内部状態を追跡するドーパミンサブシステム | 吉林省パッチケーブルグループ

Nature volume 608、pages 374–380 (2022)この記事を引用

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409 オルトメトリック

メトリクスの詳細

食べ物と水は、私たちの内部のニーズを満たすという点で価値があります1,2。腹側被蓋野 (VTA) のドーパミン作動性ニューロンは味覚報酬によって活性化されます 3,4,5 が、動物がこれらの口からの合図と摂取による遅延した生理学的効果との関連付けをどのように学習するのかは不明です。今回我々は、VTAの個々のドーパミン作動性ニューロンが、摂取の特定の段階で栄養素や水の検出に反応することを示す。ドーパミン作動性ニューロンの主要なサブセットは、のどが渇いたマウスが水を飲んだ数十分後に起こる全身の水分補給の変化を追跡しますが、異なるドーパミン作動性ニューロンは胃腸管内の栄養素に反応します。私たちは、体液バランスに関する情報が視床下部経路によって VTA に伝達され、その後、経口、胃腸、および吸収後の摂取段階を追跡する下流の回路に再経路指定されることを示します。これらの信号の機能を調査するために、液体の経口効果と吸収後の効果を独立して操作し、時間的に分離できるパラダイムを使用しました。われわれは、マウスが水分補給能力のみに基づいて、ある液体を別の液体よりも好むことを急速に学習すること、および摂取後にVTAのドーパミン作動性ニューロンが選択的に沈黙すると、この摂取後の学習が妨げられることを示す。これらの発見は、中脳のドーパミンシステムには、摂取のさまざまな様式や段階を数秒から数十分の時間スケールで追跡するサブシステムが含まれており、この情報が摂取の結果についての学習を促進するために使用されていることが明らかになりました。

動物は何を食べ、何を飲むかを決めなければなりません。食物源の栄養価はその外観からは明らかではない場合があり、摂取した結果が即座に明らかではないため、これは課題となります。むしろ、動物は特定の食物や液体の価値、つまりそれらが努力して入手する価値があるかどうか、また、遭遇した場合に摂取すべきかどうかを摂取経験を通じて学ばなければなりません6、7、8。たとえば、多くの動物は水分の大部分を食物から得ているため9、10、11、12、13、14、15、したがって、どの食物源が水分補給しているかを摂取後のフィードバックを通じて学習する可能性があります。

報酬についての学習の多くの側面には、腹側被蓋野 VTA16、17、18、19、20、21 (VTA-DA ニューロン) のドーパミン作動性 (DA) ニューロンが関係します。食べ物 3,4 または水 4,5 の味に反応して、VTA-DA ニューロンはドーパミンを大量に放出し、関連する合図に価値を与えます。しかし、食べ物や水の味自体は、その後の体内の欲求（水分補給など）の充足を予測する手がかりであり、動物が特定の食べ物や液体の摂取後の影響について学習するにつれて、その価値は変化する可能性があります1,8,22。これは、行動の最終的な強化因子である体内の栄養素と体液自体がどのようにドーパミンシステムの中で表現され、学習を促進するために使用されるのかという疑問を引き起こします。

DA ニューロンが体液バランスの内部変化にどのように反応するかを調査するために、水を摂取する前後の DA ニューロンの活動を記録しました。マウスには、VTA-DAニューロンのカルシウム動態（DAT-creの発現によって定義される;図1a）の顕微鏡内視鏡イメージング用の装備が施され、一晩水を絶たれた後、5分間無制限に水にアクセスできました。マウスは貪欲に水を飲み(拡張データ図1j)、予想通り、多くのDAニューロンが舐めるのに時間ロックされた形で一時的に活性化しました4,5(22%;拡張データ図1bおよび拡張データ表1および2)。ただし、飲酒の開始から10.1±0.6分の遅れの後に出現したDAニューロン活性化の予期せぬ第2波も検出しました（図1b〜eおよび拡張データ図1c〜i）。この遅延した活性化は多くの DA ニューロン (39%) を動員し、ベースライン蛍光と位相バーストの両方の増加を伴い、なめることとは無関係でした (水筒がなくなった)。代わりに、これは報告されている血液への水の吸収の時間経過を反映しており 23,24,25,26 、全身的な水分補給自体が多くの DA ニューロンの遅延活性化を引き起こすことを示唆しています。

a、GRIN レンズの配置と GCaMP6 を発現する VTA-DA ニューロンの代表的な画像。 b、水を飲んでいる間と飲んだ後の同じ視野からのDAニューロン応答の調整マップ。 c、水の摂取中および摂取後の5つの代表的なニューロンにおけるカルシウム動態のトレースの例。 d、水の消費、水の胃内（IG）注入（1.2 ml）、および水（1.2 ml）または高張食塩水（3 M NaCl、0.12 ml）の腹腔内（IP）注射に対する個々のニューロンの反応。 e、示されている各刺激の母集団加重 Z スコア (活性化または抑制されたニューロンの割合にそれらの Z スコアの活性変化を乗算して計算)。活性化されたニューロン (赤) と抑制されたニューロン (青) のパーセンテージが各棒グラフの上下にリストされています。「摂取後」とは、水または 0.3 M NaCl の自己ペース摂取終了後 0 ～ 20 分です。「ＩＧ注入後」は、水または０．３ＭＮａＣｌの胃内注入（１．２ｍｌ）の終了後０〜２０分である。「IP 注射後」とは、水 (1.2 ml)、NaCl (3 M、0.12 ml)、イソプロテレノール (100 mg kg-1) またはポリエチレングリコール (PEG) (40%、0.4 ml) の腹腔内注射後 0 ～ 30 分です。）。 f、上、水(1.2ml)の胃内注入後の個々のVTA-DAニューロンの活性化とベースラインへの復帰の時間経過。下部、平均トレース。マウスは、dで使用したものとは別のコホートに由来します。 g、腹腔内水注射（赤）によって活性化され、腹腔内NaCl注射（青）によって阻害されたニューロン（dから）の平均活動追跡。同時の血液浸透圧変化を以下にプロットします。 NS、P > 0.05; **P < 0.01、***P < 0.001。データは平均値±標準誤差です。統計は拡張データ表 2 に示されています。

この遅れた反応に水分補給が必要かどうかをテストするために、ナイーブマウスは飲むが最終的には脱水状態になる高張液（300 mM NaCl）をマウスに与えました27。この液体の摂取は、飲酒中に一時的なDAニューロンの活性化を引き起こしましたが（拡張データ図1b、k）、総摂取量が同様のレベルであるにもかかわらず（拡張データ図1j）、ドーパミン活性の遅延増加は生じませんでした（図1e）。。注目すべきことに、少数のニューロン集団も阻害されましたが、この阻害の大きさは水または高張食塩水を摂取した後でも同じでした（図1e）。

水分補給が DA ニューロンの活性化に十分であるかどうかをテストするために、胃に直接液体を注入するための胃内カテーテルをマウスに装着しました 28。水注入 29 (12 分間で 1.2 ml) により、多くの記録されたニューロンの活性化が遅延しました (図 1d、e、拡張データ図 1m、n、および拡張データ図 2)。これは注入開始後 14 ± 1 分に発生し (注入速度によってわずかに変化; 拡張データ図 1o)、30 ± 0.7 分間持続した後、徐々にベースラインに戻りました (図 1f)。活性化されたニューロンの割合とその活性化の大きさは、自己ペースの飲酒と胃内注入後でも同様でした（図1e）。注目すべきことに、この活性化は動きの全体的な変化を伴わず（拡張データ図1p）、マウスが事前に水を絶たなかった場合にはより小さな反応が観察され（拡張データ図1q）、高張性の場合には正味の抑制が観察されました（拡張データ図1p）。代わりに300 mM NaCl）生理食塩水を注入しました（図1e）。これは、再水和がDAニューロン応答に必要かつ十分であることを示しています。

水分補給は血液浸透圧、体積、圧力の変化を引き起こす可能性があり、これらすべてが喉の渇きに影響します。したがって、我々はこれらの信号を独立して操作して、水摂取後のDAニューロン活性化の原因を決定しました。水と高張食塩水の腹腔内注射は、それぞれ多くのDAニューロンの活性化と阻害を引き起こし（図1d、e）、これらのDAニューロン応答の時間経過は、血液浸透圧の同時変化を追跡しました（図1g）。マンニトールの注射は、等浸透圧の高張食塩水と同様に DA ニューロンを阻害し（反応がナトリウム濃度の変化ではなく浸透圧の変化を反映していることを示しています。拡張データ図 1r）、塩が静脈内に送達されると DA ニューロンの反応が数秒以内に発生しました（これは、塩が静脈内に送達されたことを示しています）システム的な変化を反映しています; 拡張データ図 1s–t)。対照的に、血液量と血圧をそれぞれ減少させるポリエチレングリコールまたはイソプロテレノールの注射は、はるかに小さなDAニューロン応答を引き起こしました（図1e）。したがって、多くの VTA-DA ニューロンは全身浸透圧の変化を特異的かつ双方向に追跡し、ドーパミン系の活動の制御における体液バランスの予期せぬ役割を明らかにしています。

次に、DA ニューロンが水と栄養素にどのように反応するかを比較しました。我々は、空腹のマウスによる流動食エンシュアの摂取が、舐めることに時間ロックされた多くのDAニューロンの一過性の活性化をもたらすことを最初に確認した3,4（拡張データ図3a、b）。摂取後のシグナルを明確に分離するために、エンシュアを胃に直接注入したときのドーパミン反応を記録しました（中程度の食事に近い量（1.2 kcal）で 32、空腹を促進する AgRP ニューロンを阻害する 33）。これにより、異なる DA ニューロンのサブセットが、栄養素の注入中（DA ニューロンの 10%、栄養素が胃腸管に入るとき）およびその後（DA ニューロンの 13%、ほとんどの栄養素が血液に吸収されるとき）活性化されることが明らかになりました。拡張データ図 3c– e)。これは、水と比較して、栄養素は消化管内ではより多くのDAニューロンを活性化しますが、血流に吸収された後はより少ないことを示しています（拡張データ図1uおよび3c、d）。

