Pseudomonas mosselii 923 由来の天然ピラゾロトリアジン プソイドヨージニンは、植物の細菌性および真菌性病原体を阻害します

Nature Communications volume 14、記事番号: 734 (2023) この記事を引用

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主にシュードモナス属のような土壌生息微生物によって生産される天然産物は、抗菌代謝産物と殺虫剤の一貫した供給源です。 本明細書では、水田のイネ根圏土壌から、植物細菌性病原体ザントモナス種および真菌病原体マグナポルテ・オリゼの増殖を特異的に阻害するシュードモナス・モセリ923株を単離したことを報告する。 抗菌化合物は、高分解能質量スペクトル、核磁気共鳴、単結晶 X 線回折を使用して精製され、擬似ヨージニンとして同定されます。 ゲノムワイドなランダム突然変異誘発、トランスクリプトーム解析、生化学的アッセイにより、シュードヨージニン生合成クラスターは psdABCDEFG として定義されます。 擬似ヨージニン生合成はグアノシン三リン酸から開始すると考えられており、1,6-ジデスメチルトキソフラビンは生合成中間体です。 トランスポゾン突然変異誘発は、GacA が全体的な調節因子であることを示しています。 さらに、2 つの非コード低分子 RNA、rsmY および rsmZ はシュードヨージニン転写を正に制御し、炭素貯蔵制御因子 CsrA2 および CsrA3 は psdA の発現を負に制御します。 発酵に使用する培地の最適化、生合成オペロンの過剰発現、および CsrA 結合部位の除去により、シュードヨージニン生成の 22.4 倍の増加が達成されます。 923株と植物の精製プソイドヨージニンは両方ともイネ宿主に影響を与えることなく病原体を阻害することから、プソイドヨージニンが植物病害の防除に使用できることが示唆された。

米（Oryza sativa L.）は世界的に重要な主食作物であり、食糧農業機関（FAO）によって食料安全保障のための戦略的作物とみなされています1。 残念ながら、米生産は、Xanthomonas oryzae pv.によって引き起こされる細菌性葉枯病（BLB）、細菌性葉条病（BLS）、イネいもち病などの壊滅的な病気を含む複数の制約によって妨げられています。 オリゼ (Xoo)、X. オリゼ pv. oryzicola (Xoc)、および Magnaporthe oryzae それぞれ 2、3。 現在、耐病性 (R) 遺伝子を持つイネ品種の栽培は、他の管理スキームよりも X. oryzae を制御するためのより良い選択肢であると考えられています 2,4。 ただし、中国で栽培されている品種は一般に病原体に感染しやすいです5。 イネの病気を防除するために化学殺菌剤や殺菌剤が頻繁に使用されていますが6、それらの使用は汚染、薬剤耐性、病原体の復活をもたらしています7,8。 環境に優しい制御アプローチは、抗生物質、シデロフォア、揮発性化合物などの生理活性二次代謝産物を生成することによって病原体を抑制できる生物制御剤 (BCA) として拮抗細菌を使用する可能性です9。

天然物（NP）は、抗菌代謝産物および医薬品リードの一貫した供給源であり、主に土壌に生息する微生物によって生産されます10、11。 シュードモナス種は、土壌、水、動物、植物の根圏に存続するグラム陰性細菌です。 シュードモナス属は、フェナジン、ピロール誘導体、2,4-ジアセチルフロログルシノール (2,4-DAPG) および成長促進物質を含む多くの抗菌性 NP を生成するため、環境ストレスによく適応し、植物病原体の BCA として適しています 12。 シュードモナス属の多くの二次代謝産物は、GacS/GacA 2 成分系 (TCS)13、非コード低分子 RNA (sRNA)、および CsrA/RsmA タンパク質 14 によって制御されています。 ゲノム配列決定の出現により、現代の農業 16 と人間の健康 17 に利益をもたらす多数の抗菌薬が地球規模のマイクロバイオーム 15 で発見されています。 しかし、多剤耐性病原体 18 の開発が進行しているため、作物の細菌性および真菌性疾患を制御するための新しい NP を発見する緊急性が高まっています。

天然に存在する複素環ピラゾロ[4,3-e][1,2,4]トリアジンファミリーのメンバーは、フルビオール 20、ノストシン A21 およびプソイドヨージニン 22 を含め、過去 40 年にわたって単離され、特徴付けられてきました 19。 擬似ヨージニン構造には、ピラゾール環と 2 つのメチル基が融合した 1,2,4-トリアジン部分が含まれています。 ピラゾロトリアジンファミリーの誘導体は、抗腫瘍、抗ウイルス、抗菌活性などの幅広い生物学的機能を示します 23,24。 特に、シュードヨージニンは肉腫に対して強力な抗腫瘍活性を示しました25。 興味深いことに、プソイドヨージニンの生合成経路および生合成遺伝子クラスター (BGC) はまだ解明されておらず、合成生物学および生理活性誘導体の開発にとって豊富なリソースのままです。

この研究では、P. mosselii 923 株を X. オリゼと M. オリゼの阻害についてスクリーニングし、拮抗化合物がシュードヨージニンであることを確認しました。 擬似ヨージニンの構築に関与する生合成オペロンが同定されました。 グアノシン三リン酸 (GTP) は前駆体であり、1,6-ジデスメチルトキソフラビン (1,6-DDMT) はプソイドヨージニンの生合成中間体であることが示されています。 シュードヨージニンの制御は、GacA、rsmY/Z、および CsrA123 によって媒介され、シュードヨージニン過剰生産株を遺伝的に生成することが示されています。 この結果は、プソイドヨージニンがイネの細菌性および真菌性疾患の防除に有効であることを示しており、イネの病原菌を防除するための潜在的な選択肢の範囲が拡大します。

植物が根圏で病原体を抑制するために有益な細菌を動員することは十分に確立されています26。 そこで我々は、土壌細菌がイネ病原菌Xoo PXO99A、Xoc RS105、M. oryzae R01-1の増殖を抑制できるかどうかを調べた。 中国の 23 省から収集した 248 の根圏サンプルから、合計 223 の培養可能な細菌分離株が得られました。 これらは、インビトロでの拮抗活性について検査された。 923 という名前の細菌分離株は、Xoo PXO99A、Xoc RS105、および M. オリゼ R01-1 に対して強い阻害活性を示し (図 1a、b)、阻害は一般に Xoc よりも Xoo 株の方が大きかった (補足図 1a、b)。 。 さらに、923株は、他の11種類のザントモナス病原体に対してさまざまなレベルの拮抗作用を示しました（補足図1c）。

a、b 共培養アッセイにおける Xoo PXO99A、Xoc RS105、および M. オリゼ分離株 R01-1 に対する 923 株の拮抗活性。未処理の 923 株を対照 (CK) として使用しました。 c 温室内での接種後7日目（dpi）での923株、ΔpsdAまたは923 SUP株を接種したYuanfengzao米のXoc RS105-Gus病斑の長さ。 「Pre」は、病原体接種前に水（MOCK-Pre）、923、ΔpsdA、または923 SUP（上清）で前処理されたイネの葉を表します。 「Tre」は、Xoc RS105-Gus を接種し、その後水 (MOCK-Tre)、923、ΔpsdA または 923 SUP で処理したイネの葉を表します。 d イネ葉における Xoc RS105-Gus の個体群動態。 細菌集団は、GUS 定量化および 7 dpi での組織化学的染色によってモニタリングされました。 エラーバーは平均値 ± SD (n = 3 つの独立した葉) と ***P < 0.001、***P = 6.4 × 10−14、= 3.2 × 10−15、= 8.3 × 10−15、= での有意差を示します。 c の順に 5.5 × 10−16、***P < 0.001、***P = 1.3 × 10－25、= 2.4 × 10－26、= 1.8 × 10-25、= 3.6 × 10-26 の順d の ns は有意ではありません (P > 0.05)。 e、f 923株および（e）Xoo PXO99Aまたは（f）Xoc RS105を接種した野外栽培イネの病変領域。 病変面積は15 dpiで決定されました（n = 15の独立した葉、平均±SD）、***P < 0.001、***P = 1.2×10−15、= 1.3×10−14 eの順序で。 ***P < 0.001、***P = 4.7 × 10−13、f の順序で = 3.2 × 10−11。 ns、有意ではありません (P > 0.05)。 Xoc または Xoo を接種した病変領域の統計的有意性は、LSD 検定法と一元配置分散分析を使用して決定されました。 中央のバーは平均を表し、ボックスとひげの最小値から最大値が使用されました。 実験は独立して 3 回繰り返され、同様の結果が得られました。

株 923 が植物の Xoo および Xoc の成長を阻害するかどうかを調べるために、温室で生物防除実験が行われました。 923株または上清（SUP）のいずれかを前処理（Pre）として適用した場合、病変の長さは対照より約50％小さくなり（図1c）、これは定量的なGUSアッセイの結果と一致しました（図1d） ）。 さらに、株923による処理前および処理後の両方で、それぞれXooおよびXocによって畑のイネの葉に生じた病斑が著しく小さくなりました（図1e、f）。 これらの結果は、923 株が細菌性病原体に対する効果的な生物防除剤 (BCA) であることを示唆しています。

株923を同定するために複数のアプローチが使用された。16S rRNA配列の系統解析により、923がシュードモナス属のメンバーであり、99.6％類似しているP. mosselii DSM17497とグループ化されることが示された（補足図2b）。 株923の分類学的分類をさらに確認するために、全ゲノムの配列が決定されました（補足図2a）。 ゲノムベースの平均ヌクレオチド同一性 (ANI) 分析により、P. mosselii DSM17497 と比較した場合、923 ゲノムの ANI 値は 99.25% であることが示されました。 これは種境界の閾値である 95% よりも高く、923 株が P. mosselii であることが確認されました。 追加の系統ゲノムアッセイにより、これらの結論がさらに裏付けられました（補足図2c）。

