化することにより、雌雄ともにビヒクル処理対照と比較して社会的調査と社会的嗜好を減らすことができました（図4g、h、n、o）。したがって、社会的トラウマに起因する NTLS ニューロンの活性化は、社会的行動の欠陥を誘発するために必要かつ十分であることがわかります。興味深いことに、ストレスナイーブマウスのNTLSニューロンの活性化はSI比にもsCPPにも影響を与えず（拡張データ図6b-d）、これは社会的トラウマの病歴が重要であることを示唆しています。これと一致して、CSDSとCVSの両方がスクロースのような自然な報酬に対する選好を同様に減少させるという事実にもかかわらず、CVSなどの非社会的ストレス要因が社会的報酬に及ぼす影響は見つかりませんでした（拡張データ図6e、f）。これと一致して、最近の研究では、LSに投射する腹側CA3ニューロンが急性社会的ストレス誘発性回避に役割を果たしているが28、ストレスを受けていないマウスでは役割を果たしていないことが示された29。 NTLSニューロンがより一般的に報酬または嫌悪行動を調節できるかどうかをテストするために、ストレスナイーブマウスでリアルタイム場所選好アッセイ（RTPP）を利用しましたが、NTLSニューロンの光遺伝学的刺激が選好に及ぼす影響は見出されませんでした（拡張データ図6g、 h)。総合すると、これらのデータは、NTLS 回路がコンテキストに依存した方法で社会的行動を調整するという考えを裏付けています。

a, DREADD 実験の実験タイムライン。 b–d、i–k、SI 比、CSDS 後の社会的検査中の NTLS ニューロンの化学遺伝学的活性化 (RES マウス) または阻害 (SUS マウス) 後の社会的調査および社会的回避 (二元配置反復測定 ANOVA、女性: F ( 2、53) = 9.785、P = 0.0002、n = 18 (hM3Dq)、20 (hM4Di)、16 (mCherry) (b)、F (2、25) = 5.807、P = 0.0085 (c)、F (2 、25) = 5.906、P = 0.0079、n = 9 (hM3Dq)、10 (hM4Di)、8 (mCherry) (d); 男性: F (2, 64) = 12.96、P < 0.0001、n = 30 (hM3Dq) )、20 (hM4Di)、17 (mCherry) (i)、F (2, 20) = 19.46、P < 0.0001 (j)、F (2, 20) = 10.12、P = 0.0009、n = 8 (hM3Dq) 、8 (hM4Di)、7 (mCherry) (k))。 e-h、l-o、雌SUSマウスのNTLSニューロンの阻害によって回復した社会的選好（二元配置反復測定ANOVA、CNO（e）、F（1、14）= 7.272、P = 0.0174、n = 8） ; 車両 (f)、F (1, 14) = 0.3070、P = 0.5883、n = 8)。雄のSUSマウス（CNO（l）、F（1、14）= 4.710、P = 0.0477、n = 8;ビヒクル（m）、F（1、18）= 1.627、P = 0.2183、n = 10）。 RES女性におけるNTLS集団の活性化（二元配置反復測定ANOVA、CNO（g）、F（1、18）= 0.1653、P = 0.6891、n = 10;溶媒（h）、F（1、18）= 8.490、P = 0.0093、n = 10)。 RES男性（CNO（n）、F（1、14）= 0.2221、P = 0.6447、n = 8;溶媒（o）、F（1、16）= 9.283、P = 0.0077、n = 9）ではブロックされました社会的CPP形成。 *P < 0.05、**P < 0.01、***P < 0.001、****P < 0.0001。すべてのデータは平均値 ± 標準誤差として表されます。

ソースデータ

NTLS ニューロンが非社会的ストレス要因に関連する状況固有の情報をコードしているかどうかを判断するために、WT マウスを慢性拘束ストレス (CRS) に曝露し、新しい拘束チューブを使用した相互作用テストを実行しました。 CRSに曝露されたマウスはチューブに近づくまでの時間が長くなり、チューブの調査に費やされる時間が短縮されたことがわかりました（拡張データ図7a、b）。次に、抑制性DREADDでNTLSニューロンを沈黙させたところ、これによりチューブ回避が部分的に救われることがわかりました（拡張データ図7c、d）。別のグループでは、CRSO（CRSO）中に幼若期の寝具/臭気を与えたWTマウスをペアリングさせたところ、若年期RI検査では差が見られず、マウスはこれらの嗅覚刺激への曝露に基づいて若年期の社会的対象への回避を一般化しないことが示唆された（拡張）データ図7e、f)。全体として、これらのデータは、NTLS ニューロンが、ストレスの多い状況または脅威的な状況からの過去の情報を使用して、同じまたは同様の脅威的な/ストレスの多い状況に関連する手がかりに向かって将来の行動を導く、より一般的な計算に関与していることを示唆しています。最後に、高架十字迷路（EPM）、大理石埋め込みテスト、オープンフィールドテスト（OFT）などの不安関連行動の媒介におけるNTLSニューロンの役割を発見しました（拡張データ図7g–j）。これらの結果を総合すると、LSが、特に嫌悪感やストレス体験に反応した感情的行動の調節における重要なノードであることが強調されます。

LS には長距離の GABA 作動性投射ニューロン 30 が含まれており、地形的に分布した広範囲の入出力投射を持っています 18,31,32。 NTLS ニューロンの出力パターンを決定するために、ウイルスを介した複数の順行性追跡ツールを適用しました。まず、AAV-DIO増強黄色蛍光タンパク質（eYFP）をNt-CreマウスのLSに注射し、脳全体のeYFP +軸索終末を画像化しました（図5a）。次に、HSV-1 (H129ΔTK-TT) を順行性トランスシナプストレースに使用し 33、どの領域が NTLS ニューロンと単シナプス結合を形成しているかを検証しました (図 5b および拡張データ図 8a)。興味深いことに、内側外側視索前野（LPO/MPO）、側坐核（NAc）、前視床下部核（AHN）、外側視床下部（LH）、中水道周囲灰白質（PAG）、内側扁桃体などの下流領域の多くが特定されています。 (MEA) および乳頭上核 (SuM) はすべて、社会的行動 34 または条件付き報酬 35 のさまざまな側面に関与しています。これらの領域のうち、NAc は社会的報酬 36,37 やストレス感受性 35,38 に関与し、PAG は社会的攻撃性 39 や防御行動や逃避行動 40,41 にも関与しています。 AHN は防御行動 42 や親としての行動 43 において役割を果たしていますが、社会的報酬におけるその役割は不明のままです。私たちはまず、これらの各部位に同じ NTLS ニューロンが投射しているのか、それとも異なる NTLS ニューロンが投射しているのかを判断したいと考えました。 tdTomatoを発現するCre依存性逆行性AAV（rgAAV-DIO）をNt-CreマウスのAHN、NAc、またはPAGに注射しました（拡張データ図8b）。同じマウスの代替領域に rgAAV-DIO-eYFP を注射し、NTLS ニューロンにおける tdTomato と eYFP の重複を視覚化しました。また、コレラ毒素サブユニット B (CTB) を NAc (CTB488)、AHN (CTB555)、および PAG (CTB647) に注射したところ (拡張データ図 8d)、同様の結果が得られました: AHN/NAc-、AHN/PAG-、および NAc/ PAG投影LSニューロンはほとんど重複を示さず（拡張データ図8c、e）、これらの領域に投影するLSニューロンがほとんど別個の部分集団を表すことがさらに確認されました。これらのNTLS回路の機能を調査するために、生後5週目のNt-CreマウスのLSにAAV-DIO-ChR2(H134R)を注射し、NAc、AHN、またはPAGにフェルールを移植しました。 3週間後、マウスは閾値下CSDS（stCSDS）を受け、レーザーのオン/オフ順序が相殺される2日間、5分間の若年性RIテスト中に社会的行動がテストされました（図5c）。 NTLS→AHNまたはNTLS→NAc回路の活性化は、少年が開始した受動的な社会的発作中の社会的回避行動に影響を与えることなく、積極的な社会調査時間を短縮しました（図5d–i）。ただし、NTLS→PAG回路の活性化は、社会的調査時間や社会的回避のいずれにも影響を与えませんでした（図5j–l）。 NTLS→AHNまたはNTLS→NAc回路の操作が社会的相互作用を双方向に調節できるかどうかをさらに検証するために、AAV-DIO-eNpHR3.0をLSに注入し、CSDSを実行しました（拡張データ図9a）。 NTLS→AHNまたはNTLS→NAc回路の阻害により、RIテスト中の社会的調査が増加し、社会的回避が部分的に減少することがわかりました（拡張データ図9b-e）。これらの経路が社会的選好を双方向に制御しているかどうかをテストするために、AAV-DIO-ChR2またはAAV-DIO-eNpHR3.0のいずれかを注射し、マウスを社会的敗北ストレスに曝露し、社会的行動中にNTLS→AHNまたはNTLS→NAc回路の光刺激を実行しました。コンディショニングセッション。予想通り、両方の経路の双方向制御がsCPPに影響を与えることがわかりました（拡張データ図9f–m）。 eNpHR3.0 操作は、おそらくシナプス前抑制における有効性が低いため、一般的により微妙な効果があるようです。最近開発された G タンパク質共役型光遺伝学的ツール 44,45 は、将来の研究において長距離シナプス前抑制のためのより説得力のある方法を提供する可能性があります。