次に、個々の DA ニューロンがこれらのさまざまな刺激にどのように反応するかを、実験全体で反応を調整することで比較しました（図 2a）。飲酒の場合、液体投与方法に関係なく、個々のニューロンは体液バランスの変化に一貫して反応しました。たとえば、水の腹腔内注射または自分のペースでの飲酒後に活性化されたほとんどのニューロンは、水の胃内注入後にも活性化されました（図2eおよび拡張データ図4e）。水の腹腔内注射後に活性化されたニューロンは、高張食塩水の注射によって対応して抑制されました（図2f）。同様に、栄養素については、Ensureの胃内注入後の個々のニューロンの応答は、グルコース注射または注入後のそれらの応答と相関していました（拡張データ図4f、h）。全身変化に対するこれらの一貫した反応とは対照的に、摂取の各段階にわたる個々の神経反応（たとえば、なめている間となめた後、拡張データ図4a-d）、または同じ段階の水と栄養素の間には相関関係はありませんでした（図4）。 .2b–d)。これは、摂取の特定の段階で栄養素や水分を追跡するように調整された VTA-DA ニューロンのサブセットが存在することを明らかにしています。

a、イメージング中に実験日に追跡された個々の VTA-DA ニューロンのマップ。 b、Ensureまたは水の胃内注入（1.2ml）に特異的に反応するニューロンからのトレースの例。 c、左、エンシュアと水の胃内注入中に活性化されたニューロンの割合。右側、個々のニューロンは、水の胃内注入と Ensure の注入中の反応に相関関係を示しません。 d、左、水またはEnsureの胃内注入終了後0〜20分で活性化されたニューロンの割合。右側、個々のニューロンは、水の胃内注入と Ensure の後の反応に相関関係を示しません。 e、左、水 (1.2 ml) の胃内注入および腹腔内注射の両方の後に活性化されたニューロンを示すトレース例。中央、腹腔内および胃内の水によって活性化されるニューロンの割合。そうです、腹腔内水注入に対する個々のニューロンの反応は、胃内水注入に対するそれらの反応と正の相関があります。 f、左、腹腔内水注射（1.2 ml）および高張食塩水注射（3 M NaCl、0.12 ml）後に反対の活動パターンを示すニューロンを示すトレース例。中央、腹腔内水によって活性化され、腹腔内生理食塩水によって抑制されたニューロンの割合。そうです、腹腔内水と腹腔内生理食塩水に対する個々のニューロンの反応は負の相関関係にあります。データは平均値 ± sem です。統計は拡張データ表 2 に示されています。

次に、体液バランスに関する情報がどのように VTA に送信されるかを調査しました。我々はまず外側視床下部（LH）を検討しました。LHは摂取行動に関係しており34,35、高密度のGABA作動性（γ-アミノ酪酸生成）投射をVTA36に送ります（介在するGABA作動性ニューロンの阻害を通じて間接的にVTA-DAニューロンを活性化することができます）。 VTA37 (VTA-GABA ニューロン))。 LH の GABA 作動性ニューロン (LH-GABA ニューロン) および胃内注入のイメージング用にマウスを準備し、これらのニューロンが体液バランスの変化にどのように応答するかを記録しました。 VTA-DAニューロンと同様に、多くのLH-GABAニューロンは水注入後に活性化され（拡張データ図5a、b）、高張食塩水の注射により阻害されました（拡張データ図5c）。特に VTA に投射する LH-GABA ニューロンのサブセットがこれらの反応を示すかどうかをテストするために、逆行追跡戦略を使用して LH-GABA→VTA ニューロンのカルシウム動態を画像化したところ、これらのニューロンも胃内注入後に強く活性化されることが明らかになりました。水（拡張データ図5d）。したがって、LH-GABA→VTA ニューロンは体液バランスを追跡し、この情報を VTA に伝える準備ができています。

この回路が体液バランス情報をVTAに伝達するかどうかをテストするために（図3a）、まずLH-GABA→VTAニューロンの活性化がVTA-GABAニューロンの活動にどのような影響を与えるかを測定しました。 VTAのLH-GABA末端の光遺伝学的刺激とVTA-GABAニューロン細胞体の同時イメージングを組み合わせると、LH-GABA→VTAニューロンの活性化がVTA-GABAニューロンの大部分で強力かつ長期の抑制を誘導することが明らかになりました（拡張データ図5e）。。これは、水による LH-GABA ニューロンの自然な活性化が VTA の動態を調節するのに十分であることを示唆しています。

a、水と栄養素の内受容ニューロンを VTA に接続する可能性のある解剖学的経路のモデル。 b、左、VTA-DA ニューロンの同時顕微内視鏡イメージングと LH-GABA ニューロンの化学遺伝学的阻害 (hM4Di による) の概略図。右、生理食塩水または CNO によって活性化 (赤) または阻害 (青) された VTA-DA ニューロンの集団反応 (図 1 に定義)、および生理食塩水または CNO 後の水注入後。 c、左、VTA-DAニューロンの同時顕微内視鏡イメージングとSFO渇きニューロンの化学遺伝的活性化（hM3Dqによる）の概略図。中央、満腹マウスにおける生理食塩水またはCNO注射後の水注入に応答した個々のVTA-DAニューロンの動態。右、胃内注入後に VTA-DA ニューロンの集団反応が活性化 (赤) または抑制 (青) されました。 d、水の腹腔内注射後に活性化（赤）または抑制された（青）VTA-DAニューロンの集団反応。脱水、脱水。データは平均値 ± sem です。統計は拡張データ表 2 に示されています。

VTA-DA ニューロンが体液バランスの変化を追跡するために LH-GABA ニューロンが必要かどうかをテストするために、VTA-DA ニューロンをイメージングしながら、デザイナー薬物 (DREADD) hM4Di によってのみ活性化される抑制性デザイナー受容体を LH-GABA ニューロンに標的化しました。水のみを注入すると、再び多くのDAニューロンが強力に活性化されました（図3b）。注目すべきことに、水の胃内注入前にLH-GABAニューロンをサイレンシングすると、その後のVTA-DAニューロン反応が特異的にブロックされました（図3b）。これは、LH-GABAニューロンが体液バランスについてVTA-DAニューロンに情報を与える信号源であることを示唆しています（図3a）。

体液バランスに関する情報は、脱水によって直接活性化され 27、喉の渇きを引き起こす 38、39、40、41、42、43 もので、脳の LH の上流に位置する脳脊椎下器官 (SFO) のグルタミン酸作動性ニューロンを含む専用の内受容ニューロンを介して脳に入ります。渇水回路40（図3a）。 SFOが体液バランス情報をLHニューロンとそのVTA標的に伝達しているかどうかを調べるために、興奮性DREADD hM3Dqを喉の渇きを促進するSFOニューロンに標的化し、VTA-DAニューロンのカルシウム応答を画像化しました。クロザピンN-オキシド（CNO）の注射により、満腹マウスは貪欲に水を飲むようになり、SFOニューロンの活性化が確認されましたが、CNOはベースライン（水の非存在下、拡張データ図6a）でVTA-DAニューロンの活性にわずかな影響しか与えませんでした。これは、SFO が VTA ドーパミンのダイナミクスを駆動するには十分ではないことを示しています。対照的に、CNOは、その後の水の投与によってVTA-DAニューロンの活性化を増強し、自然な脱水の効果を模倣しました（図3c、dおよび拡張データ図1q）。 SFOと同様に、空腹を促進するAgRPニューロンの刺激44、45、46は、ベースラインではDAニューロンの活動に影響を与えませんでしたが、内部栄養素に対する吸収後の反応を調節しました（絶食の効果を模倣しています。拡張データ図6c–f）。。総合すると、これは、SFO ニューロンと AgRP ニューロンが、内部状態の関連する変化に対する DA ニューロンの応答の大きさを制御しているが、全身の水分補給や栄養素に関する情報を直接伝達していないことを示しています。

VTA に対する SFO ニューロンのこの調節効果が LH を介して伝達されるかどうかをテストするために、hM3Dq を再び喉の渇きを促進する SFO ニューロンに標的化し、LH-GABA→VTA ニューロンにおけるカルシウム動態を画像化しました。 SFO ニューロンの化学遺伝学的刺激は、自然脱水の影響と同様に (拡張データ図 6g)、VTA-DA ニューロンで観察されたように (図 3c、d)、胃内水注入による LH-GABA ニューロンの活性化を増強しました。 SFOニューロンを単独で活性化すると、ベースラインでLH-GABAニューロン活動の小さいながらも重大な調節が引き起こされました（拡張データ図6g）。まとめると、これらの発見は、SFOニューロンが、上流のLH-GABAニューロンへの影響を通じて、少なくとも部分的に、水に対するドーパミン応答を調節することを明らかにします（図3a）。

体液と栄養素に関する情報がVTAから下流の回路にどのように伝達されるかを調査するために、胃内注入と、6つの密に神経支配された投影におけるGRAB-DA5（図4aおよび拡張データ図7）を使用した細胞外ドーパミンのファイバー測光記録用のマウスを準備しました。 VTA-DA ニューロンのターゲット 36—辺縁下前頭前皮質 (IL)、扁桃体基底外側 (BLA)、背側線条体 (DS)、および側坐核 (NAc) の 3 つの部分 (外側 (lat)、内側殻 (mSh))とコア）。また、局所的なドーパミン放出を測定するために、VTA 自体を記録するためのマウスも準備しました 47,48,49。次に、自己のペースでの飲食や栄養素や液体の胃内注入など、摂取に関連する一連の刺激に応答した、これらの7つの部位でのドーパミン放出を測定しました（拡張データ図8a）。

a、ドーパミン放出を測定するためのセットアップと7つの記録部位（赤い円）を示す概略図。 b、左、水摂取の経口段階（なめ始めてから30秒後）中のドーパミン放出を示すmShからの記録の例。右は、水 (青) とエンシュア (オレンジ) の摂取中のこの経口段階での、記録された各領域の平均ドーパミン放出です。 c、左、Ensureの胃腸相（胃内注入開始後の最初の12分）中のドーパミン放出を示すBLAからの記録の例。右、水とエンシュアの注入中のこの胃腸段階での記録された各領域の平均ドーパミン放出。 d、左、水の全身相（胃内注入開始後12〜50分）中のドーパミン放出を示すVTAからの記録の例。右は、水とエンシュア注入後のこの全身段階での、記録された各領域における平均ドーパミン放出です。 e、左、投影固有のイメージングの概略図。水の胃内注入中の VTA-DA→BLA ニューロンおよび VTA-DA→mSh ニューロンの中央の平均応答 (胃腸相が強調表示されている)。右、BLA および mSh に投射する活性化ニューロンの平均応答 (母集団加重 Z スコア)。 *P < 0.05。データは平均値 ± sem です。統計は拡張データ表 2 および 3 に示されています。