抗生物質を産生する細菌は、一般に、標的病原体を重ねた培地にスポットされると阻害ゾーンを生成します27。 さまざまな有機溶媒を使用して株 923 培養物から抽出物を調製し、これらを Xoo PX099A を播種したプレートにスポットしました。 酢酸エチル抽出物は、Xoo PX099A オーバーレイにスポットされた場合に最大の阻害ゾーンを生成しました (補足図 3a)。 さらに、酢酸エチル抽出物をC18逆相シリカゲルカラムに供して、A1〜A12としてラベル付けした12の画分を得た。 生物活性プロファイルに基づいて、画分A1およびA5〜A6をC18カラムでの分取HPLCによってさらに精製して、化合物PM-1〜PM-7を得た（図2aおよび補足図3a）。 7 つの精製化合物のうち、PM-3 のみが Xoo PX099A に対して顕著な阻害活性を示しました (図 2b)。 PM-3の分子式は、高分解能質量スペクトル（HRMS）によってC6H7N5Oであると決定されました（m / z 166.0722 [M + H] +、C6H8N5Oについて計算、166.0729）（補足図4）。 核磁気共鳴（NMR）データ（補足図5〜8）および単結晶X線回折（図2cおよび補足表1）により、擬ヨウ素と同一であるPM-3の構造がさらに確認されました。 さらに、PM-3 (擬似ヨージニン) は、X. Campestris pv. を含む他の多くの病原性 Xanthomonas 種に対して効果を示しました。 ファセオーリ、X. カンペストリス pv. malvacearum および X. citri subsp. citri（補足図3d）。

a PXO99Aを阻害する株923化合物からの抽出および単離のフローチャート。 略語と構造は次のとおりです。PE、石油エーテル。 ＥｔＯＡｃ、酢酸エチル； NBA、n-ブチルアルコール。 MeOH、メタノール; 化合物: PM-1、C16H18N2O; PM-2、C15H16N2O; PM-3、C6H7N5O; PM-4、C15H16N2O2; PM-5、C5H5N5O; PM-6、C16H26O3; およびPM-7、C18H30O3。 b Xoo PXO99A に対する化合物 PM-1 ～ PM-7 の抗菌活性。 メタノールを陰性対照として使用した。 c PM-3 の X 線 ORTEP 図面。

MIC (最小阻害濃度) および EC50 (50% 阻害に有効な濃度) アッセイでは、プソイドヨージニンが他の 11 種のザントモナス属よりも Xoo PX099A および Xoc RS105 に対して毒性が高いことが示されました。 MICはそれぞれ0.5および4μg/mL、EC50値は0.17および1.36μg/mLでした（補足図9a、bおよび表1）。 シュードヨージニンはまた、M. オリゼ R01-1 の増殖を阻害し、MIC 値と EC50 値はそれぞれ 8.25 μg/mL と 4.43 μg/mL でした（補足図 9c）。

以前の研究では、フェナジン-1-カルボン酸（PCA; シェンチンマイシンとしても知られる）が中国における BLB および BLS の制御に効果的な殺菌剤であることが実証されました 28,29。 驚くべきことに、我々の結果は、プソイドヨージニンの MIC 値と EC50 値が PCA よりも大幅に低いことを示し (表 1)、環境に優しい生物農薬としてのプソイドヨージニンの可能性をさらに裏付けています。

P. mosselii 923 とシュードヨージニンが病原体 Xoc および Xoo を阻害する能力について検査され、15 dpi でイネの葉の病変面積を大幅に減少させることが示されました（補足図 10a-c）。 一方、イネの葉の細菌数の測定では、Tre（処理）またはPre処理により、14および21 dpiでXooおよびXocによるコロニー形成が大幅に減少したことが示されました（補足図10b-d）。 シュードヨージニンがイネの葉を病害から保護するのに十分であるかどうかを確認するために、イネの苗木と成体植物でP. mosselii 923の変異体ΔpsdAとWTの生物防除活性を再試験しました。 欠失変異体ΔpsdAを接種した葉は、病斑の長さとMOCK処理と同等のGUS活性を示しました（図1c、d）。 一方、植物における Xoo の成長阻害に対する変異体 ΔpsdA、WT P. mosselii 923、およびシュードヨージニンの効果をテストしました。 予測どおり、欠失変異体ΔpsdAはMOCK処理と同様のサイズの病変を誘発し（補足図11）、植物の保護に貢献するのはプソイドヨージニンのみの必要性を意味します。 プソイドヨージニンの有効性は、0 ～ 20 μM の濃度を適用し、前処理または後処理として Xoo PXO99A を接種した野外栽培のイネの病気を評価することによってさらに分析されました。 5μMを超える濃度のシュードヨージニンは病変サイズの大幅な減少を引き起こし（補足図3b、c）、シュードヨージニンがイネ組織におけるXoo PXO99AおよびXoc RS105の増殖を効果的に阻害することを示しています。 興味深いことに、シュードヨージニンは真菌M. oryzae R01-1によって引き起こされるイネいもち病の病変面積も大幅に減少させることを観察しました（補足図12）。 上記のデータは、この化合物がイネの細菌性疾患と真菌性疾患の両方に対して有望な生物農薬であることを示しています。

シュードヨージニンは最初に P. fluorescens var. で同定されましたが、 シュードヨージニン22、その合成に関与する遺伝子は特徴付けられていませんでした。 P. mosselii 923 のゲノムは、antiSMASH プログラム 30 (https://antismasash.secondarymetabolites.org/) を使用して二次代謝産物について分析されました。 しかし、どのクラスターが擬似ヨージニン生合成に関連しているかは不明でした。

シュードヨージニン経路の遺伝子を同定するために、EZ-Tn5 トランスポソーム システムを使用して P. mosselii 923 にランダムな変異を生成しました。923 株の約 10,000 個の変異体を Xoo PXO99A に対する抗菌活性についてスクリーニングしましたが、変異体 34-6 には Xoo PXO99A に対する抗菌活性がありませんでした。 in vitro での拮抗活性 (図 3a)。 ゲノム内の gacA にマッピングされた変異体 34-6 の単一コピー Tn5 挿入の位置 (図 3a)。 興味深いことに、gacA はシュードモナス属の種で高度に保存されている応答制御因子をコードしています。 2 要素規制システム (TCS) ファミリーに属します13。 擬似ヨージニン合成における gacA の機能をさらに確認するために、二重相同組換えによって P. mosselii 923 から完全な gacA が欠失したマーカーレス ノックアウト変異体を生成しました。 得られた変異体では擬似ヨージニン産生が消失し、これをΔgacAと名付けた（補足図13b、c）。 トランスのgacAによるΔgacA変異体の相補により、抗菌活性と擬似ヨージニン産生が野生型レベルに回復しましたが、トランスのgacAの過剰産生は株923における擬似ヨージニンの産生を増加させませんでした（補足図13a〜c）。 これらの結果は、GacA がシュードヨージニン生合成を調節し、シュードモナス属における他の二次代謝産物の調節における GacA の役割と一致していることを示唆しています 13,31,32。

a P. mosselii 923 の変異体 34-6 は、Xoo PXO99A に対する抗菌活性を欠き、gacA に Tn5 挿入を含んでいます。 b P. mosselii 923、ΔpsdA、ΔpsdB、ΔpsdC、ΔpsdD、ΔpsdE、ΔpsdFおよびΔpsdG変異体およびそれらの対応する相補株（CΔpsdA〜CΔpsdG）の抗菌活性アッセイ。 c 変異体ΔpsdA、ΔpsdB、ΔpsdC、ΔpsdD、ΔpsdE、ΔpsdF、およびΔpsdGのHPLC分析（方法B、500 nmで検出）。 d 相補変異体CΔpsdA〜CΔpsdGのHPLC分析(方法B、500nmで検出)。 e P. mosselii 923の擬似ヨージニン生合成遺伝子クラスターの概略図。遺伝子名の上の数字はORFの長さを示します。 色は次のように遺伝子機能を示します。赤色、一次生合成遺伝子。 灰色、追加の生合成遺伝子。 7 つの遺伝子の注釈は次のように表示されます: psdA、メチルトランスフェラーゼ タイプ 12。 psdB、グリオキシラーゼ ブレオマイシン耐性タンパク質、ジオキシゲナーゼ スーパーファミリー タンパク質。 psdC、スルファターゼ修飾因子タンパク質。 psdD、GTPシクロヒドロラーゼ。 psdE、WD-40リピートタンパク質。 psdF、メチルトランスフェラーゼドメイン。 psdG、リボフラビン生合成タンパク質 RibD。

シュードヨージニン生成に関与する生合成遺伝子クラスターをさらに同定するために、P. mosselii 923 (WT) と ΔgacA ノックアウト (KO) 変異体のトランスクリプトームを比較しました。 この結果により、gacA変異体では604個の遺伝子が下方制御されていることが明らかになった（補足図13d、e）。 そして、29の差次的に発現された遺伝子（DEG）は、KO変異体と比較してWTで高度に上方制御されました（補足図14および補足表2）。 RNA-seqデータを検証するために、RT-qPCR分析による二次確認のために15個のDEGがランダムに選択されました（補足図15）。 19 個の遺伝子が自殺ベクター p2P24Km にクローン化されており、補足データ 1 に p24-orf2059 ～ p24-orf2077 としてリストされています。 これら 19 個の遺伝子を欠失させると、P. mosselii 変異体 Δorf2059 ～ Δorf2077 が生じました (補足データ 1)。 19 の変異体を抗菌活性と擬似ヨージニン生合成についてスクリーニングしたところ、7 つの変異体 (Δorf2064 ～ Δorf2070) が擬似ヨージニンの生成に障害があり、抗菌活性に欠陥がありました。 これら 7 つの変異体は次のように名前変更されました: ΔpsdA (Δorf2064)。 ΔpsdB (Δorf2065); ΔpsdC、(Δorf2066); ΔpsdD (Δorf2067); ΔpsdE (Δorf2068); ΔpsdF (Δorf2069); およびΔpsdG (Δorf2070)。 シュードヨージニンをコードする 7 つの遺伝子、すなわち psdA、psdB、psdC、psdD、psdE、psdF、および psdG をプラスミド pBSPPc の psdA プロモーターの下流にクローニングし、pBS-psdA、pBS-psdB、pBS-psdC、pBS-psdD を生成しました。 、pBS-psdE、pBS-psdF、およびpBS-psdG。 これらのクローンを7つの対応する変異体に形質転換し、対応する相補株（CΔpsdA〜CΔpsdG）を取得し、抗菌活性と擬似ヨージニン生成を回復させました（図3b〜d）。