a、NTLS ニューロンからの順行性 AAV-DIO-eYFP トレース。 b、順行性 HSV-1 (H129ΔTK-TT) トランスシナプストレース (注射後 70 時間) は、NTLS ニューロンと a に示す領域の間の単シナプス接続を検証します。 c、AAV-DIO-ChR2の注入と常駐侵入者の光遺伝学実験のタイムライン。 d – l、女性のRI検査中のNAc（d）、AHN（g）およびPAG（j）におけるChR2軸索末端活性化（NAc（e）、社会的調査、F（1、12）= 4.836、P = 0.0482。社会的回避、F (1, 12) = 2.935、P = 0.1123、n = 8 (ChR2)、6 (eYFP)、AHN (h)、社会的調査、F (1, 12) = 4.947、P = 0.0461、社会的回避、F (1, 12) = 0.8571、P = 0.3728、n = 8 (ChR2)、7 (eYFP))。 PAG (k)、社会調査、F (1, 13) = 0.6986、P = 0.4183; 社会的回避、F (1, 13) = 0.07324、P = 0.7909、n = 8 (ChR2)、6 (eYFP)。男性の場合（社会的調査、NAc (f)、F (1, 13) = 4.540、P = 0.0528、社会的回避、F (1, 13) = 0.2848、P = 0.6026、n = 9 (ChR2)、5( eYFP); AHN (i)、社会的調査、F (1, 13) = 28.94、P = 0.0001、社会的回避、F (1, 13) = 0.06521、P = 0.8024、n = 8 (ChR2)、7 (eYFP) );PAG (l)、社会的調査、F (1、14) = 0.002038、P = 0.9646;社会的回避、F (1、14) = 1.750、P = 0.2071、n = 9 (ChR2)、6 (eYFP) (f))。すべての比較について、二元配置反復測定 ANOVA を実行しました。 *P < 0.05、**P < 0.01、****P < 0.0001。すべてのデータは平均±標準誤差として表されます。スケールバー、200 μm。 c のイラストは BioRender (https://biorender.com) で作成されました。

ソースデータ

これらの投射が単シナプス性で抑制性であることを確認するために、Nt-Cre マウスのLSにAAV-DIO-ChR2を注射し、ChR2支援によるNTLS→NAcおよびNTLS→AHN経路の回路マッピングを用いたex vivo全細胞電気生理学を実施した。私たちのデータは、両方の経路が単シナプス性（TTXあり）、抑制性（Csベースの内部、0 mVでクランプ）、およびGABAa依存性（SR-95531、ガバジン）であることを示しています（拡張データ図10a、b）。また、15 Hz の青色光刺激が NTLS ニューロンを確実に誘発できることも検証しました (拡張データ図 10c)。 LSの他の細胞タイプがさまざまな条件下でストレス行動を調節できることが報告されているため、AAV-FlpoおよびAAV-CreOffを注射することにより、LSの非NTニューロンも社会的外傷によって誘発される社会的欠損において役割を果たすかどうかをテストしました。 -FlpOn-ChR2ウイルスをNt-CreマウスのLSに導入し、非NTニューロンをChR2で標識する（拡張データ図10d）。まず、Multiplex ISHを使用してこのアプローチの特異性を検証し（拡張データ図10e、f）、ChR2とNTの間の重複はほとんどないことがわかりました。次に、スライス電気生理学を使用してChR2の刺激パラメーターを検証し、15 HzがLSの非NTニューロンを確実に活性化することを確認しました（拡張データ図10g）。次に、CSDS後のRIテスト中にLSの非NTニューロンを生体内で15 Hzで刺激しましたが、社会的相互作用には影響が見られませんでした（拡張データ図10h）。総合すると、これらの結果は、成人海馬神経新生および NAc への抑制性 NTLS 投射の活性化が、外傷性の社会的経験後のマウスの社会的調査と社会的嗜好を変化させるのに必要かつ十分であることを示唆しています。

社会的行動の多くの要素は、その報酬特性を含め、人間とげっ歯類の間で進化的に保存されています46,47。社会的ストレスがうつ病、不安48、心的外傷後ストレス障害38の発症につながることは十分に確立されていますが、社会的ストレスの悪影響、特に社会的報酬に関する悪影響を媒介する神経回路は十分に定義されていません。我々は、ヒトにおける将来の研究に情報を提供するために、トラウマによって損なわれた社会的報酬の潜在的な回路メカニズムを定義できるように、前臨床社会的ストレスモデルがこの初期段階の研究に不可欠であると考えています。

公平なアプローチを利用して、我々はLSが、通常は報酬を与える社会的目標に応答して雄と雌のSUSマウスの両方で活性化される最も高度に調節された領域の1つであることを特定し、それが共通の社会的目標を説明する点で特に重要な領域である可能性があることを示唆した男女ともに現れる欠陥。 LSの詳細な分析により、神経ペプチドニューロテンシンを発現するGABA作動性投射ニューロンの特定の集団が同定された。ストレスを受けていないマウスでは、これらの細胞が、攻撃的な攻撃行動への反応など、脅威にさらされている状況で反応することがわかりました。しかし、SUS マウスに慢性的な社会的トラウマを与えた後、これらのニューロンは、非攻撃性の幼若マウスとの相互作用中など、脅威のない社会的状況に対する反応を一般化していることがわかりました。特に、NTLSおよびDrd3+ニューロンは、ストレス後の社会的行動を制御するために相反する機能を発揮します（図4および参考文献26）。 Drd3+ ニューロンと Nt+ ニューロンは、LS 内で地形的に異なっており、異なる入出力投影パターンを持っている可能性が高く、おそらく LS 内で異なるシナプス接続を形成している可能性もあります。したがって、我々は、NTLS ニューロンが下流の報酬中枢を阻害することにより、社会的報酬の制御において独特の役割を果たしているのではないかという仮説を立てました。実際、順行性追跡研究では、NAc や AHN を含む既知の報酬中枢が NTLS ニューロンからの中程度/密な神経支配を受けていることが特定され、これらの入力の活性化により、幼体との社会的相互作用や状況依存の社会的報酬が減少することが判明しました。

なぜなら、不安は適応的な社会的行動を阻害することがよく知られているからです。重要な問題の 1 つは、NTLS ニューロンが社会的嫌悪感をコード化しているのか、それとも単に社会的行動を損なう全般的な不安状態をコード化しているだけなのかということです。私たちのデータによると、EPM/OFT によって測定される全般性不安状態は、社会的行動の欠陥から分離可能です。 (1) 社会的ストレスにナイーブなマウスの NTLS ニューロンを刺激すると、EPM/OFT に全般性の探索的欠陥を引き起こすことができます (拡張データ図 7); ただし、そのような刺激は社会的ターゲットの回避を誘発しません（拡張データ図6b）。 (2) CSDS モデルの RES マウスと SUS マウスは両方とも、OFT および EPM において不安様行動を示しましたが、SUS マウスのみが社会的回避と社会的報酬の減少を示しました。（3）CVSは全般的な不安様行動の増加を引き起こしますが、社会的相互作用や社会的報酬には影響を与えません（拡張データ図6e、f）。したがって、NTLS ニューロンは、全般的な不安状態の制御に加えて、ストレスや外傷性の過去の経験に関する文脈情報をコード化し、将来の行動反応を導きます。

全体として、我々の発見は、雄と雌の両方のSUSマウスにおいて、報酬を与える社会的対象はストレスまたは脅威として認識され、それがNTLS回路を作動させ、状況に依存した方法で社会的報酬の処理を損なうことを示している。興味深いことに、うつ病と社会不安障害を併発する患者を対象とした研究では、社会的トラウマにより社会的脅威の表現が異常に増加することが示されました49。さらに、トラウマを経験した子どもたちは、脅威に対する知覚の敏感性の高まり、否定的および中立的な感情の誤分類、脅威関連の合図に対する注意の偏りを示すことが報告されています50。したがって、私たちの研究は、外傷後の社会的報酬処理の根底にある神経メカニズムを理解するための重要な基盤を提供します。トラウマの被害者の社会的脅威の認識と報酬の感受性の仲介におけるLS回路の関連性をテストするための将来の人間での研究は、非常に有益となるでしょう。

生後7～8週の野生型C57BL/6Jマウス（雄、22～26g、雌、18～22g；ジャクソン研究所）をCSDS研究の実験マウスとして使用した。生後 4 ～ 6 週目の C57BL/6J マウス (Jackson Laboratory) が、RI テストと sCPP テストの両方で新たな侵入者として使用されました。生後 16 ～ 24 か月の雄 CD-1 (ICR) マウス (性経験豊富な引退ブリーダー; Charles River Laboratories) を雄 CSDS の攻撃者として使用しました。 ERα-Cre マウス (017911、B6N.129S6(Cg)-Esr1tm1.1(cre)And/J; Jackson Laboratory) を CD-1 雌と交配して F1 雄を取得し、これを雌 CSDS の攻撃者として使用しました。 Nt-Cre (01752, B6;129-Ntstm1(cre) Mgmj/J; Jackson Laboratory) ホモ接合マウスを WT C57BL/6 J マウスと交配し、F1 世代を CSDS 研究の実験マウスとして使用しました。同腹子はランダムに実験グループに割り当てられました。実験を開始する前に、すべてのマウスを飼育施設に 1 週間順応させました。 WT CD-1 マウスと F1 ERα-Cre マウスは 1 匹ずつ飼育し、Nt-Cre マウスと WT C57BL/6J マウスは 3 ～ 5 匹のグループで飼育しました。すべてのマウスは、餌と水を自由に摂取できるように、12/12 時間の明暗サイクル (07:00 ～ 19:00) で維持されました。住居および実験室は 20 ～ 22 °C、湿度 40 ～ 60% に維持されました。実験は明期中に行われました。手順は国立衛生研究所のケアガイドに従って実行され、実験動物の使用およびマウントサイナイ施設内動物管理使用委員会のアイカーン医学部によって承認されました。この研究で使用されたマウスに関する追加情報は、Life Sciences Reporting Summary に記載されています。