これにより、ドーパミンは、摂取段階（口から胃腸管、血液まで）を通じて栄養素と体液の通過を追跡する方法で、脳のさまざまな部位で放出されることが明らかになりました。図4b〜dおよび拡張データ表3）。以前に示したように、経口栄養素と液体は、NAcを含む食べ物や水をなめることに時間ロックされている脳の多くの領域でドーパミン放出を引き起こすことがわかりました4,5。その後の胃腸管内の水の検出は複数の領域で示されましたが、NAcでは示されませんでしたが、胃腸の栄養素はBLAのみでドーパミン放出を引き起こしました（図4c）。注目すべきことに、BLAにおけるドーパミン放出は、即時の口腔感覚フィードバックよりも胃充満とより一貫した方法で、飲酒中に数十秒かけて増加しました（拡張データ図8f）。我々は、胃腸シグナルに応答したNAcとBLAにおけるドーパミン放出の差が、これら2つの領域に投射するVTA-DAニューロンの細胞体カルシウム動態と一致することを投射特異的イメージングで確認した（図4eおよび拡張データ図8e）。。

これらの口腔および胃腸の反応に加えて、VTA自体でのドーパミン放出の延長を特徴とする吸収後の第3段階が観察されました（図4d）。この（おそらく体樹状突起47、48、49）ドーパミン放出は、自分のペースでの飲酒または胃内水注入のいずれかに続いて徐々に増加し、数十分にわたって上昇したままであり、事前の水分摂取不足によって増強されました（拡張データ図8c）。水の腹腔内注射後にもVTAでのドーパミン放出が観察され（ただし、より急速な開始）（拡張データ図8d）、これらのさまざまな経路で投与された水に応答したVTA-DAニューロンによるドーパミン放出の時間経過は反映されていました。 VTA-DA ニューロンの大規模な亜集団のカルシウム動態 (図 1)、さらに全身の水分補給を追跡しました。 VTAに加えて、水の胃内注入中およびその後のDSにおけるドーパミン放出も観察しました（図4c、dおよび拡張データ図8b、c、f）。これらの発見を総合すると、ドーパミン系は、摂取のさまざまな段階によって、下流の標的の異なるサブセットで優先的にドーパミン放出が引き起こされるように組織化されていることが明らかになります。

多くの動物は、食物9、10、11、12、13、14、15を含む多様な供給源から水分を摂取しているため、摂取経験を通じてどの食物や水分が水分補給されているかを学習する必要があります。私たちは、全身の水分補給によるドーパミンニューロンの活性化がこの学習プロセスに関与している可能性を考えました。注目すべきことに、水のご褒美は動物の訓練に広く使用されていますが 50、通常の飲酒を回避し、胃内液のみでオペラント行動を促進する試みは成功していません 51,52。しかし、通常の摂取ではこれら 2 つの様式が密接に結びついているため、風味などの口からの刺激についての学習を促進するには、体液バランスの変化の方が効率的である可能性があると我々は推論しました。

このアイデアをテストするために、私たちは、摂取した溶液の風味と水分補給能力を独立して変化させることができるように、なめることと胃内注入を組み合わせる閉ループシステムを開発しました（図5a;栄養風味調整に関する以前の研究8、22、 53、54、55、56）。私たちは、1 つの風味のある溶液をなめるたびに同量の生理食塩水の胃内注入がトリガーされ、異なる風味の溶液をなめるたびに同量の水の胃内注入がトリガーされるようにこのシステムをプログラムしました。結果として、1 つの溶液のみを消費すると水分補給が行われますが、これは味に基づいて最初は予測できません。

a、液体嗜好トレーニング用の閉ループシステムの概略図。マウスは、1 つのフレーバー付き溶液 (フレーバー A) を摂取することによって水分補給され、別のフレーバー (フレーバー B) を舐めることによって引き起こされる水または生理食塩水の胃内注入によって軽度に脱水されます。 b、トレーニング前後のフレーバーAの好み。 c. トレーニングの最初と最後の日の総消費量の変化。 d、左、トレーニングの最初と最後の日に脱水溶液を消費したときのmShとBLAのGRAB-DA蛍光。右は、各ソリューションを使用した最初と最後のトレーニング日のリックトリガー GRAB-DA 応答の概要プロットです。 e、水へのアクセスがなくなった後（10〜60分）、トレーニング中に選択的にVTA-DAニューロンを阻害すると、GtACRを発現するマウスの嗜好学習が排除されますが、mCherryコントロールでは排除されません。データは平均値 ± sem です。統計は拡張データ表 4 に示されています。

まず、胃内注入の非存在下でマウスにこれらのフレーバーの2つのボトルテストを行うことにより、ベースラインでの好みを決定しました。次に、マウスを、連続した日に 3 回の 1 時間のセッションで各溶液への隔離されたアクセス (胃内注入のトリガー) を提供することによって訓練しました。訓練後、マウスは、嗜好性の学習変化を測定するために、注入の非存在下で２ボトルテストで再度テストされた。これは、2ボトルテスト（図5bおよび拡張データ表4）および訓練中の摂取（図5cおよび拡張データ図9a）によって測定されるように、マウスが水注入と組み合わせた溶液を強く好むことを学習することを明らかにしました。 NAcとBLAの両方における消費誘発ドーパミン放出の変化による（図5dおよび拡張データ図10）。これは、体液バランスのゆっくりとした遅れた変化が、適切な口頭の合図と組み合わせることで、強力な学習とドーパミン放出の変化を促進できることを示しています。

DA ニューロンの活動がこの学習プロセスに必要かどうかをテストするために、抑制性オプシン stGtACR2 を使用して、トレーニング全体を通して VTA-DA ニューロンを沈黙させました。これにより、液体の好みの獲得がブロックされました（拡張データ図 9b）。ただし、VTA-DA ニューロンは、経口信号と摂取後の信号の両方によって活性化されます (図 1)。特に摂取後の DA ニューロン活動の機能をテストするために、マウスがトレーニングセッションごとに各液体に 10 分間だけアクセスできるようにトレーニングプロトコルを変更しました (これにより、水の消費を吸収後の効果から分離します。飲み始めてから10分後）（拡張データ図1d）。マウスは、この新しいプロトコルを使用して、水の注入に関連する風味を好むことをしっかりと学習しました（拡張データ図9c）。これにより、水へのアクセスが除去された後にのみ、光遺伝学的にVTA-DAニューロンをサイレンシングすることにより、摂取後シグナルの役割をテストすることができました。この吸収後の段階中のVTA-DAニューロンのサイレンシングは、学習された好みの獲得をブロックするのに十分でした（図5e）。これは、たとえこの活性化が摂取が終わった後に起こったとしても、全身の水分補給による VTA-DA ニューロンの活性化が、水分摂取の結果を学習するために必要であることを明らかにしています。

今回我々は、中脳辺縁系ドーパミンシステム内に、飲食による摂取後の内部影響を追跡する複数のサブシステムが埋め込まれていることを示した。私たちは、体液バランスの変化が DA ニューロンのカルシウム動態に特に強い影響を与えることを発見し、水分補給シグナルがどのようにドーパミン系に伝達され、学習に使用されるかを調査することにつながりました。これにより、LH の GABA 作動性ニューロンが全身の水分補給に関する情報を VTA に伝えるのに対し、SFO の喉の渇きを促進するニューロンがこの信号の増幅を制御していることが明らかになりました。さらに、摂取の進行段階で食物や液体の検出に反応して、ドーパミンがさまざまな下流部位で放出されることを示しました。私たちは、摂取した液体の経口効果と全身効果を切り離す行動パラダイムを使用して、これらの信号の機能を調査しました。その結果、摂取後の水分補給だけでも強力な学習を促進することができ、これには VTA-DA ニューロンが必要であることが明らかになりました。これは、食物と水の摂取とその後の内部状態への影響がドーパミンシステムで差動的に表現され、学習に使用されるという組織のロジックを明らかにします。

ドーパミンシステムとドーパミン流体に関するこれまでの研究は、飲酒と水の合図に対する急性反応に焦点を当てていた4,19,57,58。私たちは、より長い時間スケールで体液バランスの変化を調べたところ、全身的な脱水と水分補給がそれぞれ多くの VTA-DA ニューロンの抑制と活性化を引き起こすことを発見しました。これらの反応は血液浸透圧の変化を追跡し、数十分にわたって持続し、輸液の方法とは無関係で、VTA での局所的なドーパミン放出と相関します。体性樹状突起のドーパミン放出の機能はほとんど理解されていませんが、空間的に局在しており、独特の発火パターンとシナプス機構によって制御されており 47,49、特定の DA ニューロンサブセットと入力の活動を制御する可能性があります 47,59,60。これらの発見を総合すると、体液バランスの変化が水の合図に対する DA ニューロンの反応を調節するだけでなく 61、システム全体を直接調節することも明らかになります。

体液とは対照的に、いくつかの研究では、摂取した栄養素が線条体でのドーパミン放出を引き起こすことが報告されており62、63、64、65、66、栄養素を摂取した後、NAc mSh (コアまたは側方 NAc または DS ではない) でドーパミンのわずかな増加が検出されました。胃に送られます（図4d）。しかし、予想外にも、胃内栄養素が胃腸相と全身相の両方でBLAにおける最高レベルのドーパミン放出を引き起こすことがわかりました（図4c、d）。 BLA は栄養情報を処理することでよく知られており 67、これまでの研究では、BLA 病変 68 または薬理学 55 が風味の学習を妨げる可能性があることが示されています。これらの発見は、体内の栄養素シグナルがどのように食品についての学習を促進するかを理解するために、VTA→BLA経路のさらなる調査を優先するものです。