RT-PCRにより、psd遺伝子クラスター内のpsdABCDEFGが単一のオペロンに由来することが確認されました（図3eおよび補足図13f）。 このクラスター (psdABCDEFG) は、P. putida KT2440 における異種発現によって検証されました。 天然プロモーター下のpsdABCDEFGは、シュードヨージニンを生成する能力をP.プチダKT2440に与え、7つの遺伝子で十分であることを示している（図4a）。

コンストラクトpBSPPc-ABCDEFG内の擬似ヨージニン生合成クラスター、およびWT、KT2440および操作された異種発現株の発酵抽出物および標準サンプル（擬似ヨージニン）のHPLC分析（方法B、500 nmで検出）。 標準的な、P. mosselii 923 から単離されたプソイドヨージニン。 WT、野生型 P. mosselii 923。 KT2440、P.プチダ; ＫＴ２４４０／ｐＢＳＰＰｃ−ＡＢＣＤＥＦＧ、ｐＢＳＰＰｃ中にシュードヨージニン遺伝子クラスターを含むＰ．プチダ。 b 疑似ヨージニン生合成の提案された経路。 1: 2,5-ジアミノ-6-(5-ホスホ-d-リボシルアミノ)ピリミジン-4(3H)-オン; 2: 5-アミノ-6-(5-ホスホ-d-リビチルアミノ)ウラシル。 3: 5-アミノ-6-d-リビチルアミノウラシル; 1,6-DDMT: 1,6-ジデスメチルトキソフラビン。

さらなる相同性分析の結果、psdABCDEFG 遺伝子クラスターが他のシュードモナス属でも保存されていることが示されました。 特に、99％のアミノ酸類似性を有する基準株P. mosselii DSM17497において。（補足図16）。 しかしながら、Ｐ．モセリＤＳＭ１７４９７は、検出可能なレベルのシュードヨージニンを生成せず、Ｘｏｏ ＰＸＯ９９Ａを阻害しなかった（補足図１７ａ、ｂ）。 P. mosselii 923変異体ΔpsdB、ΔpsdC、およびΔpsdGのDSM17497 psdオペロン（orf2184-orf2190）をそれぞれ補完すると、静菌活性と擬似ヨウ素産生を野生型923レベルに回復できます（補足図17a、b）。 さらに、orf2184〜orf2190の7つの遺伝子がP. mosselii DSM17497で発現され（補足図17c）、擬似ヨージニン遺伝子クラスターがP. mosselii DSM17497で転写されたことを示した。 上記の結果は、psdABCDEFG 遺伝子クラスターが P. mosselii DSM17497 で機能していることを示していますが、シュードヨージニン産生の欠如にはさらなる研究が必要です。

BLAST分析により、PsdDおよびPsdGのアミノ酸配列は、それぞれリボフラビンおよびトキソフラビンの合成に関与するGTPシクロヒドロラーゼIIおよびデアミナーゼと顕著な類似性を有することが示された33,34。 プソイドヨージニンと1,6-ジデスメチルトキソフラビン（1,6-DDMT）の構造間の相関関係を考慮して、トキソフラビン生合成との類似性に基づいたプソイドヨージニンの仮説的な生合成経路を提示します33（図4b）。 提案された経路では、PsdD と PsdG は GTP を使用して 2,5-ジアミノ-6-(5-ホスホ-d-リボシルアミノ) ピリミジン-4(3H)-オン (構造 1、図 4b) と 5-アミノ-最初の 2 つのステップでは 6-(5-ホスホ-d-リビチルアミノ) ウラシル (構造 2、図 4b)。 次に、PsdEおよび/またはPsdCのいずれかが、構造2または脱リン酸化生成物5-アミノ-6-d-リビチルアミノウラシル（構造3、図4b）とグリシンの共役を触媒してN-N結合形成を媒介し、1を生成します。 ,6-DDMT。 最後に、1,6-DDMT は一連の環収縮とメチル化のステップを受けて、擬似ヨージニンが生成されます。 1,6-DDMTは野生型P.モセリ923でも変異株でも観察されませんでしたが、1,6-DDMTを変異株ΔpsdCおよびΔpsdEに供給すると擬似ヨージニン産生が回復しました（補足図18）。 1,6-DDMT は重要な中間体です。

GacS/GacA TCS は、複数の抗菌化合物および溶解酵素の生合成に関与する遺伝子の発現を制御します 35。 刺激に応答して、GacS はリン酸化により応答制御因子 GacA を自己リン酸化し、活性化します 31。 GacA は、標的遺伝子の発現を制御する保存された上流活性化配列 (UAS) TGTAAGNNATNNCTTACA32 に結合することにより、rsmX、rsmY、および rsmZ sRNA の発現を活性化します。

P. mosselii 923では、2つの非コード低分子RNA、rsmYおよびrsmZのプロモーター領域にGacA結合モチーフ（5'TGTAAGCNAANGCTTACA3'）が含まれていました（補足図19b、c）。 rsmY および rsmZ と GacA との潜在的な相互作用を調べるために、後者は大腸菌 BL21 (DE3) で過剰生産され、精製され、電気泳動移動度シフト アッセイ (EMSA) で rsmY および rsmZ プロモーター領域に結合することが示されました (補足図 19a)。 –c)。 興味深いことに、GacA は psdA プロモーターと相互作用しませんでした (データは示されていません)。 rsmY と rsmZ の欠失は、擬似ヨージニンの生成と活性におけるそれらの役割をさらに調査するために構築されました。 個々の ΔrsmY および ΔrsmZ 変異体は抗菌活性に影響を与えませんでした。 しかし、二重変異体ΔrsmYZは、Xoo PXO99Aに対する抗菌活性をほぼ完全に欠いていました（図5a）。 抗菌活性は、3つの相補株、すなわちCΔrsmY、CΔrsmZ、およびCΔrsmYZにおいて野生型レベルに回復した（図5a）。 疑似ヨージニン生成は、ΔrsmY 変異体では大幅に減少しましたが、ΔrsmZ 変異体では減少しませんでした。 抗菌アッセイから予測されたように、ΔrsmYZ 二重変異体は擬似ヨージニンを生成しませんでした。 2つの相補された株（CΔrsmYおよびCΔrsmZ）は、擬似ヨージニン産生について部分的にレスキューされましたが、rsmYおよびrsmZによる同時相補により、擬似ヨージニン生成が野生型レベルに回復しました（図5b、c）。 これらのデータは、GacA が P. mosselii 923 のオペロンの転写を活性化する rsmY および rsmZ プロモーターに直接結合することにより、擬似ヨージニン生合成を正に制御することを示しています。

a P. mosselii 923、ΔrsmY、ΔrsmZ、およびΔrsmYZ変異体、および相補変異体CΔrsmY、CΔrsmZ、およびCΔrsmYZの抗菌活性アッセイ。 パネルb、d、野生型923と比較した変異株および相補株のHPLCプロファイル(方法B、500nmで検出)。パネルc、e、異なる株による擬似ヨージニン生成。 y 軸の数値は擬似ヨージニンの収率を示します。 c LB培地中の野生型923、rsmY、rsmZ、およびrsmYZ変異体およびそれらの対応する相補株。 エラーバーは、平均±SD（n = 3の生物学的独立反復）および***P < 0.001、***P = 0.0002、= 2.5 × 10−14、= 1.5 × 10−10での有意差を順に示します。 e LBおよびTSB培地における野生型P. mosselii 923、csrA1、csrA2、csrA3、csrA1A2、csrA1A3、csrA2A3およびcsrA1A2A3変異体、TSB培地における過剰発現株およびRBS交換株におけるシュードヨージニン収量。 エラーバーは、平均±SD（n = 3の生物学的独立反復）および***P < 0.001、**P < 0.01、**P = 0.005、***P = 4.5 × 10−10、= 1.1での有意差を示します。 × 10−9、= 9.3 × 10−17 となります。 一元配置分散分析とそれに続く LSD テスト。 実験は独立して 3 回実行され、同様の結果が得られました。 f P. mosselii 923 における擬似ヨージニン生合成の GacA / CsrA 媒介調節の提案モデル。 923 株では、GacS / GacA TCS は特徴付けられていないシグナルに応答し、GacA は結合によって 2 つの非コード RNA (rsmY および rsmZ) の転写を活性化します。それらのプロモーターに影響を与え、それによって擬似ヨージニンの生成を積極的に制御します。 2 つの CsrA/RsmA ホモログ、CsrA2 および CsrA3 は、擬似ヨージニン合成の開始を阻害します。 CsrA2 および CsrA3 は、主に psdA mRNA の 5' 非翻訳領域にある GGA 含有配列/ループと相互作用します。 この部位は RBS と重複しており、psdA 転写物の翻訳を妨げます。 RsmY および RsmZ は、CsrA2 および CsrA3 結合に関して mRNA と競合する予測ステムループ内に複数の CsrA/RsmA 結合部位を含み、翻訳の抑制に拮抗します。

RsmA (二次代謝産物のリプレッサー)36 とそのホモログ CsrA (炭素貯蔵調節因子 A)37 は、標的遺伝子のリボソーム結合部位 (RBS) 近くの mRNA の 5' 非翻訳 GGA モチーフと相互作用する RNA 結合タンパク質であり、リボソームアクセス38． CsrA/RsmA タンパク質は調節 RNA によって隔離され、標的 mRNA の翻訳抑制が緩和されます 39。 われわれは、CsrA/RsmAがP. mosselii 923における擬似ヨージニン合成に寄与しているかどうかを調べた。BLASTアルゴリズムを使用してP. mosselii 923ゲノム内のCsrA/RsmAオルソログを検索し、3つの相同遺伝子、すなわちcsrA1、csrA2、csrA3が同定された。 CsrA2とCsrA3は75％を超えるアミノ酸類似性を示しましたが、CsrA1は50％未満の類似性でした（補足図19d）。