CSDS および SI 検査のための女性 11 および男性 10 の攻撃者スクリーニングは、前述のように実行されました。実験用オスはCSDS後は単独飼育され、メスはCSDS中は集団飼育されたが敗北後は単独飼育された。侵入者が負傷の兆候を示した場合、敗北は停止されました。全員が男性の CSDS は 1 日あたり 10 分を 10 日間継続し、全員が女性の CSDS は 1 日あたり 5 分を 10 日間継続しました。 stCSDS は、男性では 1 日あたり 5 分間、女性では 2 分間、10 日間継続しました。

CVS は以前の作業から変更されました51。雄マウスと雌マウスをランダムに CTRL グループと CVS グループに割り当てました。 CVS グループは、1 日あたり 1 つのストレッサーで 28 日間ストレスを受けました。ストレッサーは、1 時間の足ショック (1 時間で 60 回のランダムなショック)、1 時間の尾吊り、および 1 時間の拘束で構成されていました。

雄マウスはランダムに CTRL グループと CRS グループに割り当てられました。 CRS グループは、毎日 1 時間の拘束ストレスを 28 日間受けました。幼若臭気対CRSでは、マウスを50 mLの拘束具に拘束し、同性のC57BL/6J幼若マウスの寝具を備えた新しいケージに入れた。

前述のように、SI テストは最後の敗北から 24 時間後に実施されました 10。マウスは試験前に 1 時間試験室に慣れさせ、すべての試験は赤色光条件下で実施されました。 SI テストは、標的のないアリーナ (44 cm (幅) × 44 cm (奥行き) × 38 cm (高さ)) 内を 2.5 分間自由に探索し、その後さらに 2.5 分間標的が存在する場所 (CD-1 またはERα-Creマウス）セッションでは、ターゲットマウスを金網の囲い（10cm（幅）×6.5cm（奥行き）×38cm（高さ））に閉じ込めました。テストアリーナの「インタラクションゾーン」は、金網の囲いの周囲に 8 cm 突き出た 14 cm × 24 cm の長方形のエリアを囲みました。「コーナーゾーン」は、金網筐体に対向する両方のコーナー接合部から突出する９ｃｍ×９ｃｍの領域を包含した。我々は、ターゲットが存在しない状態で費やした時間に対する、CD-1 または F1 ERα-Cre マウスが存在する相互作用ゾーンで費やした時間の比として SI 比を計算しました。 SI比が1を超えるすべてのマウスをRESマウスとして分類し、SI比が1未満のすべてのマウスをSUSマウスとして分類した。コーナー比は、成体のCD-1またはF1 ERα-Cre標的マウスが存在する状態でコーナーゾーンで費やした時間と、標的マウスが存在しない場合に費やした時間の比として計算した。

RI 検査は、以前に説明されたプロトコールを修正したものです52。敗北およびSIの後、マウスを試験前に1時間試験室に慣らし、すべての試験を薄暗い照明条件下で実施した。実験マウスをホームケージに入れ、Ethovision カメラの下に置き、ワイヤーで囲んだケージの上部を取り外して 2 ～ 3 分間慣らした後、侵入者 (マウスまたは物体) をホームケージに入れ、5 分間自由に対話させました ( iDISCO+ コホートの RI テストは、Fos 発現を最大限に刺激するために 10 分間継続しました。社会的調査には、接近、尾行、匂いを嗅ぐなどの活発な交流の量が含まれていました。社会的回避は、実験用マウスの幼体に近づいて調査したときに逃げることとして定義されました。 20cm s-1 を超える速度は逃走とみなされます。 SUS マウスは通常、幼体の接近/調査後の社会的遭遇を避けるために、直ちに 20 ～ 65 cm/s の速度で逃げました。幼体に対して攻撃的な行動を示したすべての実験マウス (約 1%) は分析から除外されました。すべての RI 行動は実験者によって盲目的に採点されました。

以前に公開されたように 53、sCPP プロトコルは、プレテスト、社会的条件付け、ポストテストの 3 つのフェーズで構成されていました。マウスは、条件付けまたは試験の前に 1 時間試験室に慣らされました。すべてのフェーズは、赤色光と音響を減衰させた条件下で実施されました。 CPP 装置 (Med Associates) には、偏りのない侵入を可能にする中立の中間ゾーンと、壁と床が異なる 2 つの調整チャンバーがあります。予備試験日に、マウスを中央のチャンバーに導入し、CPP ボックスの 3 つのチャンバーすべてを 20 分間自由に探索させました。どちらのチャンバーでもバイアスにグループ差は見られず、以前に説明したように、コンディショニンググループは開始側の好みを考慮して偏りのない方法でバランスが取られました 54。条件付け段階は、毎日 2 回の条件付けセッションを含む連続 4 日間で構成されました。午前中のペアのセッション (08:00 ～ 12:00) では、実験マウスを割り当てられた部屋に 15 分間閉じ込め、新しい同性の幼体 C57BL/ を与えました。 6Jイントルーダー。午後の非対セッション (13:00 ～ 17:00) では、マウスを社会的標的のない反対側のチャンバーに 15 分間入れました。メスのsCPPの場合、条件付け中、幼体マウスは金網カップの中に閉じ込められました。これはメスがCPPを形成するために必要であることがわかりましたが、オスはカップの外で幼体と自由に対話できる場合にのみ優先性を形成します。すべてのグループは、コンディショニングチャンバーに対してバランスをとりました。試験後の日に、実験マウスを CPP 装置の中央チャンバーに置き、20 分間すべてのチャンバーを自由に探索させました。 CPP の測定には、いずれかのコンテキスト内で費やされた期間が使用されました。化学遺伝学の実験では、完全なコンディショニングセッション中に CNO を投与しました。 sCPP データの行動分析は、(1) 減算 CPP (侵入者とペアになったチャンバーで費やされたテスト後のフェーズ期間から、侵入者とペアになっていないチャンバーで費やされたテストフェーズ期間を差し引いたもの。テストセッションの行動のみを考慮) を評価することによって実行されました。 (2) プレテストセッションとポストテストセッションの両方におけるグループおよび個人の所要時間。

新規オブジェクト認識 (NOR) およびオブジェクト位置テストは、前述のように実行されました 55。雄マウスを試験前に1時間試験室に慣らした後、空のプレキシガラスのオープンフィールド（45cm（幅）×45cm（奥行き）×38cm（高さ））の中央に薄明かりの下に10分間置きました。（慣れ段階）。馴化段階から 20 分後、マウスを 2 つの物体 (A と B) とともに同じオープンフィールドに置き、10 分間探索させました。次に、マウスをホームケージに20分間戻してから、物体Bを新しい物体Cに置き換えてオープンフィールドに戻しました。マウスは10分間探索させられました。 NOR テストの後、マウスをホームケージに 20 分間戻してからオープンフィールドに戻し、そこで物体 A の位置を変更し、相互作用に費やした時間を記録しました。新しい物体または場所と慣れ親しんだ物体または場所で過ごした時間は、Ethovision ソフトウェアによって記録され、スコア化されました。

EPM は前述のように実行されました 11。雄マウスは、試験前に 1 時間試験室で慣らされ、その後、赤色光の下で 5 分間プレキシガラス EPM の中央に置かれました。迷路の各アームのサイズは 12 × 50 cm2 でした。行動は、Noldus Ethovision (Noldus Interactive テクノロジー) を使用して追跡されました。開いたアームと閉じたアームで費やした合計時間を測定しました。

オープンフィールドテストは前述のように実行されました11。雄マウスは、試験前に試験室で 1 時間慣らされ、その後、赤色光の下でプレキシガラスアリーナ (44 × 44 × 35 cm3) の中央に 10 分間置かれました。 Noldus Ethovision (Noldus Interactive テクノロジー) を使用して行動を追跡し、総移動距離と、外側のゾーンに対する中心 (22 × 22 cm2) で費やした時間を記録しました。

大理石埋め込みテストは前述のように実行されました56。雄マウスは、試験前に 1 時間試験室に慣らされました。新鮮な無香料のマウスのトウモロコシの穂軸床材 (深さ 5 cm) を、フィルター上部カバーを備えた標準的なラットケージ (幅 26 cm × 奥行き 48 cm × 高さ 20 cm) に入れ、その表面に別のケージを挿入しました。寝具の表面に大理石の配置に使用できる平行線を作成します。標準的なガラスのおもちゃのビー玉 (直径 1.6 cm) を 4 つずつ 5 列にして寝具の表面に静かに置きました。ビー玉は、使用前に 70% エタノールで洗浄し、蒸留水ですすぎ、乾燥させました。マウスをケージの隅に導入し、フィルター上部をケージ上で覆った状態で３０分間探索した。大理石は、その表面積の 3 分の 2 が敷物で覆われている場合に埋もれていると評価されます。被験者内計画を使用して、DREADD を操作して 2 日間の大理石埋め込みテストを実施しました。マウスにはCNOまたはビヒクルのいずれかをバランスよく与え、1日目にCNOまたはビヒクルを与え、2日目にその代替を与えた。