食べ物や液体について学ぶには、信号の複数のタイムスケールを橋渡しする必要があります。ドーパミン系は、水の視覚とその味など、外部からの合図と味覚報酬との関係を学習する役割を果たしていることがよく知られています 19,20。しかし、水の味自体が体液バランスの遅れた変化を予測する合図であり、動物がそのような関係を学習するかどうか、またどのように学習するかは不明であった。今回我々は、動物が味覚の遅れと、VTA-DAニューロンを活性化する体の水分補給の遅れを関連付けることを学習できること、そしてこの遅れた活動が学習に必要であることを示した。これにより、動物が水分補給を維持するためにどの食べ物や水分を摂取すればよいかを学習できる重要な経路が特定されました。この回路をさらに研究すると、摂取に伴う一時的な合図と遅延した生理学的影響との間のギャップを脳がどのように橋渡しするかの原理が明らかになるかもしれない。

実験プロトコルは、実験動物の管理と使用に関する NIH ガイドに従って、カリフォルニア大学サンフランシスコ校の動物管理使用委員会によって承認されました。

実験には、12時間の明暗サイクルで温度と湿度が管理された施設で飼育され、水と標準的な餌（PicoLab 5053）を自由に摂取できる雌雄の成体マウス（6週齢以上）を使用しました。 DAT-ires-cre (B6.SJL-Slc6a3tm1.1(cre)Bkmn、Jackson カタログ番号 006660) および Vgat-ires-cre (Slc32a1tm2(cre)Lowl、Jackson #016962) マウスを Jackson Labs から入手しました。 Allen Institute for脳科学。 DAT-ires-cre ノックインマウスを Vgat-ires-flp ノックインマウスまたは Npy-ires-flp ノックインマウスと交配して二重変異体を生成しました。

すべての行動と記録については、暗サイクル中のみマウスを防音行動チャンバー (Coulbourn Habitest Modular System) に入れました。チャンバーは、前の実験から残っているあらゆる嗅覚シグナルを除去するために、実験の間に洗浄された。すべてのマウスは、翌日の実験に使用される前に、行動チャンバー（記録装置と胃内カテーテルを同時に取り付けた状態）に少なくとも 1 時間慣れさせました。さらに、各テストセッションの開始時にマウスを10〜20分間行動チャンバーに再慣れさせました（その間、記録開始時の初期の漂白アーチファクトを減らすために、イメージングに使用されるLEDがオンになりました）。

なめる反応実験では、実験前 24 時間、マウスを水を絶たせた (水または 300 mM NaCl の摂取を使用した実験の場合) か、または食物を絶たせた (Ensure 摂取を使用した実験の場合) 。次に、マウスに、適切な溶液（水、エンシュア、または 300 mM NaCl 溶液）を入れたリックメーターを合計 5 分間使用させました。これは、（一部のマウスが感染したという事実をコントロールするため）最初のなめの発作から始まると定義されました。飲むまでの時間が長くなります）。嗅覚の痕跡が残らないように注意しながら（例えば、水滴を拭き取ることによって）、チャンバーからボトルを取り出すことによってアクセスを終了した。 300 mM NaCl の消費に対する反応を測定する実験は、動物は 1 回の経験で高張溶液を避けることを学習できるため、ナイーブマウスでのみ行われました 69。全てのマウスは、最初に、微小内視鏡カメラを取り付けた状態で水の入ったボトルに１時間アクセスできるようにすることによって、リックメーターと記録設定に慣れさせた。

腹腔内注射をマウスの右側に実施した。腹腔内注射のみに対する反応を記録する場合、記録は注射後 30 分間継続されました。 DREADD 活性化による応答変調を記録するために、CNO 注射の後に 5 分後に胃内注射または腹腔内注射を行いました (以下を参照)。図の凡例に示すように、次の用量を使用しました: 1.2 ml 水、0.6 ml 50% グルコース、0.12 ml 3 M NaCl、および 1.2 ml 154 mM NaCl (等張食塩水)。マウスを慣らすために、これらの実験に使用する前日に、マウスに偽の腹腔内注射を与えた。

静脈内注射は、マウスを同時イメージングを可能にする特注の拘束システムに保持しながら、高張食塩水(100μl、1M NaCl)を側尾静脈に注射することによって行った。実験を開始する前に、マウスをセットアップに 30 分間慣れさせました。静脈内注射に対する反応を記録するために、注射後 30 分間記録を続けました。これらの実験中、動物には麻酔をかけませんでした。

胃内注入は、シリンジポンプ（Harvard Apparatus 70-2001）を使用して毎分 100 または 200 μl の速度で 6 または 12 分間送達されました（総注入量は 0.6 または 1.2 ml になります）。 NaCl (154 または 300 mM)、グルコース (25%)、および Ensure の溶液は、脱イオン水を使用して調製されました。我々は以前、液体が胃内カテーテル自体を通過するまでの待ち時間を、200 μl min-1 の注入速度 20 で約 13 秒と測定しました。注入実験では、マウスを行動チャンバーに入れる前に、プラスチックチューブおよびアダプター (AAD04119、Tygon; LS20、Instech) を使用して胃内カテーテルをシリンジポンプに取り付けました。

VTA-DAニューロンの顕微内視鏡画像化（以下のセクションを参照）のために準備されたマウスに50 mg kg-1 カプサイシンを注射することによって、迷走神経分化運動を実施した。以前に公開されたプロトコールに従って、不必要な痛みを避けるために、マウスは注射の直前からイソフルランで 1 時間麻酔下に置かれました 70。求心路遮断の有効性は、0.1％カプサイシンの眼内送達後15秒間の目の拭き取り回数をテストすることによって決定されました（同じ求心路遮断手術を受けたが生理食塩水注射を受けたマウスと比較;拡張データ図5f）。

胃内カテーテルは、当社が公開したプロトコルに従って設置されました20、24。簡単に説明すると、滅菌アクセス動物用カテーテル (C30PU-RGA1439、Instech Labs) を滅菌血管アクセスボタン (VABM1B/22、22、Instech Labs) に取り付けました。マウスをケタミン-キシラジンで麻酔し、無血管の胃にカテーテルを外科的に埋め込み、アクセスボタンのポートをマウスの背中に固定しました(ポートを外側、つまり背側に向けて)。実験と実験の間にポートを保護するために、保護アルミニウムキャップ (VABM1C、Instech Labs) をポートの上に置きました。胃内手術後、マウスを 1 週間回復させてから実験を開始した。

マウスは、我々が報告した一般的な手順を使用して、マイクロ内視鏡記録用に準備されました20。簡単に言うと、最初の手術では、GCaMPを発現するアデノ随伴ウイルス（AAV）をマウスに注射し、GRINレンズを脳内に下げた。 4 週間後、マウスは 2 回目の手術を受けました。この手術では、ベースプレート (Inscopix 100-000279) がレンズの上に配置され、接着セメント (MetaBond) で固定され、手術後にベースプレートカバー (Inscopix 100-000241) で覆われました。その後、ほとんどの動物は、胃に液体を注入するための胃内カテーテルを設置する 3 回目の手術を受けました。各コホートの詳細は以下の通りです。

DAT-cre マウス (n = 14) は、AAV5-Syn-FLEX-GCaMP6f-WPRE-SV40 (300 nl; 7.2 × 1012 ウイルスゲノムコピー (vg) ml-1; Addgene) を左 VTA ( −3.1 mm AP、+0.5 mm ML、−4.5 mm DV）と、同じ手術で注射部位の 0.15 mm 上に GRIN レンズ（6.1 × 0.5 mm; Inscopix 1050-004610）を取り付けます。その後の手術では、各マウスにベースプレートを装着し、胃内カテーテルを装着しました。

VGAT-cre マウス（n = 5）は、左 LH（-1.5 mm AP、-1.5 mm AP、 +1.0 mm ML、-5.1 mm DV）と、同じ手術で注射部位の 0.15 mm 上に GRIN レンズ（8.3 × 0.5 mm; Inscopix 1050-004611）を取り付けます。その後の手術では、各マウスにベースプレートを装着し、胃内カテーテルを装着しました。

VGAT-cre マウス (n = 3) は、AAV1-Ef1a-fDIO-GCaMP6m (300 nl; 2 × 1012 vg ml-1; Janelia Vector Core) を左 LH (-1.5 mm AP、+1.0) に注射することによってイメージングのために準備されました。 mm ML、-5.1 mm DV）、CAV2-Flx-Flp（300 nl; 6 × 1012 vg ml-1; Plateforme de Vectorologie）を左 VTA（-3.1 mm AP、+0.5 mm ML、-4.5 mm DV）に注入し、 GRIN レンズ (8.3 × 0.5 mm; Inscopix 1050-004611) を LH 注射部位の 0.15 mm 上に取り付けます。その後の手術では、各マウスにベースプレートを装着し、胃内カテーテルを装着しました。

VGAT-cre マウス (n = 3) の左 LH (-1.5 mm AP、+1.0) に AAV5-hSyn-DIO-ChrimsonR-tdTomato (300 nl; 4.4 × 1012 vg ml-1; Addgene) を注射することによりイメージングの準備をしました。 mm ML、-5.1 mm DV）; 左 VTA (-3.1 mm AP、+0.5 mm ML、-4.5 mm DV) 内の AAV5-Syn-FLEX-GCaMP6f-WPRE-SV40 (300 nl; 7.2 × 1012 vg ml−1; Addgene) と GRIN レンズの取り付け(6.1 × 0.5 mm; Inscopix 1050-004610) 同じ手術で注射部位の 0.15 mm 上。記録中に刺激するために、nVoke 2.0 カメラを通じて 620 nm LED を照射しました (15 mW mm-2 LED 電力、20 Hz パルス周波数、1 ms パルス幅、2 秒のオンと 3 秒のオフのサイクル)。

DAT-cre::VGAT-Flp マウス (n = 6) は、AAVDJ-hSyn-fDIO-hM4Di-mCherry (400 nl; 1.1 × 1013 vg ml-1; Stanford) を LH (-1.5) に両側から注射することによってイメージングのために準備されました。 mm AP、± 1.0 mm ML、-5.1 mm DV）; AAV5-Syn-FLEX-GCaMP6f-WPRE-SV40 (300 nl; 7.2 × 1012 vg ml-1; Addgene) を左 VTA (-3.1 mm AP、+0.5 mm ML、-4.5 mm DV) に注入。同じ手術で注射部位の 0.15 mm 上に GRIN レンズ (6.1 × 0.5 mm、Inscopix 1050-004610) を取り付けます。その後の手術では、各マウスにベースプレートを装着し、胃内カテーテルを装着しました。