欠失突然変異誘発および psdA::uidA 転写融合を使用して、CsrA1、CsrA2、および CsrA3 が psdA 発現に関与しているかどうかを調査しました。 psdA プロモーターの活性を測定することにより、野生型 923 および ΔcsrA1、ΔcsrA2、および ΔcsrA3 変異体における csrA1、csrA2、および csrA3 の発現を分析しました。 定量的GUSアッセイは、psdAプロモーター駆動のGUS活性が、野生型株923よりもΔcsrA1、ΔcsrA2、およびΔcsrA3変異体の方が劇的に高いことを示した（補足図19f）。 これらの結果は、csrA1、csrA2、および csrA3 の欠失により psdA の発現が増加することを示し、これは CsrA タンパク質が擬似ヨージニン生合成オペロンの転写を抑制することを示唆しています。 CsrA1、CsrA2、および CsrA3 が疑似ヨージニン産生の改善に必要かどうかをさらに調べるために、追加の欠失変異体、すなわち ΔcsrA1A2、ΔcsrA1A3、ΔcsrA2A3、および ΔcsrA1A2A3 を構築しました。 擬似ヨージニン産生は、ΔcsrA2、ΔcsrA3、ΔcsrA1A2、ΔcsrA1A3、ΔcsrA2A3およびΔcsrA1A2A3変異株では大幅に改善されましたが、ΔcsrA1変異株では改善されませんでした（図5d、e）。これは、Xoo PXO99Aに対する抗菌アッセイと一致しました（補足図19e）。 これらの結果は、CsrA1、CsrA2、およびCsrA3がpsdA発現および擬似ヨージニン生成に悪影響を及ぼし、CsrA2およびCsrA3が主要な調節因子として機能することを示しています（図5e、f）。

psdABCDEFG オペロンを使用して、GacA-rsmY/Z-CsrA123 制御システムに基づいてより高い擬似ヨージニン産生が得られるように最適化された遺伝子組み換え株 P. mosselii ΔcsrA1A2A3-pBSPPc-P2064-RBS-Pseu-ORF を構築しました。 トリプシンソイブロス（TSB）での P. mosselii 923 の培養は、LB 培地と比較して、36 時間の発酵後に増殖が増加し、擬似ヨージニンのレベルが著しく高くなりました（補足図 20a、b）。 したがって、さらなる実験のために TSB 培地が選択されました。 次に、csrA1、csrA2、およびcsrA3遺伝子が株923で削除され、野生型株923によって生成される1.9 mg/Lに対して12.5 mg/Lの擬似ヨージニンが生じました（図5e）。 次に、psdABCDEFGオペロンをΔcsrA1A2A3変異体に導入してΔcsrA1A2A3-pBSPPc-ABCDEFG株（補足データ1）を取得しました。これにより、923株と比較して擬似ヨージニン産生が16.6倍増加しました（図5e）。 uidA 遺伝子 40 の RBS 配列が RsmA14 に結合して負に制御される可能性があることを考慮して、野生型 923 および ΔcsrA1A2A3 変異体における転写レベルおよび転写後レベルでの GUS 活性を測定しました。 定量的アッセイは、転写レベルでのGUS活性が転写後レベルよりも劇的に高いことを示しました（補足図20c）。 これは、uidA でのリボソーム結合が psdA との結合よりも高いことを示しています。 したがって、オペロンのRBSは、ワンステップクローニング技術によってCsrA1、CsrA2、およびCsrA3によってネガティブに制御されるように編集されました（補足図20d）。 最後に、改変株によるシュードヨージニンの収量は42.5 mg/Lに増加し、これは野生型P. mosselii 923（1.9 mg/L）よりも22.4倍高かった（図5e）。 一方、WT株と過剰生産株の抗菌活性と増殖を比較したところ、結果は、シュードヨージニンの過剰生産がXoo PXO99AとXoc RS105病原体の両方に対する抗菌活性を向上させることを示しました（補足図21a-c）。 ただし、発酵の最初の14時間ではP. mosseliiの増殖が減少しました（補足図21d–f）。

有益な微生物は農業生態系に豊富に存在し、植物の病気を制御し、植物の成長を促進する機能を持っています26。 生物制御微生物の発見と天然に存在する生物農薬の開発は、植物の病気を制御し、世界的な農業安全保障を維持するための効果的な方法です。 この研究では、Xoo、Xoc、および M. オリゼに対する特異的な拮抗活性を持つ P. mosselii 923 の潜在的な BCA を報告します。 シュードヨージニンは、P. mosselii 923 によって生成される主要な拮抗化合物であり、psdABCDEFG オペロンはその生成に十分です。

Pseudomonas spp.によって生産される生物防除剤フェナジン、リポペプチド抗生物質、その他の二次代謝産物など、農業病害の防除に使用されてきました41。 フェナジン誘導体（PCA やピオシアニンなど）は、真菌性疾患の生物的防除に使用されており、P. fluorescens 2 ～ 79、P. chromoraphis PCL1391 および P. aeraginosa 30 ～ 8442 で研究されています。 P. mosselii は、根圏土壌に分布する日和見的なヒト病原体とみなされており、病原体や昆虫を阻害することが知られています 43,44。 例えば、キサントリシン生合成に関与する c-xtl 遺伝子クラスターは P. mosselii BS011 で発見され、M. oryzae の発生を阻害しました 45。 最近、ripAA 遺伝子を発現する遺伝子操作された P. mosselii 株が、タバコの青枯病を効果的に抑制しました 46。 さらに、PIP-47Aa と呼ばれる P. mosselii 由来の新規殺虫タンパク質は、トウモロコシ根虫の防除に効果的でした 47。 本研究では、野生型 P. mosselii 923 が Xoo (PXO99A)、Xoc (RS105)、および M. oryzae (R01-1) を阻害する能力があることを示します (図 1a、b)。 P. mosselii 923 が産生する抗菌化合物プソイドヨージニンは、Xoo (PXO99A) ​​と Xoc (RS105) の両方を阻害し、EC50 値はそれぞれ 0.17 μg/mL と 1.36 μg/mL です (表 1)。 シュードヨージニンはまた、M. オリザエに対して 4.43 μg/mL の EC50 で強力な殺菌活性を示します (補足図 9c)。 私たちの知る限り、これは細菌と真菌の両方の増殖に対する抗菌剤として P. mosselii 923 とシュードヨージニンを記載した最初の報告です。

40 年前、抗菌化合物プソイドヨージニンが P. fluorescens var. p. fluorescens var. の産物であることが確認されました。 プソイドヨージニン22。 プソイドヨージニンは、NP のピラゾロ [4,3-e][1,2,4]トリアジン ファミリーのメンバーです 19。 プソイドヨージニンの化学合成は報告されていますが 19、一般的に収率は低く、コストが高いため、合成源の実現可能性は限られています。 興味深いことに、擬似ヨージニンの生合成と分子の組み立ての遺伝的基盤は十分に研究されていません。 この研究では、GacA が擬似ヨージニン生合成を正に制御することが示されました（図 3a および補足図 13a-c）。 これまでの研究では、保存された GacS/GacA TCS が、シュードモナス属の複数の抗菌経路の発現を正に制御することが示されており、これにはシュードモナス属のフルオレッセンス 48、シュードモナス・クロロラフィス 49、およびシュードモナス属のオーレオファシエンス 50 の遺伝子クラスターが含まれます。 現在の研究では、ΔgacA変異体はP. mosselii 923でのシュードヨージニン生成に障害があったため（補足図13b、c）、これにより、シュードヨージニンの生合成と制御をさらに調査することになりました。

シュードヨージニン生合成に関与するBGCを特定するために、923株およびΔgacA変異体のP.モセリのゲノムとトランスクリプトームを分析し、GTPシクロヒドロラーゼとメチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子がΔgacA変異体で大幅に抑制されていることを発見しました（補足表2）。 下方制御された多数の遺伝子に突然変異が生成され、擬似ヨージニン生合成と抗菌活性がスクリーニングされました。 これにより、psdABCDEFGオペロンが同定されました（図3e）。 psdA および psdF はメチルトランスフェラーゼをコードし、psdB はグリオキシラーゼ ブレオマイシン耐性タンパク質ジオキシゲナーゼ スーパーファミリーのメンバーをコードし、psdC はスルファターゼ修飾因子をコードし、psdD は GTP シクロヒドロラーゼをコードし、psdE は WD-40 リピートタンパク質をコードします。 これらの6つのpsd遺伝子を欠失させると、シュードヨージニン生成が大幅に消失し、相補により生成が回復した（図3c、d）ため、psdABCDEFがシュードヨージニン生合成に必要であることが示された。 ΔpsdG変異体は、抗菌活性と擬似ヨージニン生成において部分的にのみ減弱しました（図3b、c）。 psdG の配列分析により、psdG がリボフラビン生合成で機能する RibD タンパク質をコードしていることが示されました。 リボフラビン (ビタミン B2) が補因子およびシグナル伝達分子として機能することは十分に確立されており 51、psdG はプソイドヨージニンの構造的または機能的安定性に役割を果たしている可能性があります。 psdABCDEFGオペロンがトランスで発現すると、シュードヨージニンがP.プチダKT2440で産生され（図4a）、これはpsdABCDEFGオペロンがシュードモナスにおけるシュードヨージニン生合成に十分であることを裏付ける。