RTPP 実験は前述のとおりに実行されました 54: マウスを、中央に仕切りのあるアリーナ (幅 44 cm × 奥行き 44 cm × 高さ 35 cm) の中心に置き、20 分間自由に探索させました。それぞれの面で費やした時間は、Noldus Ethovision (Noldus Interactive technology) を使用して記録されました。テストの最初の 10 分間は、オープンフィールドの片側に 15 Hz の青色光刺激 (473 nm、7 ～ 10 mW、1 秒オン、1 秒オフ) の 20 ミリ秒パルスを組み合わせました。テストの次の 10 分間は、アリーナの反対側にレーザー刺激を組み合わせました。これは、アリーナの片側への固有の偏りを最小限に抑えるために行われました。 2 つのフェーズの間には 1 分の間隔がありました。刺激されていない側と刺激された側で費やされた合計時間を計算して分析しました。

免疫組織化学および iDISCO+ では、マウスを 10% 抱水クロラールの注射によって安楽死させ、氷冷 1× PBS (pH 7.4) で経心臓的に灌流した後、1× PBS 中の冷 4% パラホルムアルデヒドで固定しました。脳を同じ固定液中で 4 °C で 12 時間後固定しました。免疫組織化学のために、ウイルスの配置を評価し、免疫組織化学のために、冠状切片をビブラトーム（ライカ）上で５０μｍで調製した。 ISH では、マウスの脳を迅速に取り出し、-30 °C のイソペンタンで 5 ～ 10 秒間急速冷凍し、クライオスタット (Leica) を使用して 15 μm で切片を作成するまで -80 °C に保ちました。 AAV ウイルスを注射された動物は、注射後少なくとも 4 週間灌流されました。 H129ΔTK-TTを注射された動物は、注射後48時間および70時間灌流されました。

Fos IHC の場合、スライスをブロッキング溶液 (PBS 中の 3% 正常ロバ血清、0.3% Triton X-100) 中で 2 時間インキュベートし、その後一次抗体 (マウス抗 Fos、1:1,000 (Santa Cruz Biotechnology, C) 中で一晩インキュベートしました) -10))、4℃。次に、スライスを PBS で 3 × 20 分間洗浄し、二次抗体 (Cy2 (番号 711-225-152)、Cy3 (番号 711-165-152)、Cy5 (番号 711-175-152)、 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L)、1:1,000 (Jackson ImmunoResearch)) を室温で 2 時間洗浄し、PBS で 20 分間 3 回洗浄した後、DAPI (1 μg mL-1、Sigma) で染色します。 20分次いで、切片をエコマウント（ライフサイエンス）でマウントし、カバースリップをかけた（フィッシャー）。 Fos 分析では、20 倍の倍率とタイルスキャン機能を使用して、関心領域全体を取得しました。 Fos 陽性細胞の解析は、フィジー (NIH)57 を使用して実施されました。ウイルス感染の代表的な画像については、タイルスキャン機能を使用して 10 倍の倍率で画像を取得しました。 ISH の場合、RNAscope Multiplex Fluorescent Kits (Advanced Cell Diagnostics) を製造業者の指示に従って使用しました。簡単に説明すると、新鮮凍結脳を15μmの厚さでスライドマウントし、冷4% PFA中で15分間固定し、50、70、および100% EtOH/H2Oでそれぞれ2分間連続して脱水し、続いて20分間プロテアーゼIV(RNAscope)を行った。処理。 Fos 用の独自プローブ (Advanced Cell Diagnostics) (316921、アクセッション番号 NM_010234.2)。 Sst (404631-C2、アクセッション番号 NM_009215.1)、Gad67 (400951-C2、アクセッション番号 NM_008077.4)、Oxtr (412171-C2、アクセッション番号 NM_001081147.1)、Drd3 (447721-C、アクセッション番号) .NM_007877.1) または Crhr2 (413201-C2、アクセッション番号 NM_009953.3); Nt (420441-C3、アクセッション番号 NM_024435.2) を 40 °C で 2 時間ハイブリダイズさせ、その後 40 °C で一連の増幅ステップを行った (1-FL、30 分、2-FL、15 分、3) -FL、30分、4-FL、15分）。 4 番目の増幅ステップには試薬 Alt-A を使用し、チャンネル 1 は 488 nm、チャンネル 2 は 550 nm、チャンネル 3 は 647 nm で使用しました。最後に、スライドを DAPI で 1 分間処理し、すぐに Eco-Mount でカバースリップをかけました。すべてのスライスは、Zeiss LSM 780 共焦点顕微鏡を使用して画像化されました。すべての ISH および IHC 画像からの細胞と Fo をグループ全体で盲検的にカウントしました。

iDISCO+ 染色プロトコルは http://www.idisco.info から変更されました。固定した全脳を、一次 Fos 抗体 (番号 226003、1:1,000、Synaptic Systems) および二次ロバ抗ウサギ IgG (H+L) 高交差吸着二次抗体、Alexa Fluor 647 (番号 A-31573) とともにインキュベートしました。、1:1,000、Thermo Fisher Scientific）をそれぞれ 7 日間使用します。ズーム本体を備えたＬａＶｉｓｉｏｎライトシート顕微鏡を、ダイナミックフォーカスおよび４μｍのステップサイズで半脳矢状走査に使用した。クリアされた脳は、ClearMap12 を使用して前述のように処理されました。 Fos+ 細胞は、シグナルの強度と形状パラメーターに基づいて最適化および検証された細胞検出パラメーターを使用して、細胞検出モジュールを使用して定量化されました。自己蛍光チャネルは、Elastix ツールボックスを使用してアレン研究所の共通座標フレームワークに合わせて調整されました。脳領域は親領域に折りたたまれていました（たとえば、吻腹側、尾背側、および腹側外側中隔は「外側中隔核」に結合されました）。これらの決定は分析前に行われました。 RES 動物と SUS 動物の細胞数を比較するために、R の MASS パッケージの glm.nb 関数を使用して負の二項回帰を適用しました。グループ分類はダミーコード化されました (SUS グループは 0、RES グループは 1)。最尤係数 α と β は、反復再重み付け最小二乗法によって決定されました。有意な β は、グループのステータスが指定された関心領域の細胞数に関連していることを意味します。拡張データ図 2i の Z 値は、サンプル標準偏差で正規化されたこの β 係数に対応します。誤発見率を下げるために、Benjamini-Hochberg 手順を使用して多重比較の P 値を補正しました。 0.05 未満の Q 値は有意であるとみなされました。

Nt-Cre マウス（生後 4 ～ 5 週齢）に塩酸ケタミン（100 mg kg-1）とキシラジン（10 mg kg-1）の混合物を腹腔内注射して麻酔し、定位固定装置（David Kopf Instruments）上に配置しました。 LS (ブレグマから: AP +0.7 mm; ML ±0.4 mm; DV -3.0 mm) では、33 ゲージのハミルトン針を使用して 0.5 μL のウイルスを 5 分間かけて両側に注入し、注射後 5 分間針を留置したままにしました。。 DREADD ウイルス送達の場合、0.5 μl の AAV8-hSyn-DIO-hM3D-mCherry (2.0 × 1012 vg mL–1、番号 44361-AAV8、Addgene)、AAV9-hSyn-DIO-hM4D-mCherry (2.0 × 1012 vg mL -1、番号 44362-AAV9、Addgene）または AAV9-hSyn-DIO-mCherry（2.0 × 1012 vg mL-1、番号 50459-AAV9、Addgene）を LS に注射しました。順行性トレースの場合、0.5 μL の AAV9-hSyn-DIO-EYFP (2.0 × 1012 vg mL-1、番号 50457-AAV9、Addgene) または 0.15 μL の H129ΔTK-TT (4.0 × 109 vg mL-1、Center for Neuroanatomy)神経向性ウイルスを含む）をLSに片側的に注射した。 LS 下流領域の逆行性追跡のために、0.5 μL の逆行性 AAV-DIO-EGFP/tdTomato (2.0 × 1012 vg mL-1、番号 50457-AAVrg および 28306-AAVrg、Addgene) を NAc の内側部分に注入しました (ブレグマから: AP +1.5 mm; ML ±0.5 mm; DV −4.4 mm)、AHN (ブレグマから: AP −0.7 mm; ML ±0.5 mm; DV −5.0 mm) または PAG (ブレグマから: AP −4.2 mm; DV −4.4 mm) ML ±0.2 mm、DV −2.5 mm）。 CTB 注射の場合、0.5 μL の Alexa Fluor 488 結合コレラ毒素サブユニット B (1.0 mg mL-1、番号 C-34775、Thermo Fisher) を NAc に注射しました (ブレグマから: AP +1.5 mm、ML ±0.5 mm) ; DV −4.4 mm）、0.5 μL の Alexa Fluor 555 結合コレラ毒素サブユニット B（1.0 mg mL-1、番号 C-34776、Thermo Fisher）を AHN に注射しました（ブレグマから: AP −0.7 mm; ML ±0.5 mm; DV −5.0 mm）および 0.5 μL の Alexa Fluor 647 結合コレラ毒素サブユニット B（1.0 mg mL-1、番号 C-34778、Thermo Fisher）を PAG に注入しました（ブレグマから: AP −4.2）。 mm; ML ±0.2 mm; DV −2.5 mm）。オプトジェネティクスの場合、0.5 μL の AAV9-EF1a-DIO-EYFP (3.0 × 1012 vg mL-1、番号 27056-AAV9、Addgene)、AAV9-Ef1a-DIO eNpHR3.0-EYFP (3.0 × 1012 vg mL-1、 no. 26966-AAV9、Addgene) または AAV9-EF1a-DIO-ChR2-EYFP (3.0 × 1012 vg mL-1、no. 20298-AAV9、Addgene) を LS (細胞体刺激) または下流領域 (終末刺激）。 CreOff ウイルス注射の場合、AAV-EF1a-Flpo (2.0 × 1012 vg mL–1、番号 55637-AAV1、Addgene) および AAV-nEF-Coff/Fon-ChR2(ET/TC)-EYFP (2.0 × 1012 vg mL –1、番号 137141-AAV8、Addgene）を 1:1 で混合し、LS に注入しました。すべての AAV 注射は、灌流または行動実験の 3 週間前に実行されました。メスの CSDS で使用されるアグレッサーについては、以前に記載されているように ERα-Cre F1 マウスの VMHv1 を標的にしました 11,58。 FP の場合、0.5 μL の AAV9-CAG-FLEX-G6s/EGFP ウイルス (2.0 × 1012 vg mL-1、番号 100842-AAV9、51502-AAV9 Addgene) を LS に片側注射しました。光遺伝学 (ChR2) および FP 実験では、ウイルス送達と同時にカニューレ (ChR2: MFC_200/240-0.22_3mm_MF1.25_FLT; FP: MFC_200/250-0.57_3mm_MF1.25_FLT) を移植しました (LS 局所の場合はファイバーを移植しました)注射部位の 0.2 mm 上）。 NTLS 末端刺激に関する光遺伝学 (ChR2 および eNpHR3.0) 実験のために、カニューレ (MFC_200/240-0.22_MF1.25_FLT、NAc/AHN の場合は 5 mm、PAG の場合は 3 mm) を NAc に埋め込みました (ブレグマから: AP +1.5 mm; ML ±1.5 mm; DV −4.4 mm、15°の角度）、AHN（ブレグマから：AP −0.7 mm; ML ±1.5 mm; DV −4.8 mm、10°の角度）またはPAG（ブレグマから：AP − 4.2 mm、ML ±0.2 mm、DV −2.3 mm）。光ファイバーをしっかりと固定するために、歯科用セメント (グリップセメント、Dentsply) を頭蓋骨とファイバーの周囲に追加しました。