DAT-cre マウス (n = 3) は、AAV2-CamKIIa-HA-hM3Dq-ires-mCitrine (100 nl; 2 × 1012 vg ml-1; UNC Vector Core) を SFO (-0.6 mm AP) に注射することによりイメージングのために準備されました。、0 mm ML、-2.8 mm DV）。 AAV5-Syn-FLEX-GCaMP6f-WPRE-SV40 (300 nl; 7.2 × 1012 vg ml-1; Addgene) を左 VTA (-3.1 mm AP、+0.5 mm ML、-4.5 mm DV) に注入。同じ手術で注射部位の 0.15 mm 上に GRIN レンズ (6.1 × 0.5 mm、Inscopix 1050-004610) を取り付けます。 hM3Dの機能的発現を確認するために、マウスにCNOまたは生理食塩水(100μl)を注射し、その後5分間水にアクセスさせた(拡張データ図6a)。その後の手術では、各マウスにベースプレートを装着し、胃内カテーテルを装着しました。

DAT-cre::NPY-Flp マウス (n = 3) は、AAV1-Ef1a-fDIO-hM3Dq-mCherry (200 nl; 3 × 1012 vg ml-1; Stanford) を ARC に両側 (-1.75) 注射することによってイメージングのために準備されました。 mm AP、± 0.2 mm ML、-5.9 mm DV）; AAV5-Syn-FLEX-GCaMP6f-WPRE-SV40 (300 nl; 7.2 × 1012 vg ml−1; Addgene) を左 VTA (-3.1 mm AP、+0.5 mm ML、-4.5 mm DV) に挿入し、GRIN を取り付ける同じ手術で注射部位の 0.15 mm 上にレンズ (6.1 × 0.5 mm; Inscopix 1050-004610) を挿入します。 hM3Dの機能的発現を確認するために、マウスにCNOまたは生理食塩水(100μl)を注射し、Ensureの消費を5分間記録した(拡張データ図6c)。その後の手術では、各マウスにベースプレートを装着し、胃内カテーテルを装着しました。

VGAT-cre マウス (n = 4) は、AAV2-CamKIIa-HA-hM3Dq-ires-mCitrine (100 nl; 2 × 1012 vg ml-1; UNC Vector Core) を SFO (-0.6 mm AP) に注射することによりイメージングのために準備されました。、0 mm ML、-2.8 mm DV）、AAV1-Ef1a-fDIO-GCaMP6m（300 nl; 2 × 1012 vg ml-1; Janelia Vector Core）を左LH（-1.5 mm AP、+1.0 mm ML、- 5.1 mm DV）、およびCAV2-Flx-Flp（300 nl; 6 × 1012 vg ml-1; Plateforme de Vectorologie）を左VTA（-3.1 mm AP、+0.5 mm ML、-4.5 mm DV）に注入しました。同じ手術で、GRIN レンズ (8.3 × 0.5 mm、Inscopix 1050-004611) を LH 注射部位の 0.15 mm 上に移植しました。その後の手術では、各マウスにベースプレートを装着し、胃内カテーテルを装着しました。

DAT-cre マウス（n = 3）は、AAV1-Ef1a-fDIO-GCaMP6m（300 nl; 2 × 1012 vg ml-1; Janelia Vector Core）を左 VTA（-3.1 mm AP、+0.5 mm ML、-4.5 mm DV）およびCAV2-Flx-Flp（100 nl; 6 × 1012 vg ml-1; Plateforme de Vectorologie）を左NAc mSh（+1.3 mm AP、+0.5 mm ML、-4.4 mm DV）に注入。同じ手術で、GRIN レンズ (6.1 × 0.5 mm、Inscopix 1050-004610) を VTA 注射部位の 0.15 mm 上に移植しました。その後の手術では、各マウスにベースプレートを装着し、胃内カテーテルを装着しました。

DAT-cre マウス（n = 3）は、AAV1-Ef1a-fDIO-GCaMP6m（300 nl; 2 × 1012 vg ml-1; Janelia Vector Core）を左 VTA（-3.1 mm AP、+0.5 mm ML、-4.5 mm DV）およびCAV2-Flx-Flp（200 nl; 6 × 1012 vg ml-1; Plateforme de Vectorologie）を左BLA（-1.8 mm AP、+2.9 mm ML、-4.7 mm DV）に注入しました。同じ手術で、GRIN レンズ (6.1 × 0.5 mm、Inscopix 1050-004610) を VTA 注射部位の 0.15 mm 上に移植しました。その後の手術では、各マウスにベースプレートを装着し、胃内カテーテルを装着しました。

微小内視鏡ビデオは、Inscopix ソフトウェア (Data Acquisition Software v. 151; https://support.inscopix.com/support) を使用して 8 Hz (0.6 ～ 0.8 mW mm-2 455 nm LED パワー、8.0 ゲイン、2 倍の空間ダウンサンプリング) で取得されました。 /products/nvista-30-and-nvoke-20/data-acquisition-software-v151)。取得後、ビデオはまず前処理され、空間的 (ビニング係数 2) および時間的 (ビニング係数 2) でダウンサンプリングされ、(ノイズと焦点の合っていないセルを除去するため) 空間バンドパスフィルターにかけられ、動き補正されました。 Inscopix データ処理ソフトウェア (v1.3.1、https://support.inscopix.com/support/products/data-processing-software/inscopix-data-processing-v131) を使用します。追加の動き修正によって対処できない過剰な動き (任意の方向の平均的なニューロンの直径よりも大きい) が発生した場合、ビデオは削除されました。次に、MATLAB に実装された制約付き非負行列因数分解 (CNMF-E) パイプライン (http://www.github.com/zhoupc/cnmfe) を使用して、これらのビデオから個々のニューロンの活動トレースを抽出しました。最初の CNMF-E セグメンテーションの後、抽出されたニューロンは手動で調整され、未修正の動きアーチファクト、関心領域の重複、同じ空間コンポーネントの過剰セグメンテーションが回避されました。 10 分間のベースライン期間中に大きな漂白アーチファクト (定義された指数関数的減衰関数に適合する) が発生した場合、ニューロンを除去しました。各実験では、3 ～ 6 匹のマウスの記録から個々のニューロンの活動追跡が抽出され、その後の分析のためにプールされました。 2 週間離れた記録セッション間でセルを簡単に位置合わせすることができました。これは、すべての調整の手動検証と組み合わせたカスタムソフトウェアに依存していました。

頭部の加速度は、Inscopix ソフトウェア (Data Acquisition Software v. 151) を使用して、nVoke/nVista カメラに組み込まれた 3 軸加速度計から取得され、50 Hz の時間分解能で xyz 加速度データが提供されました。

液体消費量は容量性リックメーターで監視され、nVista/nVoke (v. 3.0 nVista システム、v. 2.0 nVoke システム、https://support.inscopix.com/support/products/nvista-30/nvista-30) を使用して記録されました。マイクロ内視鏡イメージング実験中のデータ収集システムおよびソフトウェア (Data Acquisition Software v. 151; https://support.inscopix.com/support/products/nvista-30-and-nvoke-20/data-acquisition-software-v151)。

野生型マウス (C57BL/6J、Jackson カタログ番号 000664) は、AAV9-hSyn-GRAB-DA1h (200 nl; 1.8 x 1013 vg ml-1; Janelia Vector Core) を以下の部位に注射することにより測光記録用に準備されました。 : 左 VTA (n = 10 マウス; AP −3.1 mm、ML +0.5 mm、DV −4.5 mm)、BLA (マウス n = 12 マウス; AP −1.8 mm、ML +2.9 mm、DV −4.7 mm)、IL PFC (n = 13 マウス; +1.7 mm AP、+0.3 mm ML、-2.85 mm DV)、DS (n = 8 マウス; +1.5 mm AP、+1.5 mm ML、-3.5 mm DV); NAc mSh (n = 14 マウス; +1.3 mm AP、+0.5 mm ML、-4.4 mm DV)、NAc コア (n = 7 マウス; +1.4 mm AP、+1.0 mm ML、-4.5 mm DV)、または側方NAc (n = 8 マウス; +1.0 mm AP、+1.75 mm ML、-5.0 mm DV)。同じ手術で、光ファイバー (内径 0.4 mm、長さ 3.5、5.4、または 6.3 mm、Doric レンズ、MFC_400/430-0.48) を注射部位の 0.1 mm 上に設置しました。頭蓋内手術から回復するまで少なくとも 1 週間放置した後、マウスは上記のように胃内カテーテルを設置するための 2 回目の手術を受けました。

GRAB-DA信号取得のために、移植されたマウスをパッチケーブル(Doric Lenses、MFP_400/460/900-0.48_2m_FCM-MF2.5)に繋いだ。連続 6 mW 青色 LED (470 nm) および UV LED (405 nm) が励起光源として機能しました。これらのLEDは、マルチチャンネルハブ(Thorlabs)によって駆動され、それぞれ211 Hzと511 Hzで変調され、フィルタリングされたミニキューブ(Doric Lenses、FMC6_AE(400–410)_E1(450–490)_F1(500–540)_E2に送られました。 (550–580)_ F2(600–680)_S) を使用してから、光ファイバー (Doric レンズ、MFC_400/430-0.48) を介して接続します。 GRAB-DA GFP シグナルと UV 等吸収シグナルは、これらの同じファイバーを通じてフェムトワットシリコン受光器 (Newport、2151) に収集されました。デジタル信号は 1.0173 kHz でサンプリングされ、復調、ロックイン増幅され、プロセッサ (RZ5P、Tucker-Davis Technologies) を介して送信され、Synapse (TDT) によって収集されました。実験後、これらのデータはブラウザー (TDT) 経由でエクスポートされ、MATLAB で一時的に 4 Hz にダウンサンプリングされました。この論文でプロットされた測光トレースはすべて、同じマウスの 2 回の反復トレース (互いに 2 週間以内に実行) の平均です。ただし、マウスがナイーブな場合に 1 回しかテストできない 300 mM NaCl 消費は例外です。場合によっては、すべての刺激をテストする前に健康上の問題によりマウスが研究から除外され、その結果、コホート内のすべてのマウスについて一部のペア比較が不可能になることがあります。