PsdD および PsdG の予測アミノ酸配列は、トキソフラビン生合成をコードする遺伝子と顕著な類似性を示しており、このことは、トキソフラビンと共有または類似した生合成経路を介してシュードヨージニンが部分的に合成される可能性があることを示唆しています 33。 我々は、この反応が一連の環収縮とメチル化のステップを経て擬似ヨージニンを生成すると提案します（図4b）。 1,6-DDMTは、変異株ΔpsdCまたはΔpsdEにそれを与えた場合、擬似ヨージニンの生合成中間体として確認され、擬似ヨージニンの生産が回復しました（補足図18）。 しかし、1,6-DDMT は野生型 P. mosselii 923 にも変異株にも検出されず、すぐに次の中間体に変わると考えられました。 PsdE および PsdC によって媒介される 1,6-DDMT の形成は依然として不明であり、擬似ヨージニンへの詳細な環収縮経路はさらなる研究を待っていることを指摘しておく必要があります。

以前の研究では、GacA と CsrA/RsmA が転写後レベルで標的遺伝子に対して相反する制御的役割を果たしていることが実証されています 52,53。 我々のEMSAの結果は、GacAが2つの非コード低分子RNA、rsmYおよびrsmZのプロモーター領域に結合し（補足図19b、c）、結合により擬似ヨージニン合成遺伝子クラスターの転写が活性化されることを実証した。 さらなるバイオインフォマティクス研究により、P. mosselii 923 には 3 つの相同 csrA 遺伝子、すなわち csrA1、csrA2、および csrA3 が含まれることが示されました (補足図 19d)。 欠失突然変異誘発および転写後uidA融合を使用して、CsrA1、CsrA2、およびCsrA3がpsdA発現と擬似ヨージニンの産生を負に制御することを示しました（図5d、eおよび補足図19e、f）。 興味深いことに、GGA部位はpsdA RBSの5'非翻訳領域に存在しており、CsrAがリーダー転写物に結合してリボソームアクセスをブロックすることによってpsdA発現を抑制できることが示唆されました（図5f）。 CsrA が標的 mRNA とどのように相互作用するかを決定するには、さらなる実験が必要です。 しかし、プソイドヨージニンが抗菌活性を発揮するメカニズムはまだ発見されておらず、さらなる研究が必要です。 この報告は、GacA と CsrA が擬似ヨージニン生合成の重要な調節因子であることをさらに特定し、細菌と真菌の両方に対する抗菌剤としての擬似ヨージニンについての理解を広げます。

微生物は、農業や医療で使用できる抗生物質、抗腫瘍、抗ウイルス化合物などの多くの生理活性二次代謝産物の供給源です54。 しかし、自然界から単離された野生型株は一般に、限られた量の二次代謝産物を生産するため、代謝産物の収量を向上させるための戦略が必要です55。 現在の研究では、過剰発現株の操作、負の調節遺伝子の削除、RBSの改変、培地の最適化など、多角的なアプローチを利用して擬似ヨージニン収量を向上させました。 これらのアプローチにより、野生型よりも22.4倍多くのプソイドヨージニンを生成し、平均収量42.5 mg / Lの遺伝子組み換え株の開発につながりました（図5e）。 工業規模の発酵など、擬似ヨージニンの生産性を高めるさらなる方法が必要とされています。 製品収量を最大化するための他の戦略には、プロモーター操作、ゲノミクス、タンパク質工学、メタボロミクス、代謝物プロファイリングが含まれます 56,57 。これらは、緑膿菌 PA120157 株による PCA 収量を増加させるために使用されています。

農薬は植物の病気を管理するために中国だけでなく世界中で広く使用されています。 例えば、シェンチンマイシン (PCA) は、イネや野菜作物をイネ紋枯病、トウガラシ枯病、苗立枯病から守るために使用されています58。 私たちの研究では、プソイドヨージニンが温室内の米に悪影響を与えることなく、病原体Xoo、Xoc、M. oryzaeによって引き起こされるBLB、BLS、およびイネいもち病を予防できることが示されました（補足図10〜12）。 私たちのフィールドアッセイは、プソイドヨージニンが5μMを超える濃度で50％を超える生物防除効率でBLBの病変領域を大幅に縮小できることを示しています（補足図3b、c）。

psdABCDEFG 遺伝子クラスターについて他のシュードモナスを分析する過程で、それが保存されていることを発見しました。 ただし、P. fluorescens には psd オペロンの相同体はありません。 特に、基準菌株 P. mosselii DSM17497 は、シュードヨージニン オペロンと 99% のアミノ酸類似性を有する 6931 bp の遺伝子クラスター (orf2184、orf2185、orf2186、orf2187、orf2188、orf2189、orf2190) を保有していました。 P. mosselii 923 および DSM17497 遺伝子クラスターでは、次のようないくつかの違いが認められました。(i) Orf2185 の 39 位のアミノ酸は、DSM17497 では Lys (K) から Asn (N) に変異しています (補足図 16a)。 （ii）Orf2186の89位の残基がThr（T）からAla（A）に変異している（補足図16b）。 Orf2190の158位と208位の残基は、それぞれTyr（Y）からHis（H）、Ser（S）からVal（V）に変異している（補足図16c）。

興味深いことに、P. mosselii DSM17497 は検出可能なレベルのシュードヨージニンを生成せず、Xoo PXO99A を阻害しませんでした。 P. mosselii DSM17497 psd クラスターが機能的であるかどうかを調べるために、DSM17497 psd オペロンの導入コピーを含む P. mosselii 923 変異体 ΔpsdB、ΔpsdC、および ΔpsdG のそれぞれ 2 つの複製株を生成しました。 驚くべきことに、相補株では静菌活性と擬似ヨージニン生成が野生型923レベルに回復した（補足図17a、b）。 さらに、orf2184-orf2190はP. mosselii DSM17497で発現され（補足図17c）、擬似ヨージニン遺伝子クラスターがP. mosselii DSM17497で転写されたことを示している。 擬似ヨージニンまたはその前駆体の合成または輸送を抑制する阻害剤またはリプレッサーが DSM17497 に存在する可能性は依然としてあります。 P. mosselii DSM17497 によるシュードヨージニン産生の欠如にはさらなる研究が必要であり、生物的防除剤としてのシュードモナス属の有効性が改善されることが期待されます。

要約すると、我々の研究は、P. mosselii 923 が生物防除剤であり、疑似ヨージニンが潜在的なグリーン生物農薬であると説明しています。 シュードヨージニン BGC と予測される生合成経路は、経路工学と大規模生産に関するさらなる研究を促進する可能性があります。 さらに、基礎となるGacA-rsmY / Z-CsrA123制御ネットワークを展開して、より高い収率の擬似ヨージニンを操作することができます（図5f）。 X. オリゼーおよび M. オリゼーによって引き起こされる病気が引き続き米の収量を制限しており、慎重な介入方法が必要なため、これは緊急に必要とされています。

植物病原性キサントモナス属大腸菌株 DH5α および BL21(DE3) は、栄養寒天 (NA) で 28 °C で培養しました 59。大腸菌株 DH5α および BL21(DE3) は、ルリア ベルターニ (LB)60 培地で 37 °C で培養しました。 トリプシン大豆ブロス (TSB; 30 g/L) を 30 °C でのシュードモナス株の培養に使用しました。 真菌 M. オリゼ R01-1 をオートミール (OAM)61 培地中で 25 °C で増殖させました。 この研究で使用した株、プラスミド、およびプライマーは補足データ 1 および 2 にリストされています。必要に応じて、抗生物質を次の最終濃度 (μg mL-1) で追加しました。カナマイシン (Km)、25。 リファンピシン（Rif）、75; ゲンタマイシン (Gm)、20; 石油エーテル、酢酸エチル、n-ブチルアルコール、メタノールなどの化学試薬は、Macklin (中国、上海) から購入しました。 フェナジン-1-カルボン酸 (PCA) は、Yawen He 博士 (上海交通大学生命科学生物工学部) から提供されました。 制限酵素はTakara Bio (Europe AB)から購入しました。

ＮＭＲスペクトルは、Ｂｒｕｋｅｒ Ａｖａｎｃｅ ＩＩＩ ６００ＭＨｚ分光計（ドイツ）で記録した。 サンプルを重水素化メタノール (CD3OD) または重水素化クロロホルム (CDCl3) に溶解しました。 化合物の ESI-MS 分析は、Agilent UPLC 1290 Infinity II/6545 Q-TOF (米国) で実行されました。 セミ分取 HPLC と分析 HPLC は両方とも、DAD 検出器を備えた Agilent Technologies 1260 Infinity II HPLC を使用して実行されました。 カラムは次のとおりです: Fisher Wharton C18 カラム (250 × 10 mm、5 μm、米国) (半分取 HPLC 用) および Agilent C18 カラム (150 × 4.6 mm 5 μm、米国) (分析 HPLC 用)。 1,6-DDMT は、Princeton Biomolecular Research から購入しました (カタログ番号 PBMR 232664)。

Xoc RS105 に対して抗菌活性を持つ細菌を分離するために、土壌サンプル (n = 248) が根圏から収集されました 5。 簡単に説明すると、10 g のサンプルを 90 mL の滅菌水と均一に混合し、次にこの懸濁液を滅菌水でさまざまな勾配に希釈しました。 １００μＬの上記溶液を、ＲＳ１０５を含むＮＡ培地上にプレーティングした。 Xoc、Xoo、およびその他の病原体に対する土壌細菌の拮抗作用は、Kirby-Bauer (KB)62 法によって評価されました。 すべての菌株を 3 回繰り返して試験し、NA で 28 °C で培養して 2 ～ 3 日後に病原菌に対する阻害ゾーンを測定し、OAM で 25 °C で培養してから 5 日後に M. オリゼ R01-1 を測定しました。

株 923 の 16S rRNA は、確立された方法 5 を使用してユニバーサル プライマー 27F および 1492R (補足データ 2) を使用して増幅されました。 完全な遺伝子は BioSune Biotech (中国、上海) によって精製および配列決定され、国立バイオテクノロジー情報センター (NCBI) データベースの Blast 検索に使用されました。 14 の代表的なシュードモナス属の 16S rRNA 配列。 は NCBI データベースから取得され、MEGA 7.063 による隣接結合解析を使用して 16 S rRNA に基づく系統樹が構築されました。 1000 回の反復によるブートストラップ テストを使用して信頼レベルを評価し、ブランチのノード間は信頼度 > 50% を表しました。 923 の全ゲノムは、Personalbio (中国、上海) の Illumina Miseq PacBio 配列決定プラットフォームを使用して配列決定されました。 平均ヌクレオチド同一性 (ANI) 値は、J Species WS オンライン サービスを使用して計算されました64。 923 株の正確な系統学的位置を決定するために、公的に入手可能なすべてのシュードモナスのゲノム配列および関連株を NCBI GenBank データベースから取得し、タイプ ゲノム サーバー (TYGS) (https://tygs.dsmz.で）。 923 株の全ゲノム配列は、NCBI BioProject データベース (BioProject ID: PRJNA826312) に寄​​託されました。