ERα-Cre マウス（メスの CSDS に使用）には、CSDS11 の 30 分前に CNO（1 mg kg-1、Tocris）を腹腔内投与しました。 OFT、EPM、大理石埋め込み、SI、RI テストでは、CNO はテストの 30 分前に投与されました。 sCPPの場合、CNOは各コンディショニングセッションの30分前に投与されました。

青色 (ChR2) およびオレンジ色 (eNpHR3.0) の光刺激の場合、光ファイバー (BFP(2)_200/220/900-0.22_4m_FCM-2xMF1.25、Doric Lenses) を 473 nm 青色レーザーダイオード (なし) のいずれかに接続しました。 .BCL-473-050-M、Crystal Laser）または 589 nm オレンジレーザーダイオード（No. MGL-III-589-50mW、Opto Engine LLC）（FC/PC アダプター付きパッチコード（No. MFP_200/240）を使用） /900-0.22_4m_FC-MF1.25、ドーリックレンズ)。すべての ChR2 実験について、関数発生器 (番号 33220A、Agilent Technologies) を使用して、15 Hz、1 秒オン/1 秒オフで 20 ミリ秒の青色光パルスを生成しました。 5 分間の常駐侵入者テスト中の eNpHR3.0 実験には、一定のオレンジ色の光が使用されました。 sCPP 研究では、オレンジ色の光が 4 分間オン/1 分間オフのパターンで照射されました。脳に届けられる光の強度は 7 ～ 10 mW でした。これらのパラメータは、以前に検証され公開されたプロトコルと一致しています24。すべての光遺伝学試験では、RI で試験する前に、実験用マウスを 2 日間パッチコードに慣れさせました。 RI 実験では、レーザーのオンとオフの条件下でバランスをとりながら、マウスを 2 日間にわたってテストしました。社会的 CPP テストでは、社会的調整セッション中に光が提供されました。 RTPP テストでは、青色光の照射は、Noldus Ethovision (Noldus Interactive technology) の TTL によって制御されました。

AAV9-hSyn-DIO-EYFP (0.5 ul、2.0 × 1012 vg mL-1、Addgene) を、生後 4 週間の雄 Nt-Cre マウスのLS に両側注射しました。注射の 2 ～ 3 週間後、マウスに CSDS を受けました。スライスの準備前に、すべてのマウスを生後 4 ～ 6 週の同性の幼体の侵入者に 5 分間曝露しました。 RI 試験の約 20 分後、イソフルランを使用してマウスを麻酔しました。脳を迅速に抽出し、( mMで): 87 NaCl、2.5 KCl、1.25 NaH2PO4、4 MgCl2、23 NaHCO3、75 スクロースおよび25 グルコース。回復のために 32 °C で 60 分間置いた後、スライスを、130 NaCl、2.5 KCl、1.2 NaH2PO4、2.4 CaCl2、1.2 MgCl2、23 NaHCO3 および 11 mM を含む酸素添加 (95% CO2/5% O2) aCSF 中に維持しました。その日の残りの時間は室温でグルコースを注入し、記録チャンバーに移し、酸素化aCSFを2〜3 mL min-1で継続的に灌流しました。マイクロピペットプーラー (No. P-97、Sutter Instruments) を使用して薄肉ホウケイ酸ガラスからパッチピペット (4 ～ 7 MΩ) を引き抜き、以下を含むグルコン酸 K (KGlu) ベースのピペット内溶液を充填しました (mM): 116 KGlu、20 HEPES、0.5 EGTA、6 KCl、2 NaCl、4 ATP、0.3 GTP、および 2 mg mL-1 ビオシチン (pH 7.2 に調整)。細胞は、IR-DIC レンズを備えた正立顕微鏡を使用し、白色光源 (Scientifica) で照明されて視覚化されました。顕微鏡の対物レンズを通した470 nm LED (No. pE-300ultra、冷却) 照明を使用して、eYFP+ 細胞を視覚化しました(バンドパスフィルターキューブ、オリンパスを使用)。興奮性は、電流の増分ステップ (各ステップで 0 ～ 100 pA、+10 pA) を注入することにより、電流クランプモードで測定されました。光誘発抑制性シナプス後電流 (oIPSC) を記録するために、AAV9-EF1a-DIO-ChR2-eYFP (0.5 μL、3.0 × 1012 vg mL-1、Addgene) を生後 4 週間の雄 Nt- の LS に両側注射しました。クレマウス。注射後 5 ～ 8 週間で、NAc/AHN の冠状脳スライスを上記のように調製し、次のものを含む内部溶液（mM 単位）を使用して、NAc/AHN ニューロンを電位固定モードで記録しました。120 Cs-メタンスルホン酸塩、10 HEPES、 Na-ホスホクレアチン 10、NaCl 8、TEA-Cl 5、Mg-ATP 4、QX-314 1、EGTA 0.5、Na-GTP 0.4。 NTLS 末端は、顕微鏡 x40 対物レンズ (15 Hz、パルスあたり 5 ms、470 nm、番号 pE-300ultra、CoolLed) を通して刺激されました。単シナプス効果を調べるために、テトロドトキシン (TTX、1 μM、Tocris) の存在下で oIPSC を 0 mV で記録しました。 oIPSCは、ガバジン(番号SR-95531、10μM、Tocris)の浴適用によってブロックされ、シナプス接触のGABA作動性の性質が確認された。全細胞記録は、Digidata 1550 LowNoise 取得システム (Molecular Devices) に接続されたパッチクランプ増幅器 (Axoclamp 200B、Molecular Devices) を使用して実行されました。シグナルをローパスフィルター処理し（Bessel、2 kHz）、データ収集ソフトウェア pClamp 11（Molecular Devices）を使用して 10 kHz で収集しました。電気生理学的記録は、Clampfit (Molecular Devices) を使用して抽出および分析されました。すべてのグループは、敗北後数日までにバランスがとれました。すべての記録は実験条件を無視して行われました。

ファイバー測光は、神経測光マニュアルおよび公開されたプロトコルに従って実施されました59。光ファイバーパッチコード (番号 MFP_200/240/900-0.48_3m_FC-MF1.25、Doric Lenses) を、濃い色の収縮チューブで覆われたキュービックジルコニアスリーブを備えた埋め込みカニューレに取り付けました。光ファイバーケーブルの他端は神経測光 LED ポートに接続されました。システムの制御にはオープンソースの Bonsai プログラムが使用されました。 470 および 415 nm の LED ライトを GCaMP6s シグナルと自己蛍光の測定に使用しました。ファイバー先端の光の範囲は 40 ～ 80 μW であり、テスト日数にわたる試行全体にわたって一定でした。 470 nm と 415 nm の両方のチャネルから 40 fps の同時記録が段階的に達成され、Bonsai によって視覚化されました。ウイルス注射とフェルール移植の 3 週間後、マウスが約 8 週齢のときに、マウスは CSDS と SI を受けました。その後、パッチコードに 2 日間慣れさせ、RI テスト、社会的 CPP コンディショニングセッション、ストレスおよび食物報酬テスト中に Ca2+ 蛍光を記録しました。装置に接続したら、開始する前にマウスを 3 ～ 5 分間休ませて慣らさせました。 RI テストでは、侵入者のいないベースライン活動の 2 分間と、その後の侵入者の暴露の 5 分間の間の Ca2+ 蛍光を記録しました。食べ物の報酬はオープンフィールドで行われ、ピーナッツバターカップはコーナー近くのアリーナに置かれました。すべての食べ物を噛む出来事は手動で採点されました。信号の解析には MATLAB カスタムコーディングが使用されました。 415 nm チャネルはコントロールチャネルとして機能し、自己蛍光、漂白、および動きの影響を排除するために GCaMP6s チャネルから差し引かれました。蛍光の変化 (ΔF/F) を、GCaMP6s シグナルの平均蛍光シグナルのパーセンテージとして計算しました。一般に、これらのモーションアーチファクトは、GCaMP6s 信号全体にほとんど影響を与えませんでした。行動データは、行動ビデオフレームを GCaMP6s 信号フレームで分割することにより、蛍光記録データと位置合わせされました。 RI テストにおける離散的行動中の LS GCaMP6s 活性の分析では、離散的イベント (受動的社会調査) の前後 2 秒間の平均 ΔF/F (%) を比較しました。受動的社会調査は、侵入者が開始した受動的社会的アプローチの瞬間に行われることが決定されました。