液体消費量も電気リックメーターで監視され、ソフトウェア Synapse (TDT) を使用して記録され、その後ブラウザ (TDT) 経由でエクスポートされ、MATLAB で分析されました。

液体嗜好性トレーニング中の GRAB-DA 測光記録では、記録開始時の 10 分間のベースライン期間中、フレーバー付き溶液へのアクセスが制限されました (これは、前述の 10 ～ 20 分の順応期間に追加されたものです)。

我々は、上記のように、in vivo 化学遺伝学的活性化または阻害のためにマウスを準備しました。 CNO (1 mg kg-1、100 μl) またはビヒクル (生理食塩水中 0.6% DMSO) を腹腔内注射によって送達しました。

マウスには、（試験および訓練中に得られた水に加えて）1日あたり1mlの水を与えることによって継続的に水分制限が行われ、体重が初期体重の85％を下回った場合は研究から除外された。マウスは、栄養風味調整のための同様の手順に基づく 10 日間のプロトコルを使用してテストおよび訓練されました 22。簡単に言うと、最初の 2 日間にわたる 2 つのボトルのテストを使用して、溶液の初期の好みが決定されました。トレーニングは次の 6 日間にわたって行われ、その後、希望が再評価されました。風味のある溶液が利用できるようになる前に、マウスを 10 ～ 20 分間行動チャンバーに順応させました。すべての液体嗜好性訓練実験には、ほぼ同数の雌マウスと雄マウスを使用しました。胃内注入用のカテーテルは、すべての実験中（2 ボトル試験を含む）マウスに取り付けられました。マウスは、10日間のトレーニングプロトコールの直後に水分制限を解除され、1週間の回復を許可されました。

訓練中、マウスには 2 種類の風味のある溶液のうちの 1 つを単独で摂取させ、摂取すると胃内注入が開始されました。マウスを 4 つのグループに分けました。トレーニングの最初の 3 日間、最初のグループには、0.025% サカリンと混合した 0.05% 無糖グレープクールエイド (Kraft Foods) を含む 1 つの溶液を 1 時間摂取させました。電気リックメーターを使用して測定されたこの溶液の消費により、600 mM NaCl の 1 μl の胃内注入が開始されました。次の連続３日間、溶液を、０．０２５％サッカリンと混合した０．０５％無糖レモンライムクールエイド（クラフトフーズ）を含む溶液に置き換え、摂取時に１μｌの水の胃内注入を誘発した。 2 番目のグループも同じトレーニングを受けましたが、味の順序が逆になりました。 3 番目と 4 番目のグループは、それぞれグループ 1 と 2 と同じプロトコルを実行しましたが、代わりに、ブドウには水の注入が関連付けられ、石灰には 600 mM NaCl の注入が関連付けられました。簡単に説明すると、以下のようなグループでした。グループ 1: ブドウ→NaCl 注入 (1 ～ 3 日目)。石灰→水の注入（4～6日目）。グループ 2: 石灰→水の注入 (1 ～ 3 日目)。ブドウ→NaCl 注入 (4 ～ 6 日目)。グループ 3: ブドウ→水の注入 (1 ～ 3 日目)。石灰→NaCl 注入 (4 ～ 6 日目)。グループ 4: 石灰→NaCl 注入 (1 ～ 3 日目)。ブドウ→水の注入（4～6日目）。

初期および獲得された好みは、トレーニングの前後 2 日間 (合計 4 日間) に 2 つのボトルのテストを使用して決定されました。フレーバー付き溶液の配置（ケージの前または後ろ）は、2 ボトルテストの初日にはランダム化され、2 日目には逆転されました。

２ボトル試験では、０．０２５％サッカリンと混合した０．０５％無糖クールエイド（レモンライムまたはグレープ（クラフトフーズ））を含む２つの溶液をマウスに１時間与えた。石灰溶液の優先度は、式 (石灰のなめ量/総なめ量) を使用して計算されました。液体消費量は電気リックメーターで監視され、ソフトウェア Synapse (TDT) を使用して記録され、その後ブラウザ (TDT) 経由でエクスポートされ、MATLAB で分析されました。

一部の実験 (図 5e および拡張データ図 9c) では、トレーニング中の限られた時間にアクセスが与えられました。これらの実験は上記と同じプロトコールに従って行われましたが、各トレーニング日の最初の舐めの10分後に風味付き溶液へのアクセスを中止しました。

液体嗜好性トレーニング中の VTA-DA サイレンシングの場合 (拡張データ図 9b)、AAV8-hSyn-DIO-stGtACR2-fRED (400 nl、7.9 × 1012 vg ml−1; スタンフォード) または AAV5-Ef1a-DIO-mCherry (400 nl) nl、7.3 × 1012 vg ml-1; UNC Vector Core）を VTA に両側から注入し（-3.1 mm AP、± 0.5 mm ML、-4.5 mm DV）、内径 200 μm の光ファイバー（Thorlabs FT200UMT）を注入しました。、CFLC230-10）を、DAT-creマウス（n = 11マウス）の同じ手術で注射部位（-3.1 mm AP、0 mm ML、-4.2 mm DV）の上および間に0.30 mm配置しました。トレーニング期間中、DPSS 473 nm レーザー (Shanghai Laser and Optics Century BL473-100FC) は、Graphic State ソフトウェア (v.4.2、http://www.coulbourn.com/category_s/363.html) によって制御されました。 TTL 信号発生器 (Coulbourn H03-14) とボトルの在庫状況と同期します。レーザー出力はパッチケーブル先端で約 1 ～ 2 mW であると測定され、実験時間中連続的に出力されました。

水分優先トレーニング中の遅延 VTA-DA サイレンシングの場合（図 5e）、AAV8-hSyn-DIO-stGtACR2-fRED（400 nl、7.9 × 1012 vg ml−1; スタンフォード）または AAV5-Ef1a-DIO-mCherry（400nl、 7.3 × 1012 vg ml-1; UNC Vector Core）を VTA に両側から注入し（-3.1 mm AP、± 0.5 mm ML、-4.5 mm DV）、内径 200 μm の 2 本の光ファイバー（Thorlabs FT200UMT、 CFLC230-10）を、DAT-cre マウス（n = 12 マウス）の同じ手術で 2 つの標的部位から 100 μm 離れた角度で配置しました。トレーニング期間中、各トレーニング日の最初の舐めの 10 分後に DPSS 473 nm レーザー (Shanghai Laser and Optics Century BL473-100FC) がオンになりました。レーザーをオンにする直前に、サイレンシングが消費と重ならないように、溶液へのアクセスが解除されました。レーザー出力はパッチケーブル先端で約 1 ～ 2 mW であると測定され、実験時間の残りの間継続的に出力されました。

マウスに腹腔内注射(1.2mlの水または0.12mlの3M NaCl)を施した。血液(250μl)を、注射の5分前に右頬から、および注射後の特定の時点(0分、5分、10分、 15分、20分、25分または30分）。採血プロセスには、マウス 1 匹あたり平均 30 秒かかりました (採血に 2 分以上かかった場合、サンプルは廃棄されました)。血液を遠心分離（1,000gで30分間）し、上清を除去し、再度遠心分離（10,000gで30分間）して血漿を単離した。血漿の品質は色に従って等級分けされ、サンプルは明度が 70% 未満の場合は廃棄されました (参考として色 #ff6666 を参照)。凝固点浸透圧計（Fiske Associates 210）を使用して、各サンプルについて血漿浸透圧をただちに二重に測定した。 2 つのサンプルの浸透圧の差を分析に使用しました。マウスはサンプル間で回復するまで 1 週間放置されました。

マウスにＰＢＳ、続いて１０％ホルマリンを経心的に灌流した。全脳を解剖し、10% ホルマリン中で 4 °C で一晩保存しました。翌日、脳を 30% スクロースに移し、4 °C で一晩凍結保護しました。切片 (40 μm) をクライオスタットで調製しました。蛍光標識を視覚化するために、これらの切片を DAPI Fluoromount-G (Southern Biotech) でマウントし、染色せずに共焦点顕微鏡で画像化しました。画像は ImageJ (v.1.53e) を使用して最小限の処理を受けました。

カスタム MATLAB (v.R2020b、http://www.mathworks.com/products/matlab) スクリプトを使用して、行動データ、ファイバー測光データ、および顕微内視鏡イメージングデータを分析しました。

マイクロ内視鏡画像解析では、関数 z = (Craw − μ)/σ を使用してすべての応答を正規化しました。ここで、Craw は CNMF-E パイプラインの出力、μ はベースライン期間 (最初の 10 分) の平均 Craw、σ は同じベースライン期間中の Craw の標準偏差。活動電位分析には、推定スパイクレート (S; CNMF-E パイプラインの出力) が使用されました。ベースライン蛍光分析のために、Craw を 1/60 Hz ローパスフィルターに通しました (1 分より速く発生するすべての変化を除去します)。

測光分析では、関数 ΔF/F0 = (F − F0)/F0 を使用してすべての応答を正規化しました。ここで、F は生の測光信号、F0 は 405 nm 励起で得られた信号 (線形回帰を使用) を使用して予測された蛍光です。 10 分間のベースライン期間中の両方の信号のモデル; 拡張データ図 7a–c)。データを表示するために、プロットされたトレースはさらに 1 Hz にダウンサンプリングされました (これは各グラフのサイズを小さくするために行われました)。

さまざまな摂取タイムスケールでの活性を定量化するために、経口、胃腸、全身の摂取段階に対して特定の時期が定義されました。これらのエポックは、最初の記録における各応答の立ち上がり時間を分析した後に更新されました。エポック中のニューロンの活動の平均変化が +1z を超えた場合（拡張データ図 3c の場合、他のエポック中の活動の平均変化よりも大きかった）、ニューロンはこれらのエポック中に活性化されたと見なされます。

口腔（なめる）反応は、最初のなめる行為の開始後 30 秒間の活動の Z スコア変化の平均としてマイクロ内視鏡記録で定義されました。 GRAB-DA 記録の場合、なめる (経口) 反応は、最初のなめる行為の開始後 30 秒間の蛍光の平均 ΔF/F0 変化として定義されました。この論文全体を通して、飲み会とは、10 秒以上続く舐めの間隔が 2 秒を超えない一連の舐めとして定義されています。液体の好みのトレーニングでは、1 匹のマウスのすべての舐めの発作を平均し、1 回の反復として処理しました。