株 923 を 50 mL LB ブロス中で 220 rpm で通気しながら 30 °C で 12 時間培養し、その後 300 mL LB ブロスを含む 2 L フラスコに 1:100 で希釈し、30 °C、220 rpm で 24 時間インキュベートしました。 発酵物を等量の石油エーテル、酢酸エチル、およびn-ブチルアルコールを用いて室温でそれぞれ3回抽出した。 有機相と水相をロータリーエバポレーターで濃縮し、凍結乾燥し、それぞれ1 mLのメタノールと滅菌水に再懸濁しました。 上記 4 つのサンプル 50 マイクロリットルを取り出し、前述のように Xoo PX099A を使用して抗菌活性を評価しました 5。

酢酸エチル抽出物は、Xoo PX099A に対して最大の拮抗活性を示しました。 大規模発酵を実施し、発酵液の 10 L バッチをさらに酢酸エチルで抽出しました。 次いで、ゼラチン状の粗抽出物をＣ１８逆相シリカゲルカラム（ＭｅＯＨ／Ｈ２Ｏ、３：７から９：１）にロードした。 カラムから 12 の画分が得られ、C18 カラム (Agilent C18 カラム、250 × 20 mm、5 μm、米国) を使用した高速液体クロマトグラフィー (HPLC) によってさらに精製されました (方法 A)。 このアプローチを使用して、7 つの化合物が単離され、PM-1、PM-2、PM-3、PM-4、PM-5、PM-6、および PM-7 と命名されました。 各化合物の拮抗活性を、対照としてメタノールを用いて濃縮した後、ＰＸ０９９Ａに対して試験した。

HPLC の調製および分析方法: 方法 A (調製): 15% メタノールの初期濃度を 2 分間維持し、溶出勾配は次のように進行しました。メタノールの 15 から 100% までの直線勾配、2 ～ 18 分。 100% メタノール、18 ～ 22 分。 100 ～ 15% メタノール、22 ～ 26 分。 および 15% メタノール、26 ～ 30 分。 ＵＶ検出器（波長：２１０および５００ｎｍ）を使用して、流速は５ｍＬ／分であった。 方法 B (分析): 溶媒 A (水) および B (メタノール) を流速 0.4 mL/min で使用する HPLC (Agilent C18 カラム、150 × 4.6 mm 5 μm、米国、210 および 500 nm)。 5% メタノールの初期濃度を 4 分間維持した後、次の勾配を維持しました:5 ～ 20% メタノール、4 ～ 25 分。 20 ～ 100% メタノール、25 ～ 26 分。 100% メタノール、26 ～ 32 分、100 ～ 5% メタノール、32 ～ 33 分、5% メタノール、33 ～ 40 分。

PM-3 の分子式は、6 つの IHD (水素欠乏の指標) を使用した UPLC/Q-TOF-MS (m/z 166.0722 [M + H]+、C6H8N5O について計算、166.0729) によって C6H7N5O であると決定されました。 １ Ｈおよび１３Ｃ ＮＭＲデータ（補足図５、６）は、２つのメチル基（δＨ ４．２７、４．４４；δＣ ４３．３、５７．７）および１つの芳香族プロトン（δＨ ９．１４）の存在を示した。 分子内には第四級炭素原子と窒素原子が多すぎるため、PM-3 の平面構造をさらに特定することは困難でした。 幸いなことに、何度も試みた結果、溶媒の蒸発によりメタノール溶媒中に小さな結晶が生成されました。 最後に、PM-3 の完全な構造が X 線回折によって決定され (図 2c)、それは擬似ヨージニンと同一でした。

種培養物（500μL）を250mLフラスコ中の50mL LBまたはTSBに接種した。 プソイドヨージニンを抽出して定量するために、1 mL の培養物を収集し、等量の酢酸エチルで 2 回抽出しました。 続いて有機相を収集し、30℃で乾燥させた。 得られた残渣をメタノール１００μＬに溶解した。 粗抽出物(5μL)をHPLC分析(方法B)のために収集した。 擬似ヨージニン生成は、次の式に従って、HPLC 溶出液のピーク面積 (A) を使用して定量化されました: A = 776.86 擬似ヨージニン (mM) + 52.234。 この式は、相関係数 (R2) が 0.999 であった精製擬似ヨージニンを使用した検量線から導かれました。 実験は独立して 3 回繰り返されました。

P. mosselii 株を 3 mL LB 中で 30 °C、220 rpm で 12 時間培養しました。 回収した細胞を、TSB培地を使用して最終濃度OD600 = 2.0まで懸濁した。 段階希釈物を調製し、100μLのアリコートを、適切な抗生物質を補充したLB培地上で30℃で一晩インキュベートした。 増殖曲線では、TSB を含む 50 mL フラスコ中の発酵培養物 10 mL を上記のように調製し、30 °C、220 rpm でインキュベートしました。 培養物の増殖を、600 nm (OD600) での分光光度法による 36 時間以内の定期的な測定によって追跡しました。 この実験は独立して 3 回繰り返されました。

イネ品種 Yuanfengzao の種子 20 個をプラスチックポット (16 × 12 cm) に播種し、14 時間明 (30 °C)/10 時間暗 (28 °C) および 65% RH の温室内で維持しました。 21日間の栽培後(3〜6葉期)のイネ苗を生物防除アッセイに使用しました。 三葉期のイネは、Xoo および Xoc の両方の生物防除アッセイに適しています。 六葉段階のイネは、温室内での Xoo および Xoc スプレー接種に適しています。 Xoc RS105 および Xoo PXO99A (OD600 = 0.6) および P. mosselii 923 (OD600 = 0.5) の細胞懸濁液を事前に調製しました。 簡単に説明すると、これらの菌株を指数関数期中期まで培養し、遠心分離し、OD600 が 0.5 ～ 0.6 になるまで滅菌蒸留水で 2 回洗浄しました。 923 培養物 (SUP) の上清は、4 °C、13,800 × g で 10 分間の遠心分離によって調製されました。 MIC 値が Xoc RS105 の場合は 4 μg/mL、PXO99A の場合は 0.5 μg/mL の擬似ヨージニン原液を調製しました。 滅菌蒸留水（MOCK）を対照として使用した。

三葉段階のイネ苗に対する生物防除アッセイは、シリンジ注射によって接種された。 簡単に説明すると、Yuanfengzao イネの葉に、水、923、ΔpsdA (OD600 = 0.5)、または 923 SUP の接種前 (Tre) と接種後 (Pre) の 3 時間に、無針注射器で Xoc RS105-Gus (OD600 = 0.6) を接種し、維持しました。温室の中。 疾患病変の長さを7日目に測定した。 六葉段階のYuanfengzao稲に細菌細胞懸濁液（1.0×108 cfu mL-1 2 mL）を噴霧した。 処理は次のとおりであった。(1) RS105 株または PXO99A 株を接種したイネ。 （２）病原体ＲＳ１０５またはＰＸＯ９９Ａを接種した米を、Ｔｒｅ処理として水、９２３株（２ｍＬ懸濁液）または擬似ヨージニン（５ｍＬ）で処理した。 (3) 前処理として RS105 または PXO99A を噴霧接種する 12 時間前に、水、923 株 (2 mL) または擬似ヨージニン (5 mL) を接種した米。 (4) 滅菌蒸留水接種対照 (MOCK)。 各処理には 0.05% (v:v) Tween-20 (Sangon Biotech、カタログ番号 A600560) を使用しました。 接種後 15 日目に葉 (n = 20) で病変面積を測定し、7、14、および 21 日目に細菌の増殖を測定しました。 簡単に説明すると、葉の先端から 3 つの 4 cm 片を滅菌外科用ハサミで切除し、75% エタノール (30 秒)、3% 次亜塩素酸ナトリウム (3 分) および滅菌蒸留水 (1 分) で処理しました。 次いで、葉材料を組織グラインダー（ＪＸ－ＦＳＴＰＲＰ）を用いて５５Ｈｚ（１分間に２回）で浸軟化し、次いで室温で３０分間維持した。 段階希釈液を調製し、適切な抗生物質を添加した NA 上で 28 °C で 3 ～ 4 日間、単一コロニーが数えられるまで (> 100/プレート) 培養しました。 上記の接種実験を独立して３回繰り返した。

野外での生物防除アッセイのために、水田 (1 × 2 m) にイネ品種 Yuanfengzao を播種しました。 圃場試験では、イネの止葉のみを選択し、1 点につき 10 本のイネと 1 つの止葉を含む 5 点サンプリング法で測定しました。 合計 50 枚の葉が各処理について評価されました。 BLS および BLB の病気の重症度は、接種後 15 日目の葉 (n = 15) の病変面積に従って調査されました。 野外実験は独立して 3 回繰り返されました。

ライス cv. CO39 (Oryza sativa L. subsp. indica) は M. oryzae に対して非常に感受性が高く、感染症の研究に選択されました。 分生子懸濁液は、上記のように 10 日齢の M. オリゼ培養プレートを 0.05% (v:v) Tween-20 を含む滅菌蒸留水で満たすことにより、最終濃度 1 × 105 分生子 ml-1 で生成されました。 次いで、懸濁液を生後２週間の植物に噴霧接種した。 M. オリゼ R01-1 胞子の接種前 (Pre) および接種後 (Tre) の 24 時間で、シュードヨージニンを 40 μM の濃度でイネの葉の表面に噴霧しました。 植物を保管箱に24時間置き、25℃、相対湿度90％で明暗14:10時間の光周期で高湿度を維持しました。 疾患の重症度は画像化により 7 dpi で記録されました。 病変の相対面積は、Adobe Photoshop CS5 を使用して計算されました。 実験は独立して 3 回繰り返されました。