使用した統計解析の種類、P 値、n、n が表す内容、自由度、t または F 値など、すべての統計の詳細は図の凡例で確認できます。すべての t 検定、一元配置分散分析、および反復二元配置分散分析は、GraphPad Prism ソフトウェア (GraphPad Software Inc.) を使用して実行されました。一元配置分散分析の後に Tukey の多重比較検定を実行し、二元配置の反復測定 ANOVA 解析の後に Šídák の多重比較検定を実行しました。統計的に有意な差が各図に示されています (*P < 0.05、**P < 0.01、***P < 0.001、****P < 0.0001)。詳細な P 値については、ソースデータを参照してください。 Fos 染色、ISH データ、および RI テスト中の行動ビデオの分析は、実験条件を知らされていない状態で実施されました。サンプルサイズは以前の実験に従って選択されました。拡張データテーブルと補足テーブルについては、Benjamini-Hochberg 手順を使用して多重比較の P 値を補正し、誤検出率を低減しました。 0.05 未満の Q 値は、すべての拡張データテーブルで重要であるとみなされます。

図 2c および拡張データ図 3i は、性別ごとに 3 つの別々のコホートで繰り返され、すべてが同様の結果を示しました。図 5a、b (右) は、3 つの別々の男性コホート (n = 6) と 1 つの女性コホート (n = 2) で繰り返され、すべて同様の結果を示しました。拡張データ図 3j は男女とも 2 回繰り返され、どちらも同様の結果を示しました。拡張データ図 6a は、男女の 4 つの別々のコホートで繰り返され、すべてが同様の結果を示しました。拡張データ図 8a、d（右）および10eは男性のみで2回繰り返され、両方のコホートが同様の結果を示しました。拡張データ図 8b は 3 回繰り返され、すべて同様の結果を示しました。

図１および図２の脳スライスの概略図。 2g、i、j、3a、4a、5a、b および拡張データ図 4d、f、g、7c、8a、b、d、および 10d は、Adobe Illustrator を使用して Allen Brain Atlas Reference から改変されました。

研究デザインの詳細については、この記事にリンクされている Nature Portfolio Reporting Summary を参照してください。

動物行動、ISH、IHC のすべての生データは、ソースデータファイルとして利用できます。 Allen Brain Atlas ISH データベースを使用して、LS の潜在的な分子マーカーを検索しました。

Ca2+ イメージング解析用のすべての MATLAB コードと iDISCO+ 解析用の Python コードは、github (https://github.com/nyclong/2021-07-11642-Nature.git) から入手できます。

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iDISCO+ プロトコルと ClearMap 分析については A. Smith 氏、sCPP テストの検証に関するアドバイスについては M. Flanigan 氏、ライトシートイメージングおよび N.ローマとS.ゲイドスに脳スライスの支援を依頼。この研究は、米国国立衛生研究所の助成金番号によって支援されました。 R01MH114882、R01MH127820、R01MH104559、R01MH120514 および R01MH120637 (SJR)、脳と行動研究財団 (LL への番号 30233、FC への番号 29104、および CM への番号 29699)、カナダ保健研究所 (番号 201811M) FE-414896- 231226 to KLC）およびNIHウイルスセンター（認可番号P40 OD010996）。

米国ニューヨーク州マウントサイナイのアイカーン医科大学、ナッシュファミリー神経科学科

[ PubMed ] Long Li、Romain Durand-de Cuttoli、Antonio V. Aubry、C. Joseph Burnett、Flurin Cathomas、Lyonna F. Parise、Kenny L. Chan、Yuuke Moe、Scott J. Russo

米国ニューヨーク州マウントサイナイのアイカーン医科大学フリードマン脳研究所

[ PubMed ] Long Li、Romain Durand-de Cuttoli、Antonio V. Aubry、C. Joseph Burnett、Flurin Catomas、Lyonna F. Parise、Kenny L. Chan、Carole Morel、Chongzhen Yuan、Yuuke Moe、Hsiao-yun Lin、Junワン＆スコット・J・ルッソ

米国ニューヨーク州マウントサイナイのアイカーン医科大学薬理学科

キャロル・モレル

米国ニューヨーク州マウントサイナイのアイカーン医科大学神経内科

ユアン・チョンジェン、リン・シャオユン、ワン・ジュン

James J Peters VA メディカルセンター、研究開発、米国ニューヨーク州ニューヨーク

ユアン・チョンジェン、リン・シャオユン、ワン・ジュン

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LL と SJR がこのプロジェクトを発案しました。手術は LL、LFP、CM、および RDC によって実行されました。組織の調製は、LL、CJB、FC、LFP、KLC、YS、および H.-YL によって実行されました。 IHC/FISH、顕微鏡画像化/分析、ファイバー測光データの収集と分析は、 LL 行動実験は LL および CY によって実行されました。電気生理学実験は RDC によって実行されました。 iDISCO+ 手順は LL によって実行されました。 iDISCO+ データは AVAJW によって分析されました。知的インプットが提供され、原稿が編集されました。結果は、LL、RDC、AVA、および SJR によって分析および解釈されました。原稿は、LL、RDC、AVA、および SJR によって書かれ、すべての著者によって編集されました。

スコット・J・ルッソへの通信。

著者らは競合する利害関係を宣言していません。

Nature は、この研究の査読に貢献してくれた Dayu Lin、Moriel Zelikowsky、およびその他の匿名の査読者に感謝します。査読者レポートが利用可能です。

発行者注記 Springer Nature は、発行された地図および所属機関の管轄権の主張に関して中立を保っています。

a-f、SUS マウスはより高いコーナー比を示します (一元配置分散分析、メス、F (2, 31) = 29.62、P < 0.0001、n = 10 (CTRL)、12 (RES)、12 (SUS) (a) 、男性、F (2, 46) = 17.58、P < 0.0001、n = 10 (CTRL)、13 (RES)、26 (SUS) (d))、運動活動の欠損は示されませんでした (一元配置分散分析、女性) 、F (2, 31) = 0.8416、P = 0.4406 (b)、男性、F (2, 46) = 0.8416、P = 0.4376、(e)) SI テスト中、最初の社会的試合までの潜伏期間が長かった (1-方法分散分析、女性、F (2, 31) = 8.399、P = 0.0012、(c)、男性、F (2, 46) = 16.63、P < 0.0001、(f)) RI テスト中。 g—l、SI 比と社会的調査時間の相関 (女性、R2 = 0.1728、P = 0.0145 (g)、男性、R2 = 0.1958、P = 0.0015 (j))、社会的回避 (女性、R2 = 0.3399、P = 0.0003 (h)、男性、R2 = 0.1847、P = 0.0021 (k)) および最初の社会的試合までの潜時 (女性、R2 = 0.1464、P = 0.0255 (i)、男性、R2 = 0.1366、P = 0.0090 (l) ））。 m—r、CPP スコアと社会的調査時間の相関 (女性、R2 = 0.2818、P = 0.0012 (m)、男性、R2 = 0.1533、P = 0.0054 (p))、社会的回避 (女性、R2 = 0.1995、P) = 0.0081 (n)、男性、R2 = 0.0911、P = 0.0351 (q)) および最初の社会的試合までの潜伏時間 (女性、R2 = 0.3065、P = 0.0007 (o)、男性、R2 = 0.0318、P = 0.2200 (r) ））。 s、女性の発情周期のさまざまな段階の CPP スコアを差し引くと、発情周期の段階が社会的 CPP 形成に影響を及ぼさないことが示されます (一元配置分散分析、F (3, 20) = 0.5148、P = 0.6768、n = 4 (発情前期)、 6（発情期）、4（中発期）、10（発情期））。 t、女性の社会的CPPのさまざまな社会的ターゲットのCPPスコアを差し引いたもの。 u、CTRL、RES、SUS動物のさまざまな行動パラメータの分布。 ns、重要ではありません。 * P < 0.05、** P < 0.01、*** P < 0.001、**** P < 0.0001。すべてのデータは平均値 ± 標準誤差として表されます。