胃腸反応は、胃内注入開始後 12 分間に起こる活動の平均変化として定義されました (この論文ではほとんどの注入の長さと全身反応の立ち上がり時間に基づいています)。

全身性（吸収性）反応は、溶液へのアクセスが除去された後、または胃内注入および腹腔内注射が終了した後に発生する活動の平均変化として最初に定義されました（図1）。その後の立ち上がり時間（飲酒および胃内注入の開始後 10 ～ 14 時間後）の分析に基づいて、全身反応が胃腸段階での反応と区別されることを確認するために、全身（吸収）反応は 12 ～ 12 時間後に発生する活動の平均変化として再定義されました。微小内視鏡記録の場合は、胃内注入の開始または最初のなめの開始から 32 分後（または測光記録の場合は、胃内注入または最初のなめの開始の 12 ～ 50 分後）。測光と微小内視鏡記録の両方において、全身反応は腹腔内注射後 0 ～ 30 分として定義されました。立ち上がり時間は、活性化または抑制されたニューロンが S 字状フィットにおけるピーク活性変化の 50% に達するまでにかかる時間として計算されました。活動の平均変化が -1z よりも負である場合、ニューロンは特定のエポック中に抑制されていると見なされ、活動の平均変化が +1z よりも正である場合は活性化されていると見なされます。

頭部加速度は、nVista/nVoke カメラに配置された加速度計からのすべての軸の加速度の修正された合計として定義されました (「マイクロ内視鏡記録」を参照)。この合計された信号は、3 次のゼロ位相バターワースフィルターを使用して 5 Hz でフィルター処理されました (過渡現象を除去するため)。閾値 (Otsu の方法で定義) を下回る加速度は、動きと静止を区別するために使用されました。

この記事全体を通じて、値は通常、平均値 ± sem (エラーバーまたは網掛け領域) として報告されます。単純な線形回帰の図では、影付きの領域は、最適な直線の 95% 信頼区間を表します。線形回帰を除き、ノンパラメトリック検定が一律に使用されました。対のある比較と対になっていない比較の P 値は、両側順列検定 (10,000 回の反復または可能な場合は正確) を使用して計算されました。複数のグループにわたる比較の P 値は、最初は ANOVA を使用して評価されましたが、両側順列検定からの値として報告されました。場合によっては、論文の前半で行われた実験から特定の結果が明らかに予想される場合に、片側順列テストが実行されました (片側テストは、図 5e と拡張データ図 9b、および図 4 と拡張データ図全体にわたって使用されました) .8）。図 1 の主な結果については、クラス内相関 71 (= マウス間の分散 / 総分散) と線形混合モデルの効果が計算され (拡張データ表 1)、その効果が 1 匹のマウスに由来する外れ値によるものではないことが確認されました。以前の実験に基づいて効果量の予測が可能である場合、検出力計算を使用してサンプルサイズを事前に決定しました（たとえば、検出力計算は図 5e では使用されましたが、図 5b では使用されませんでした）。実験はランダム化されていませんでした。研究者らは、実験中の割り当てと 2 つの VTA-DA サイレンシング実験中の結果評価について知らされていませんでした。

研究デザインの詳細については、この論文にリンクされている Nature Research Reporting Summary を参照してください。

この研究のデータは、合理的な要求に応じて責任著者から入手できます。

データ分析に使用されるコードへのリンクがメソッド内に提供されています。

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リファレンスをダウンロードする

原稿に関するコメントについては Y. Chen、C. Zimmerman、A. Mamaligas、および Knight 研究室のメンバーに、またアートワークについては C. Zimmerman に感謝します。この作業は、R01-DK106399 (ZAK)、RF1-NS116626 (ZAK、ACK、JDB)、および F31-NS120468 (JCRG) によってサポートされていました。 ZAK はハワード・ヒューズ医学研究所の研究員です。

カリフォルニア大学サンフランシスコ校生理学教室、サンフランシスコ、カリフォルニア州、米国

ジェームズ・CR・グローブ、アナトール・C・クライツァー、ザカリー・A・ナイト

カブリ基礎神経科学研究所、カリフォルニア大学サンフランシスコ校、サンフランシスコ、カリフォルニア州、米国

ジェームズ・CR・グローブ & ザカリー・A・ナイト

神経科学大学院プログラム、カリフォルニア大学サンフランシスコ校、サンフランシスコ、カリフォルニア州、米国

ジェームズ・CR・グローブ、ジョシュア・D・バーク、アナトール・C・クライツァー、ザカリー・A・ナイト

ハワード・ヒューズ医学研究所、サンフランシスコ、カリフォルニア州、米国

リンジー・A・グレイ、ネイマリス・ラ・サンタ・メディナ、ニラ・シヴァクマール、ジェイミー・S・アーン、ティモシー・V・コーパス、ザカリー・A・ナイト

カリフォルニア大学サンフランシスコ校神経内科、サンフランシスコ、カリフォルニア州、米国

ジョシュア・D・バーク & アナトール・C・クライツァー

ワイル神経科学研究所、カリフォルニア大学サンフランシスコ、サンフランシスコ、カリフォルニア州、米国

ジョシュア・D・バーク、アナトール・C・クライツァー、ザカリー・A・ナイト

グラッドストーン研究所、サンフランシスコ、カリフォルニア州、米国

アナトール・C・クライツァー

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JCRG と ZAK は実験を計画し、データを分析および解釈しました。 JCRG が主導し、すべての実験を実施しました。 JCRG、LAG、NLSM、JSAは胃内手術を行った。 JCRGとNSは光遺伝学実験を実施した。 JCRGとTVCは測光実験を実施した。 JCRG と ZAK は ACK と JDB からの意見をもとに原稿を執筆しました

ザカリー・A・ナイトへの通信。

著者らは競合する利害関係を宣言していません。

Nature は、この研究の査読に貢献してくれた Paul Kenny と他の匿名の査読者に感謝します。

発行者注記 Springer Nature は、発行された地図および所属機関の管轄権の主張に関して中立を保っています。

a、操作を受けていないマウスのCNMFeによって生成された細胞境界で1時間隔てられた画像の記録。 b、水をなめる行為中のVTA-DAニューロンのダイナミクス、および最初のなめる行為の開始後0秒から30秒まで活性化（赤）または阻害（青）されたニューロンの集団加重zスコア。 c、水の摂取中および摂取後の個々のニューロンの活動追跡（追加の例については図1cを参照）。 d、水を飲んだ後に活性化されたニューロンの平均zスコア、およびIG水注入に反応するニューロンの50％立ち上がり時間（T50）がどのように計算されるかを示す図。水にアクセスした時間が表示されます（「水なめ」）。 e、水の摂取後に活性化されたDAニューロンの推定スパイク速度の平均。 f、g 水摂取後に活性化された DA ニューロンの推定スパイク速度 (f) およびベースライン蛍光 (g; 方法を参照) の変化。 h、図1dの4匹のマウスの水摂取後に活性化および抑制されたニューロンの割合。 i、4匹のマウスのそれぞれにおける各ニューロンの水摂取後の活動のZスコア変化を示す要約ボックスプロット(クラス内相関またはICC=varbetweenマウス/vartotal)。 j, 喉が渇いたマウスの水または高張食塩水 (0.3 M NaCl) を自分のペースで飲んだ場合の累積なめる回数 (n = 4 および 3)。 k、(左) 高張食塩水 (0.3 M NaCl) の摂取中および摂取後の個々のニューロンの反応。 (右) 生理食塩水摂取後の活性化 (赤)、抑制 (青)、および影響を受けていない (灰色) ニューロンの平均 Z スコア活動。 l、活性化集団と阻害集団を定義するために異なるZスコア閾値を使用した、水IG注入中の平均Zスコア活動（図1cより）。 m、マウスによって分離された各ニューロンの水IG注入後の活動のZスコア変化を示す要約ボックスプロット（データは、脱水マウスにおける水IG注入中のすべての記録から得られます。各複製は異なるマウスです。図1および拡張データより） .1、6）。ｎ、データ点は、パネルｍに示される各マウスの活動（すべてのニューロンに対する）の平均Ｚスコア変化である。棒グラフは、これらの平均 Z スコアの平均を示します。 o、0.1 mL/分（遅い）および0.2 mL/分（速い）速度での水をIG注入した後に活性化されたニューロンの平均活動およびT50の要約プロット。 p、水IG注入中および注入後の平均頭部加速度(n = 3マウス)。 q、満腹マウスおよび断水マウスにおける異なる水量のIG注入後の活性化ニューロンおよび抑制ニューロンの平均応答(集団加重zスコア)。ｒ、０．１２ｍＬの３ＭＮａＣｌ、１ＭＮａＣｌ、および２ＭマンニトールのＩＰ注射後の活性化および抑制されたニューロンの平均応答（集団加重Ｚスコア）。 1 M NaCl と 2 M マンニトールは等浸透圧であることに注意してください。 s、NaCl の尾静脈注射によって阻害されたニューロンの平均応答 (ズームインすると、迅速な応答を示すためにより短いタイムスケールが表示されます)。 t、平均応答および尾静脈注射後に活性化および抑制されたニューロンの割合（すべてのニューロンに適用された順列検定からの星印）。 u、水 (1.2 mL) の IG 注入中に活性化された個々のニューロンのダイナミクス。 u、水 (1.2 mL) の IG 注入中に活性化された個々のニューロンのダイナミクス。ｖ、０．１％カプサイシンの眼内送達の１５秒以内に誘発されたアイワイプ。これは、カプサイシンの求心路遮断を機能的に検証するために、５０ｍｇ／ｋｇのカプサイシンまたは対照生理食塩水をＩＰ注射した３日後に実施した。 w、50 mg/kg カプサイシンによる迷走神経求心路遮断の前後の、脱水マウスにおける IG 水注入 (1.2 mL) 後に活性化および抑制されたニューロンの平均応答および割合。 ns.P > 0.05、*P < 0.05、**P < 0.01、***P < 0.001。すべての誤差バーは、拡張データ表 2 の平均値±標準誤差統計を示します。