我々の以前の研究では、pHG1 を含む pHM1 由来ベクター系が効率的で安定しており、X. オリゼ株の遺伝子発現解析やイネの葉の感染追跡に適していることが実証されました 40。 pHM1 ベクターを使用した以前の研究では、イネの葉の GUS 染色の強度が細菌の増殖と相関していることが示されています。 したがって、イネ組織における Xoc RS105-Gus 標識株の GUS 活性を、我々の以前のプロトコルに従ってアッセイしました 65。 詳細な方法は補足方法で説明されています。 各処理を 3 枚の葉で繰り返し、3 つの独立した実験を実行しました。

P. mosselii 株における GUS 活性は、修正されたプロトコールを使用して評価されました。 簡単に説明すると、P. mosselii 923 および変異体をスペクチノマイシンを含む LB 中で 30 °C で一晩培養しました。 細菌細胞を 2 mL 微量遠心管に収集し (3 反復)、1 mL の滅菌水で 2 回洗浄し、OD600 が 0.5 になるように調整しました。 P. mosselii 923 および変異体の定性的および定量的 GUS 分析は、補足方法に記載されているように実施されました。

プロモータープローブベクター pNG1 のマルチクローニングサイト (MCS) は uidA の上流に位置し、NdeI 部位は翻訳開始部位 (ATG) と重なっていました。 したがって、我々は、転写レベルおよび転写後レベルでuidAプロモーター-プローブ融合体を作成した。 psdAプロモーター領域をEcoRI/KpnIフラグメントとしてpNG1にクローニングして、psdAプロモーター-uidA融合体を含むpNG1-P2064を作成しました（補足データ1）。 同様のアプローチを使用して、psdA プロモーターを EcoRI/NdeI フラグメントとして pNG1 にクローン化し、uidA との翻訳融合をもたらしました。 得られた構築物をpNG1-P2064-postと名付けた(補足データ1)。

EZ-Tn5 による P. mosselii 株 923 の突然変異誘発と挿入部位の特性評価は、確立されたプロトコールを使用して実施されました5。 簡単に説明すると、EZ-Tn5™ Tnp Transposome™ キット (Lucigen、TSM08KR) の EZTn5 1 μL を 923 コンピテントセルにエレクトロポレーションし、Xoo PXO99A に対する拮抗活性を完全に喪失または部分的に減弱させた変異体をスクリーニングしました。 923 ゲノム DNA 内の EZ-Tn5 < R6Kγori/KAN-2> トランスポゾン挿入部位のレスキュー クローニングは、製造業者のプロトコールに従って行われました。

gacA 欠失変異体は、sacB を介した二重相同組換えによって生成されました。 716 bp 上流と 487 bp 下流で gacA に隣接する配列を、それぞれプライマー gacA-up-F1 / gacA-up-R1 および gacA-down-F2 / gacA-down-R2 (補足データ 2) を使用して PCR によって増幅しました。 上流および下流の増幅産物をゲル精製し、それぞれNdeI / KpnIおよびXbaI / NdeIで消化し、p2P24Km66にクローニングして、構築物p24-gacAを得ました（補足データ1）。 ライゲーション後、この構築物を大腸菌 DH5α コンピテントセルに導入し、Km を含む LB 上で培養しました。 p24-gacAを含むコロニーは、M13-FおよびM13-Rプライマーを使用したPCRによって確認され（補足データ2）、配列決定されました。 プラスミドp24-gacAをエレクトロポレーション法によりP. mosselii 923に導入し、Kmを含むNAN（スクロースを含まないNA）（NAN+Km）、NAS（10％スクロースを含むNA）上でカナマイシン耐性とスクロース感受性を有するコロニーを順次選択した。 NAS 生存コロニーは NA および NA + Km で個別に培養され、NA では増殖したが NA + Km では増殖しなかったコロニーは、補足データ 2 のプライマーを使用した PCR によって確認されました。 gacA の欠失は配列分析によって確認され、gacA の欠失は配列分析によって確認され、さらに検証されました。上述の静菌性および擬似ヨージニン生成。

gacA および上流プロモーター領域を含む 1074 bp フラグメントを、プライマー gacA-com-F および gacA-com-R を使用した PCR によって増幅しました (補足データ 2)。 PCR産物をEcoRI/KpnI断片としてpUFR034にクローン化し、組換えプラスミドpUFR-gacAを得た。 この構築物は、M13 プライマーを用いた PCR によって確認され、配列決定され、エレクトロポレーションによって P. mosselii 923 および ΔgacA 変異体に導入されました。 Kmを含むLB上でコロニーを選択し、PCRによって同定し、さらに静菌性および擬似ヨージニン産生の試験によって確認した。 相補された変異株およびgacA過剰発現株を、それぞれCΔgacAおよび923 pUFR-gacAと命名した。

野生型 P. mosselii 923 (WT) とノックアウト変異体 ΔgacA (KO) を LB で 24 時間培養しました。 各菌株について 3 つの生物学的複製を調製しました。 細菌細胞 (1 mL) を収集し、9600 × g、4 °C で 2 分間遠心分離しました。 これを細胞の別の 1 mL アリコートで繰り返しました。 上清を除去し、液体窒素中で 15 分間凍結し、必要になるまで -80 °C で保存しました。

RNA-seq は、Shanghai Personal Biotechnology Co., Ltd. によって Illumina HiSeq システムを使用して実行されました。 DEseq R パッケージを使用して WT と比較した KO の DEG を分析し、補正 P 値 (q 値) <0.005 および log2 倍率変化 >1 を使用して有意性を確立しました。 火山プロットは、Python v. 3.6.6 の R 言語 ggplots2 パッケージと soothsayer (https://github.com/jolespin/soothsayer) の plot_volcano を使用して作成されました。 ヒートマップは、R 言語と Pheatmap ソフトウェア パッケージ (https://rdrr.io/cran/pheatmap/) によって作成されました。 ユークリッド法と完全結合法を使用して、それぞれ距離とクラスタリングを計算しました。

RNA-seq データを検証するために、RNA-seq に使用したのと同じ処理を使用して、WT および KO サンプルに対して 3 つの独立したリアルタイム定量 PCR (RT-qPCR) 分析を実行しました。 RT-qPCR 分析による二次確認のために 15 個の DEG がランダムに選択されました。 WT および KO サンプルの全 RNA は、EasyPure RNA Kit (Transgen Biotech) を使用して抽出されました。 cDNAは、cDNA Synthesis Super Mix Kit (Transgen Biotech)を用いて調製した。 SYBR グリーン標識 PCR フラグメントを増幅し、ABI7500 リアルタイム PCR システム (Applied Biosystems、米国) を使用して RT-qPCR を実行しました。 rpoD を内部対照および参照遺伝子として使用し、2-ΔΔCt 法を相対定量に使用しました 67。 すべての RT-qPCR 反応は、補足データ 2 にリストされているプラ​​イマーを使用して独立して 3 回以上実行されました。

個々の psd 遺伝子の欠失は、上記のように sacB を介した二重相同組換えによって達成されました。 各遺伝子に隣接する配列の増幅に使用されるプライマーは補足データ 2 にリストされています。欠失変異体は、対応するプライマー (補足データ 2) を使用した PCR によって同定され、静菌性と擬似ヨージニン生成についてさらに評価されました。 この研究で記載されている他の欠失変異体も、sacB を介した二重相同組換えを使用して生成されました。

相補性分析のために、psdA、psdB、psdC、psdD、psdE、psdF、および psdG と psdA プロモーターを増幅し、pBSPPc にクローニングして、プラスミド pBS-psdA、pBS-psdB、pBS-psdC、pBS-psdD、pBS-psdE を得ました。 、pBS-psdF、およびpBS-psdG。 (補足データ 1)。 次いで、構築物を対応する欠失変異体に導入し、相補性についてテストした。 rsmY および rsmZ 変異体は、同じプロトコールを使用して pUFR034 でのクローニングを通じて補完されました。

プラスミドｐＢＳＰＰｃ－Ｐｓｅｕ－ＯＲＦおよびｐＮＧ１－Ｐ２０６４を上記のように構築した。 使用したプライマーは補足データ 2 にリストされており、Shanghai Generay Biotech Co., Ltd. によって合成されました。プライマー pBS-Pseu-F2 および pBS-Pseu-R2 を使用した逆 PCR によって線状化 pBSPPc-Pseu-ORF を得て、線状化 pNG1 と混合しました。 -P2064 (補足図20d); 組換えは、ClonExpress II ワン ステップ クローニング キット (Vazyme、南京、中国) に付属のプロトコールを使用して進めました。 組換え産物である pBSPPc-P2064-RBS-Pseu-ORF を使用して、レシピエント細胞を形質転換しました。

7 つの遺伝子オペロン (psdABCDEFG) を、そのネイティブ プロモーターとともに pBSPPc にクローニングしました。 7.2 kb DNA 断片をプライマー pBS-Pseu-F および pBS-Pseu-R (補足データ 2) で増幅し、ゲル抽出キットを使用して精製しました。 7.2 kb フラグメントを XbaI/BamHI で消化した pBSPPc に挿入し、ClonExpressII ワン ステップ クローニング キットに付属の説明書を使用してクローニングしました。 得られた構築物をpBSPPc-ABCDEFGと名付けた。 これはエレクトロポレーションによって P. putida KT2440 に導入され、PCR によって検証されました。

遺伝子操作されたP.プチダ株を、20μg/mLゲンタマイシンを補充した20mL TSB中で培養し、細胞を30℃、220rpmで24時間増殖させた。 発酵ブロスを遠心分離し、等量の酢酸エチルを使用して上清を３回抽出した。 合わせた有機相を濃縮し、HPLC分析のためにメタノールに溶解した(方法B)。