ソースデータ

a、新規オブジェクト認識 (NOR) テストと新規ロケーションテスト (NLT) の概略図。 b、新規オブジェクト調査時間 (一元配置分散分析、F (2, 29) = 3.041、P = 0.0633、n = 10 (CTRL)、9 (RES)、13 (SUS))、および c、新規ロケーション調査時間 (一元配置分散分析 F (2, 29) = 0.5601、P = 0.5772)。 d、逆の動作テスト順序の概略図。 e、減算CPPスコア（一元配置分散分析、F（2、22）= 3.984、P = 0.0334）、社会調査時間（F（2、22）= 8.267、P = 0.0021）、社会的回避（F（2、22）= 3.984、P = 0.0021） 22) = 9.919、P = 0.0008) および SI 比 (F (2, 22) = 18.32、P < 0.0001、n = 8 (CTRL)、7 (RES)、9 (SUS)。f、g、社会的行動パラメーターCPPスコアによるグループ化後、(f)女性、SI比(両側t検定、t = 1.660、df = 32、P = 0.1067)、社会的調査時間(t = 3.788、df = 32、P = 0.0006) 、社会的回避（t = 3.001、df = 32、P = 0.0052）、潜時（t = 3.204、df = 32、P = 0.0031）、n = 11（CPP-）、23（CPP+）。（g）男性、 SI比（両側t検定、t = 2.298、df = 47、P = 0.0261）、社会的調査時間（t = 2.868、df = 47、P = 0.0062）、社会的回避（t = 2.545、df = 47）、P = 0.0143)、待ち時間 (t = 1.438、df = 47、P = 0.1570)、n = 21 (CPP-)、28 (CPP+)、ns、有意ではありません、* P < 0.05、** P < 0.01、 *** P < 0.001、**** P < 0.0001。すべてのデータは平均値 ± 標準誤差として表されます。

ソースデータ

a-d、女性 iDISCO+ グループの SI 比 (一元配置分散分析、F (2, 27) = 22.25、P < 0.0001、n = 8 (CTRL)、11 (RES)、11 (SUS)) (a)、社会調査時間 (一元配置分散分析、F (2, 27) = 20.24、P < 0.0001) (b)、社会的回避 (一元配置分散分析、F (2, 27) = 7.747、P = 0.0022) (c)最初の社会的試合までの潜伏期間 (一元配置分散分析、F (2, 27) = 6.075、P = 0.0066) (d)。 e—h、男性 iDISCO+ グループの SI 比 (一元配置分散分析、F (2, 25) = 13.85、P < 0.0001、n = 9 (CTRL)、11 (RES)、8 (SUS)) (e)、社会調査時間 (一元配置分散分析、F (2, 25) = 14.07、P < 0.0001) (f)、社会的回避 (一元配置分散分析、F (2, 25) = 38.76、P < 0.0001) (g)最初の社会的試合までの潜伏期間 (一元配置分散分析、F (2, 25) = 7.370、P = 0.0030) (h)。 i、ClearMap cFos 検出検証では、cFos シグナル (赤色の核) と一致するアノテーション (緑色の点) が表示されます。 j、雄の脳スライス cFos 染色検証。cFos+ 細胞のほとんどが外側中隔の外側部分にあることを示しています。 k、男性におけるCSDS後のRI検査中のLS cFosの統計（対応のない両側t検定、CTRL、t4 = 1.434、P = 0.2248、グループあたりn = 3、RES、t4 = 1.957、P = 0.1219、n =グループあたり 3 個、SUS、t9 = 4.429、P = 0.0016、n = 5 (物体)、6 (侵入者))。 ns、有意ではない、* P < 0.05、** P < 0.01、*** P < 0.001、**** P < 0.0001。すべてのデータは平均値±標準誤差として表されます。スケールバー、100μm。

ソースデータ

ａ、ＳＵＳマウスのＬＳにおけるＮｔ＋ｃＦｏｓ＋／Ｎｔ＋（５２０個のニューロンのうち４９２個）とＮｔ＋ｃＦｏｓ＋／ｃＦｏｓ＋（４９６個のニューロンのうち４９２個）の比。 b、c、マルチプレックスISHは、前部、中部、後部LSにおけるNtとGad2の共局在を示します（b）、ニューロテンシンニューロンのほとんどがGABA作動性ニューロンであることを示します（c）。 (マウスあたり n = 3 スライス、グループあたり n = 3 マウス、スケールバー、100 μm)。 d、e、マルチプレックスISHは、LSにおけるNtとCrhr2の共局在を示しています（d）は、NtニューロンとCrhr2ニューロンがLSの前部と中央部で大きく重なっていることを示していますが、LSの後部では非常に低い共局在を示しています（e）。 (マウスあたり n = 3 スライス、グループあたり n = 3 マウス、スケールバー、100 μm)。 f、g、マルチプレックスISHは、NtとDrd3がLSで重複していないことを示しています（マウスあたりn = 3スライス、グループあたりn = 3マウス、スケールバー、50μm）。 h、i、マルチプレックスISHは、LS内で非常に低い重複を示すNtとOxtrを示しています（マウスあたりn = 3スライス、グループあたりn = 3マウス、スケールバー、50μm）。 j、RI試験後のCTRL、RESおよびSUSマウスにおけるSstおよびcFos発現の共焦点画像。 k、3 つのグループ間の Sst+ cFos+ ニューロンの比較 (一元配置分散分析、F (2, 9) = 4.780、P = 0.0385、グループあたり n = 4、スケールバー、100 μm)。 l、メスのCTRL、RESおよびSUSマウス（一元配置分散分析、F（2、6）= 0.2755、P = 0.7683、グループあたりn = 3）とオス（F（2、10））の間のNt-cFos+ニューロンの比較。 = 4.980、P = 0.0316、n = 3–6)。 ns、有意ではない、* P < 0.05。すべてのデータは平均値 ± 標準誤差として表されます。

ソースデータ

a、SUS および RES マウスの CSDS 後の NTLS ニューロンで測定された ex vivo 電気生理学的パラメーターの特性評価。左から右へ: ニューロンあたりの平均静止膜電位の棒グラフ (平均 SUS= -67.49 mV +/- 0.975 mV、n = 55、4 ～ 8 ニューロン/マウス、平均 RES = -61.62 mV +/- 1.73 mV、 n = 19、マウスあたり 4 ～ 7 個のニューロン、両側ウェルチ t 検定、P = 0.0059）。過分極後の活動電位閾値（両側ウェルチ検定、P = 0.3037）、振幅（両側ウェルチ検定、P = 0.6661）、半値幅持続時間（両側ウェルチ検定、P = 0.3757）または速さには差がない。 (fAHP) 振幅 (両側ウェルチ検定、P = 0.7154)。 b、女性におけるCSDS後のファイバー測光コホートの社会的相互作用比（一元配置分散分析、F（2、11）= 5.629、P = 0.0207、n = 4（CTRL）、5（RES）、5（SUS））および男性 (一元配置分散分析、F (2, 14) = 12.93、P = 0.0007、n = 7 (CTRL)、5 (RES)、5 (SUS (5))。 c、摂取中の NTLS ニューロンにおける Ca2+ 活性ピーナッツバターカップ（左）。c の破線は噛み始めを示す。噛み前後の Ca2+ ΔF/F 変化の比較（右、両側対応 t 検定、t = 1.577、df = 4、P = 0.1900）、n = 5) d, ペア (ピンク) およびペアでない (青) コンディショニングチャンバーにおける Ca2+ トレース。挿入図は、ペアとアンペアのコンディショニングセッション間の正規化された曲線下面積 (AUC) を示しています (男女混合、ペア両側 t 検定) 、CTRL、t = 0.1977、df = 5、P = 0.8511、RES、t = 1.049、df = 5、P = 0.3423、SUS、t = 5.453、df = 5、P = 0.0028)、グループあたり n = 6) 。 ns、有意ではない、* P < 0.05、** P < 0.01、*** P < 0.001。すべてのデータは平均値 ± 標準誤差として表されます。

ソースデータ

a、NTLS ニューロンにおける AAV-DIO-DREADD の発現。 b、ストレスナイーブマウスのNTLS活性化は、雌（対応のない両側t検定、t14 = 1.044、P = 0.3141、グループあたりn = 8）または雄（対応のない両側t検定、 t14 = 1.434、P =0.3975、グループあたり n = 8)。ストレスナイーブマウスにおける NTLS 活性化は、雌 (対応のない両側 t 検定、t14 = 0.3473、P = 0.7335、群あたり n = 8) または雄 (対応のない両側 t 検定、t14 = 1.425、P = 0.1762、グループあたり n = 8)。 c、ストレスナイーブマウスにおけるNTLS化学遺伝学的活性化は社会的選好を変化させない（二元配置反復測定ANOVA、溶媒、F = (1, 16) = 7.198、P = 0.0163、n = 9、CNO、F (1, 18) ) = 6.644、P = 0.0190、n = 10)。 d、ビヒクルとCNOグループ間の減算CPPスコアの比較（対応のない両側t検定、t = 0.03518、df = 17、P = 0.9723、グループあたりn = 10）。 e、CVS および CPP テストの概略図。 f、いずれかの性別における sCPP に対する CVS の効果 (二元配置反復測定 ANOVA、女性、CTRL、F (1, 22) = 4.824、P = 0.0389、n = 12、CVS、F (1, 22) = 5.172、P = 0.0331、n = 12; 男性、CTRL、F (1, 22) = 5.042、P = 0.0351、n = 12; CVS、F (1, 22) = 3.900、P = 0.0610、n = 12)。 g、RTPPテスト中のウイルス注入とNTLSニューロンの光遺伝学的操作の概略図。 h、NTLS ニューロンの活性化は、ストレスを受けていない女性のリアルタイムの場所の好みを変えません (対応のある両側 t 検定、ChR2、t11 = 0.06179、P = 0.9518、n = 12、EYFP、t15 = 0.01923、P = 0.9849) 、n = 16）または男性（対応のある両側 t 検定、ChR2、t8 = 0.3855、P = 0.7099、n = 9; EYFP、t8 = 0.6333、P = 0.5442、n = 9）。 ns、重要ではありません。 * P < 0.05。すべてのデータは平均値±標準誤差として表されます。スケールバー、100μm。 BioRender を使用して、c、e、g の概略図を生成しました。