a、IG水注入に対するVTA-DAニューロン反応（図1d）は、数十分のタイムスケールで見ると、明らかに協調した活動の例を示します。明らかに協調的な活動が見られる点は矢印でマークされています。 b. 最初の 100 個のニューロンの拡大図は、すべてのニューロンがこの協調的な活動に参加しているわけではないことを示しています。 c. 最初の 100 個のニューロンのダイナミクスをさらに拡大すると、この活動の多くが秒単位のタイムスケールで調整されていないことがわかります。

a、エンシュア・リック・バウト中のVTA-DAニューロンの平均反応。 b、水とEnsureの消費中の平均ニューロン活動。平均トレースと要約プロットとして表されます。「なめる反応」は、摂取開始後 0 秒から 30 秒までの活動の Z スコア変化の平均として定義されます。「遅延反応」は、摂取終了後 0 分から 20 分までの活動の Z スコア変化の平均として定義されます。 c、Ensureと水（1.2 mL）のIG注入中および注入後の個々のVTA-DAニューロンの反応。ニューロンは、IG 注入中または注入後に最も強く活性化されるかどうかに応じて分離されます。 d、IG注入中および注入後の活性化および抑制されたニューロンの平均応答（図1に定義されている集団重み付けZスコア）。 e、活性化されたニューロンの立ち上がり時間（拡張データ図2cより）。 ns.P > 0.05、***P < 0.001、順列検定による。すべてのエラーバーと陰線は平均値±標準誤差を示します。

a、水の摂取中および摂取後の個々のDAニューロン反応を示す調整マップ。 b、水の摂取中および摂取後に活性化されるニューロンの割合と活動の相関。 c、水の摂取中および水のIG注入中に活性化されるニューロンの割合と活動の相関。 d、水摂取後および水のIG注入中に活性化されたニューロンの割合と活性の相関。 e、水IG注入後と自己ペースの水分摂取後の両方で活性化したニューロンのトレースの例と、両方によって活性化されたニューロンの割合および活性の相関関係。 f、Ensure IG注入後およびグルコースIP注射後に活性化されたニューロンの割合と活性の相関。 g、NaClのIG注入およびIP注入後に阻害されたニューロンの割合と活性の相関。 h、EnsureとグルコースのIG注入中の個々のニューロンの反応と、追跡されたニューロンの活動の相関。拡張データ表 2 の統計。

a、(左) LH ニューロンをイメージングするための GRIN レンズ配置の代表的な画像。スケールバー、0.5 mm。 (右) IG 注入後の水 (1.2 mL) (388 ニューロン/マウス 3 匹) および Ensure 後の活性化 (赤)、阻害 (青)、および影響を受けていない (灰色) の LH-GABA ニューロンの集団加重 Z スコア活動と割合(169 ニューロン/3 匹のマウス)。 b、セキュアまたは水（1.2 mL）のIG注入後に活性化されたLH-GABA（aから）およびVTA-DAニューロン（図1e、2b〜cから）の立ち上がり時間。 c、高張食塩水（3 M NaCl、0.12 mL; 5匹のマウス）のIP注射後の個々のLH-GABAニューロンの動態。 d、(左) LH-GABA→VTA ニューロンの顕微内視鏡イメージングの概略図。 (右) 水 (160 ニューロン/3 マウス) および Ensure (150 ニューロン/3 マウス) の注入後に活性化、抑制、および影響を受けなかった投射ニューロンの分割プロットと割合。 e、LH-GABAニューロン末端刺激中の個々のVTA-GABAニューロンの動態と並んで、VTA-GABAニューロンの顕微内視鏡イメージングとLH-GABAニューロン末端の光遺伝学的刺激の同時の概略図（マウス3匹）。すべての影付きの線は平均値±標準誤差を示します

a、(左) VTA-DA ニューロンの顕微内視鏡イメージングと SFO「渇き」ニューロンの光遺伝学的活性化の同時の概略図。 (中) 水分摂取に対する SFO ニューロン活性化の影響 (満腹マウスで 5 分間、n = 3 マウス)。 (右) 生理食塩水または CNO の IP 注射によって活性化 (赤) または阻害 (青) された VTA-DA ニューロンの概要棒グラフとパーセンテージ。ｂ、ＳＦＯニューロン活性化、水分遮断、またはそのどちらでもない後の水（１．２ｍＬ）のＩＧ注入中に活性化および抑制されたニューロンの平均応答および割合。 c、(左) VTA-DA ニューロンの顕微内視鏡イメージングと AgRP「ハンガー」ニューロンの光遺伝学的活性化の同時の概略図。 (中) 食物摂取に対する AgRP ニューロン活性化の影響 (満腹マウスで 5 分間、n = 3 マウス)。 (右) AgRP ニューロンの活性化または制御後に活性化および抑制されたニューロンの平均応答と割合。 d、(左)個々のニューロンのダイナミクス。 (右) AgRP ニューロン活性化、絶食、またはそのいずれでもない後の Ensure (0.6 mL) の IG 注入後に活性化および抑制されたニューロンの平均応答および割合。摂食剥奪と AgRP ニューロン刺激の両方が、直感に反して IG 栄養素に対する DA 反応を低下させることに注意してください。 e、AgRPニューロン活性化、絶食、またはそのどちらでもない後の50％グルコース（0.3mL）の腹腔内（IP）注射後に活性化および抑制されたニューロンの平均応答および割合。ｆ、ＡｇＲＰニューロン活性化、絶食、またはそのいずれでもない後のＥｎｓｕｒｅ（０．６ｍＬ）のＩＧ注入中に活性化および阻害されたニューロンの平均応答および割合。 g、(左) LH-GABA→VTA ニューロンと SFO「渇き」ニューロンの化学遺伝学的活性化 (hM3Dq) の同時顕微内視鏡イメージングの概略図。 (中) 生理食塩水または CNO によって活性化 (赤) または阻害 (青) された LH-GABA→VTA ニューロンの要約棒グラフとパーセンテージ。 (右) 水 (1.2 mL) の IG 注入後に活性化 (赤) または阻害 (青) された LH-GABA→VTA ニューロンの概要棒グラフとパーセンテージ。こんにちは、直交欲求状態における食物と水への反応。ｈ、飽和状態または絶食状態での水（１．２ｍＬ）のＩＧ注入後に活性化および抑制されたＶＴＡ−ＤＡニューロンの平均応答および割合。ｉ、満腹または脱水状態でのＥｎｓｕｒｅＩＧ注入（１．２ｍＬ）後に活性化および抑制されたＶＴＡ－ＤＡニューロンの平均応答および割合。ｊ、満腹状態またはナトリウム欠乏状態のマウスにおける高張食塩水（０．３ＭＮａＣｌ、１．２ｍＬ）のＩＧ注入後に活性化および阻害されたＶＴＡ−ＤＡニューロンの平均応答および割合。 ns.P > 0.05、*P < 0.05、**P < 0.01、***P < 0.001。すべての誤差バーは、拡張データ表 2 の平均値±標準誤差統計を示します。

a、405 nmおよび470 nmの励起波長を使用したEnsureまたは偽注入のIG注入中および後のBLAにおける平均GRAB-DA蛍光応答。録音のタイムスケールに注意してください。 b、405 nmの「等浸透圧」応答に対して正規化した場合の470 nm励起における平均GRAB-DA応答。 c、ベースライン期間の蛍光減衰に対する指数関数的フィットを使用して正規化した場合の、470 nm励起での平均GRAB-DA応答。拡張データの統計表 3.

a. GRAB-DA 記録用の測光ファイバーのおおよその配置 (ドット) と代表的な画像。スケールバー、1 mm。 b、水または高張食塩水（0.3 M NaCl）のIG注入（1.2 mL）後の全身水和変化に対するVTAおよびDSにおけるGRAB-DA蛍光応答。ｃ、水のＩＧ注入（１．２ｍＬ）後のＶＴＡおよびＤＳにおけるＧＲＡＢ−ＤＡ応答、および飽和状態および食物または水の遮断後のＥｎｓｕｒｅ。 d、水のIP注射中およびIP注射後のVTAにおける平均GRAB-DA応答。 e、IG水注入中および注入後のBLAおよびNAc投射ニューロンの動態（図4eを参照）。 f、水（青）、300 mM NaCl（灰色）、およびEnsure（オレンジ）の自己ペース飲酒（上および下の列）およびIG注入（1.2 mL、中列）中の平均GRAB-DA応答。 ns.P > 0.05、*P < 0.05、**P < 0.01、***P < 0.001。すべてのエラーバーと陰線は、拡張データ表 2、3 の平均±標準誤差統計を示します。

a、マウスが各トレーニング日に60分間水にアクセスできるプロトコルを使用した、各流体嗜好性トレーニング日の各溶液の消費量の要約プロット（図5cを参照）。 b.トレーニングセッション全体（60分）を通してVTA-DAニューロンを照射すると、GtACRを発現するマウスの嗜好学習が妨げられますが、mCherryを発現するコントロールでは妨げられません。 c、(左) 各トレーニングセッションで 10 分間摂取した後に水へのアクセスが解除される、改訂されたトレーニングプロトコル。 (右) わずか 10 分のアクセスでも確実な嗜好学習が起こります (つまり、吸収後の変化により VTA-DA 活動が変化する前に水が除去されます; n = 6)。 d、遅延サイレンシング実験におけるトレーニングの最初と最後の日の総消費量の変化（図5e）。 ns.P > 0.05、*P < 0.05、**P < 0.01。すべてのエラーバーと陰線は、拡張データ表 4 の平均±標準誤差統計を示します。

a、トレーニングの最初と最後の日に水和溶液を消費したときのmShおよびBLAのGRAB-DA蛍光（図5eを参照）。 b、各ソリューションを使用した最初のトレーニング日のリックトリガーの GRAB-DA 応答の要約プロット。 ns.P > 0.05。すべてのエラーバーと陰線は、拡張データ表 3 の平均±標準誤差統計を示します。

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転載と許可

JCR グローブ、ロサンゼルス、ラサンタメディナ、N. 他内部状態を追跡するドーパミンサブシステム。 Nature 608、374–380 (2022)。 https://doi.org/10.1038/s41586-022-04954-0

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受信日: 2021 年 3 月 30 日

受理日: 2022 年 6 月 8 日

公開日: 2022 年 7 月 13 日

発行日: 2022 年 8 月 11 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s41586-022-04954-0

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