過剰発現実験の場合、プラスミド pBSPPc-ABCDEFG (補足データ 1) には psdABCDEFG オペロンが含まれており、そのネイティブ プロモーターを上記のように P. mosselii ΔcsrA1A2A3 に導入し、擬似ヨージニン生成について分析しました。

P. mosselii DSM17497 およびその天然プロモーター由来のシュードヨージニン相同遺伝子クラスター (orf2184-2190) を XbaI/BamHI フラグメントとして pBSPPc にクローニングし、pBS-DSM17497-Pseu を生成しました (補足データ 1)。 このクローンを P. mosselii 923 ΔpsdB、ΔpsdC および ΔpsdG 変異体に導入して、DSM17497 psd オペロンが 923 変異株を補完できるかどうかを決定しました。 プラスミド pBS- DSM17497-Pseu をエレクトロポレーションにより対応する変異体に導入します (補足データ 1)。 補完された変異体を、上記のように静菌性および擬似ヨージニン産生について評価した。

DSM17497 には、P. mosselii 923 のシュードヨージニン オペロンに相同な 7 つの遺伝子、すなわち orf2184 (psdA)、orf2185 (psdB)、orf2186 (psdC)、orf2187 (psdD)、orf2188 (psdE)、orf2189 (psdF) および orf2190 (psdG) が含まれています。 ） 。 RT-PCR を使用して、7 つの推定シュードヨージニン遺伝子が P. mosselii DSM17497 で発現されるかどうかを決定しました。 P. mosselii DSM17497 の全 RNA を EasyPure RNA Kit (Transgen Biotech) を使用して抽出し、cDNA を cDNA Synthesis Super Mix Kit (Transgen Biotech) を使用して調製しました。 16S rRNA 遺伝子を正規化に使用しました。 RT-PCR に使用したプライマーは補足データ 2 にリストされており、実験は独立して 3 回繰り返されました。

gacA ORF は、プライマー gacA-F および gacA-R (補足データ 2) を使用した PCR によって増幅し、NdeI/XhoI フラグメントとして pET28a にクローニングしました。 得られた構築物であるｐＥＴ２８－ｇａｃＡを大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）に形質転換した。 過剰発現のために、単一コロニー大腸菌 BL21 コロニーを Km を含む 20 mL LB に接種し、37 °C で一晩培養しました。 次に細胞 (5 mL) を 500 mL LB に移し、37 °C、220 rpm で OD600 = 0.6 ～ 0.8 まで増殖させました。 次に細胞を 0.5 mM IPTG で誘導し、16 °C で一晩培養しました。 ペレットを 4 °C、3,500 × g で 10 分間遠心分離して回収し、PBS で 2 回洗浄し、最終濃度 1 mM PMSF (フェニルメタンスルホニルフルオリド）。 細胞を超音波処理によって破砕し、4℃、13,800×gで30分間の遠心分離によって無細胞抽出物を得た。 上清をHis Sep Ni-NTAアガロース樹脂(Yeasen Biotechnology)に適用し、使用前に緩衝液Aで平衡化した。 Ni-NTA カラムをバッファー A で 3 回洗浄し、バッファー A 中の 20 ～ 250 mM イミダゾールの勾配でカラムを溶出しました。20 ～ 250 mM の画分をプールし、SDS-PAGE で分離しました。 ＧａｃＡを含む画分を濃縮し、保存緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、５％グリセロール、ｐＨ７．５）と交換した。 Nano-300 MicroSpectrophotometer (Hangzhou Allsheng Instruments Co.) を使用してタンパク質濃度を推定し、必要になるまで調製物を -80 °C で保存しました。

rsmY および rsmZ に UAS モチーフ (TGTAAG-N6-CTTACA) を含む Cy5 標識プロモーター プローブを商業的に合成しました (Shanghai DNA Bioscience Co. Ltd)。 EMSA は確立されたプロトコルを使用して実行されました68。 簡単に説明すると、精製した His-GacA を Cy5 標識した rsmY および rsmZ プロモーター フラグメントとそれぞれ混合し、電気泳動のために 4.5% 非変性ポリアクリルアミド ゲルにロードしました。 Cy5 蛍光団は、Amersham タイフーン RGB 生体分子イメージャー (Cytiva、スウェーデン) を使用して検出されました。 EMSA実験は独立して3回繰り返されました。

Xanthomonas spp.の擬似ヨージニンとPCAのMIC。 段階希釈により決定した。 NA は 0 ～ 64 μg/mL のプソイドヨージニン、または PCA 0 ～ 256 μg/mL を含むように調製されました。 2 マイクロリットルの細菌懸濁液 (OD600 = 1.0) を 3 倍に希釈し、NA プレートにスポットしました。 28℃で48時間インキュベートした後、増殖が認められない最低濃度としてMICを定義しました。

プソイドヨージニンおよびPCAのEC50値は、増殖阻害に従って決定されました。 簡単に説明すると、10μLの細菌懸濁液を、希釈濃度のプソイドヨージニンおよびPCAを含有する5mLのNBに添加した。 対照懸濁液が OD600 = 1.0 に増加したときに、試験した懸濁液の OD600 値を測定しました。 OD600 値に基づく阻害パーセントの対数を化合物濃度の対数で回帰し、EC50 値を計算しました。 この実験は独立して 3 回以上実行されました。

M. オリゼ R01-1 の EC50 は、活発に増殖している真菌コロニーからの菌糸体のプラグ (直径 0.5 cm2) を、10、15、20、25、30、35 の位置にプソイドヨージニンを含む一連の OAM プレートに移すことによって、in vitro で測定されました。 40、45、および50μM。 真菌コロニーの直径は、暗所で 25 °C で 5 日間インキュベートした後に測定され、阻害は対照増殖のパーセントとして計算されました。 EC50 値は、対数変換された擬似ヨージニン濃度に対するコロニー直径の線形回帰に基づいて計算されました。 実験は独立して 3 回実施されました。

統計的有意性は、最小有意差 (LSD) 検定法と SPSS v. 22.0 を使用した多重比較の一元配置分散分析を使用して計算されました。 統計的検定値は、図の凡例で次のように統計的に有意であることを表します。 *P < 0.05; **P < 0.01; ***P < 0.001、一元配置分散分析とそれに続く LSD 検定。 データは平均値 ± 標準偏差 (SD) として表示されます。 統計データは、GraphPad Prism バージョン 8.00 を使用して分析されました。 病変面積は、Adobe Photoshop CS5を使用して感染した葉から計算されました。 再現性を確認するために、すべての実験を独立して少なくとも 3 回繰り返しました。

研究デザインの詳細については、この記事にリンクされている Nature Portfolio Reporting Summary を参照してください。

この研究の結果を裏付けるデータは、この原稿とその補足情報ファイルで入手できます。 この研究で使用された Pseudomonas mosselii 923 のゲノム配列データは、BioProject アクセッション コード PRJNA826312 (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NZ_CP095556) で NCBI GenBank データベースに寄託されています。 トランスクリプトーム データは NCBI Sequence Read Archive に寄託されており、コード PRJNA880759 でアクセスできます。 この記事で報告されている擬似ヨージニンの構造の結晶学的データは、寄託番号 CCDC 2175188 でケンブリッジ結晶学的データセンターに寄託されています。データのコピーは、www.ccdc.cam.ac.uk から無料で入手できます。 この研究で使用した株、プラスミド、およびプライマーは補足データ 1-2 に報告されています。 ソースデータはこのペーパーに付属しています。 リクエストに応じて、対応する著者からデータを入手することもできます。 ソースデータはこのペーパーに付属しています。

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このプロジェクトに対する批判的な見解を寄せてくださった Carol Bender 教授 (オクラホマ州立大学)、Feng Ge 教授 (中国科学院動物研究所)、Xuewen Gao 教授 (南京農業大学) に感謝します。 この研究は、中国国家重点研究開発プログラム (2022YFD1400200、2017YFD0200400)、中国国家自然科学財団 (31830072)、および中国上海農業応用技術開発プログラム (2020-02-08-00) からの助成金によって支援されました。 ‐08‐F01462）。

これらの著者は同様に貢献しました: Ruihuan Yang、Qing Shi。

上海農業種子協同イノベーションセンター/上海交通大学農業生物学部、上海、200240、中国

Ruihuan Yang、Ychao Yan、Shengzhang Li、Yuan Fang、Ying Li、Linlin Liu、Longyu Liu、Yongzheng Peng、Jiangbo Fan、Lifang Zou、Gongyou Chen

上海交通大学生命科学・バイオテクノロジー学部微生物代謝国家重点実験室、上海、200240、中国

Qing Shi、Tingting Huang、Xiaozheng Wang、Lifang Zou、Shuangjun Lin、Gongyou Chen

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GC と LZ が研究を監督しました。 RY、YY、彼女。 L.、YF、YL、リー。 L、ロー。 L. と YP は土壌サンプルを収集しました。 RYと彼女。 L. 分離された細菌株。 RY と LZ は、遺伝子ノックアウト、相補的、生化学的アッセイ実験を実施しました。 RY および QS により化合物が同定されました。 RY と JF は生物防除アッセイを実施しています。 QS、TH、XW は生合成実験を行いました。 RY と QS がデータを分析し、原稿を執筆しました。 TH、シュウ。 L. と GC は原稿を修正しました。

Lifang Zou または Gongyou Chen への対応。

著者らは競合する利害関係を宣言していません。

Nature Communications は、この研究の査読に貢献してくれた匿名の査読者に感謝します。 査読者レポートが利用可能です。

発行者注記 Springer Nature は、発行された地図および所属機関の管轄権の主張に関して中立を保っています。

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転載と許可

Yang、R.、Shi、Q.、Huang、T. 他。 Pseudomonas mosselii 923 由来の天然ピラゾロトリアジン プソイドヨージニンは、植物の細菌性および真菌性病原体を阻害します。 Nat Commun 14、734 (2023)。 https://doi.org/10.1038/s41467-023-36433-z

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受信日: 2022 年 6 月 12 日

受理日: 2023 年 2 月 1 日

公開日: 2023 年 2 月 9 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-023-36433-z

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