ソースデータ

a、慢性拘束ストレスとRI検査の模式図。 b、最初の調査までの潜伏期間（対応のない両側 t 検定、t = 3.142、df = 18、P = 0.0056）および調査の回数（t = 5.259、df = 18、P < 0.0001）と a の比較。新しい拘束チューブの挿入、またはチューブからの離脱（t = 5.229、df = 18、P < 0.0001）、n = 10、対照動物（CTRL）と慢性拘束ストレス動物（CRS）の間。 c、RI テスト中の DREADD 操作による CRS の概略図。 d、新しい拘束チューブを使用した潜時（対応のある両側 t 検定、t = 2.065、df = 8、P = 0.0728）および調査試合数（t = 2.619、df = 8、P = 0.0307）、またはチューブからの抜去（t = 1.988、df = 8、P = 0.0820）、n = 9。e、若年性寝具/臭気（CRSO）およびRIテストによる慢性拘束ストレスの概略図。 f、新しい拘束チューブまたは離脱を使用した潜時（対応のない両側 t 検定、t = 0.5452、df = 18、P = 0.5923）および調査試合数（t = 0.3971、df = 18、P = 0.6960）チューブから（t = 0.000、df = 18、P > 0.9999）、n = 10.g、ストレスナイーブ雄マウスの NTLS 活性化は、高架十字迷路でのより高い不安様行動を引き起こします（対応のない両側 t-テスト、t14 = 2.824、P = 0.0135、グループあたり n = 8)。 h、ストレスナイーブ雄マウスにおける NTLS の活性化または阻害はビー玉埋め込み行動を調節する (両側対応 t 検定、hM3Dq、t7 = 4.631、P = 0.0024、n = 8; hM4Di、t7 = 4.020、P = 0.0051、n) = 8)。 i、ストレスナイーブ雄マウスにおける NTLS の活性化または阻害は、オープンフィールド試験 (対応のない両側 t 検定、hM3Dq、t14 = 2.189、P = 0.0461、n = 8 perグループ; hM4Di、t14 = 1.424、P = 0.1762、グループあたり n = 8)。 j、運動量の変化なし（対応のない両側 t 検定、hM3Dq、t14 = 1.641、P = 0.1230; hM4Di、t14 = 1.566、P = 0.1398）。 ns、重要ではありません。 * P < 0.05、** P < 0.01、**** P < 0.0001。すべてのデータは平均値 ± sem として表されます。a、c、e、i の概略図の生成には BioRender を使用しました。

ソースデータ

a、H129ΔTK-TTウイルス注入の概略図。注射の 48 時間後、NTLS ニューロンの下流領域には tdTomato+ ニューロンは存在しませんでした。 b、逆行性 AAV-DIO-EGFP/tdTomato トレース検証は、NTLS→NAc、NTLS→AHN、NTLS→PAG モノシナプス接続を示します。 c、NAc/AHN/PAGへの重複するNTLS投影ニューロンの共局在解析。 d、NTLS→NAc、NTLS→AHN、およびNTLS→PAG投影のコレラ毒素サブユニットb（CTB）トレース。 LSの代表的な画像（中央パネル）。黄色の矢印は、NAcとAHNの両方に投影しているニューロンを示しています。白い矢印は、PAG と AHN の両方に投射するニューロンを示します。 e、3 つの下流領域からの CTB トレーサーの共局在を示す投影の数 (マウスごとに脳領域ごとに 3 つのスライス、n = 3 マウス)。すべてのデータは平均値±標準誤差として表されます。スケールバー、100μm。

a、NpHR を使用した NTLS ターゲティングと社会的行動テスト中の操作の概略図。 b〜e、NAc（b、c）およびAHN（d、e）におけるNpHR軸索末端阻害は、両方の女性の社会的調査時間を軽減し、社会的回避を部分的に軽減しました（b、社会的調査、F（1、14）= 3.484、 P = 0.0831、グループあたり n = 8、社会的回避、F (1, 14) = 1.180、P = 0.2956、グループあたり n = 8、d、社会的調査、F (1, 14) = 4.982、P = 0.0425、グループあたり n = 8、社会的回避、F (1, 14) = 2.266、P = 0.1545、グループあたり n = 8) および男性 (c、社会的調査、F (1, 14) = 0.2046、P = 0.6580、n = グループあたり 8、社会的回避、F (1, 14) = 1.214、P = 0.2891、グループあたり n = 8、e、社会的調査、F (1, 14) = 4.597、P = 0.0501、グループあたり n = 8 ; 社会的回避、F (1, 14) = 5.359、P = 0.0363、グループあたり n = 8)。 fm、男女における社会的CPP条件付け中のNTLS→NAcおよびNTLS→AHN回路の光遺伝学的操作。 f、RES女性におけるChR2による社会的報酬のブロックによるNTLS→NAcの活性化（EYFP、F（1、12）= 2.362、P = 0.1502、n = 7、ChR2、F（1、14）= 0.5543、P = 0.4689、 n = 8) g、NpHR による NTLS→NAc の阻害は、SUS 女性の社会的報酬不足を救済した (EYFP、F (1、14) = 0.5105、P = 0.4867、NpHR、F (1、14) = 4.183、P = 0.0601 、グループあたり n = 8)。 h、RES女性におけるChR2による社会的報酬のブロックによるNTLS→AHNの活性化（EYFP、F（1、12）= 4.289、P = 0.0606、n = 7、ChR2、F（1、14）= 0.0001296、P = 0.9911、 n = 8)。 i、NpHRによるNTLS→AHNの阻害は、SUS女性における社会的報酬の欠乏を救済した（EYFP、F（1、14）= 0.1068、P = 0.7487、NpHR、F（1、14）= 4.575、P = 0.0505、n = 8）グループごと）。 j、RES男性におけるChR2ブロックによる社会的報酬によるNTLS→NAcの活性化（EYFP、F（1、12）= 5.703、P = 0.0343、n = 7、ChR2、F（1、14）= 0.2484、P = 0.6259、 n = 8)。 k、NpHRによるNTLS→NAcの阻害は、SUS男性における社会的報酬の欠乏を救済した（EYFP、F（1、14）= 4.053、P = 0.0637、NpHR、F（1、14）= 4.140、P = 0.0613、n = 8）グループごと）。 l、RES男性におけるChR2による社会的報酬のブロックによるNTLS→AHNの活性化（EYFP、F（1、12）= 6.329、P = 0.0271、n = 7、ChR2、F（1、14）= 0.1567、P = 0.6981、 n = 8)。 m、NpHRによるNTLS→AHNの阻害は、SUS男性の社会的報酬欠乏を救済した（EYFP、F（1、12）= 0.6881、P = 0.4230、NpHR、F（1、14）= 10.02、P = 0.0069、n = 8）グループごと）。この図の比較については、二元配置反復測定 ANOVA を実行しました: ns、有意ではありません。 * P < 0.05、** P < 0.01。すべてのデータは平均値 ± sem として表されます。BioRender を使用して、a の概略図を生成しました。

ソースデータ

a、b、NTLS→NAcおよびNTLS→AHN経路のChR2支援回路マッピング。 5/8 NAc/NDB ニューロンおよび 4/10 AHN ニューロン。 c、470 nmの青色光（左）および15 Hzのパルス誘起スパイク（右）で1秒照射したときの、電圧クランプモード（-70 mVでクランプ）のChR2-EYFP+ Cre+ニューロンにおける光誘発内向き電流。 d、社会的行動テスト中の非NTLSニューロン感染と操作の概略図。 e、f、Nt および CreOff-ChR2-EYFP のマルチプレックス ISH。 c、EYFP + ニューロン間のNt + EYFP + ニューロンの重複（マウスあたり2〜3スライス、n = 5マウス）。 g、青色光（470 nm）で1秒照射したときの電圧クランプモード（-70 mVでクランプ）のChR2-EYFP+非Creニューロンにおける光誘発内向き電流。 h、RI 検査中の社会的調査および社会的回避に対する非 Nt ニューロンの ChR2 刺激の効果 (混合効果分析二元配置分散分析、左、F (1, 13) = 0.2137、P = 0.6516、右、F (1) 、13) = 0.5672、P = 0.4648、n = ChR2 (10)、EYFP (5))。 ns、重要ではありません。すべてのデータは平均±標準誤差として表されます。スケールバー、50 μm。

ソースデータ

SUS と CTRL の男性の間で有意な差を示す領域 (iDISCO+ 分析)。

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転載と許可

Li、L.、Durand-de Cuttoli、R.、Aubry、AV 他。社会的トラウマは側方中隔回路に影響を及ぼし、社会的報酬を遮断します。 Nature 613、696–703 (2023)。 https://doi.org/10.1038/s41586-022-05484-5

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受信日: 2021 年 7 月 19 日

受理日: 2022 年 10 月 25 日

公開日: 2022 年 11 月 30 日

発行日: 2023 年 1 月 26 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s41586-022-05484-5

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