海馬細胞は陽性エングラムと陰性エングラムを分離する

Communications Biology volume 5、記事番号: 1009 (2022) この記事を引用

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海馬は、さまざまな記憶計算、特に文脈記憶の時空間要素と感情的側面の処理に関与しています。最近の研究では、海馬軸に沿った細胞の不均一性が実証されています。腹側海馬は、感情と価性の処理において重要であることが示されています。ここでは、トランスジェニックと全ウイルスベースの活性依存性タグ付け戦略を組み合わせて、vHPC 内の複数の価数特異的エングラムを視覚化し、食欲と嫌悪の経験に反応する 2 つの部分的に分離された細胞集団と投影を実証します。次に、RNA配列決定とDNAメチル化配列決定のアプローチを使用して、vHPCの食欲性エングラム細胞と嫌悪性エングラム細胞が、中立的なエングラム集団と比較して異なる転写プログラムとDNAメチル化ランドスケープを示すことを発見しました。さらに、vHPCのタグ付き細胞体の光遺伝学的操作は、リアルタイムの場所選好における食欲や嫌悪行動を引き起こすのに十分ではなく、前頭前皮質（PFC）ではなく、扁桃体と側坐核（NAc）に突き出ているタグ付きvHPC末端の刺激を引き起こします。、容量ドライブの好みと回避を示しました。これらの端末は、動作を制御する能力を変更することもできました。我々は、vHPCには、食欲と嫌悪の記憶エングラムを処理する、遺伝的、細胞的、および行動的に分離された細胞集団が含まれていると結論付けています。

脳内には、正および負の価情報が染み込む可能性のある記憶の豊富な貯蔵庫が存在します1、2、3。これらの経験により、永続的な構造的および機能的変化4が残り、記憶エングラム10を構成する個別のセルおよび回路のセット1、5、6、7、8、9に分割されます。最近の研究では、単一の経験中に以前に活動していた定義された細胞セットを視覚化し、操作することに成功しました10、11、12、13、14、15、16、17。しかし、さまざまな価数の複数のエングラム（以下、刺激に依存しない方法で食欲または嫌悪イベントに区別して反応する細胞と定義します18）が同じ脳領域内でどのように表現されるかは、まだよくわかっていません。これまでの研究では、腹側海馬（vHPC）が感情情報の境界を選択的に定め、さまざまな下流の標的に伝達していることが示唆されている。我々は、腹側CA1（vCA1）に焦点を当てて、食欲と嫌悪のエングラムを処理するvHPC細胞の分子的および細胞的アイデンティティと行動に関連する機能を特徴付けることを目指しました。 vCA1 が複数の感情的経験をどのように処理するかという問題に対処するために、我々はまず、2 つの cFos ベースのタグ付け方法と内因性 cfos 免疫組織化学を組み合わせて、3 つの個別の時点にわたるエングラムを視覚化する戦略を考案しました。まず、さまざまな下流ターゲットにわたる構造の重複と分離を測定するために、食欲的および嫌悪的にタグ付けされたvCA1細胞の投影パターンを解剖学的に図表しました。次に、ゲノムワイド RNA シーケンス (RNA-seq) と DNA メチル化シーケンスを実行して、これらの細胞セットの遺伝的特徴を調査しました。最後に、細胞体と突起特異的な方法の両方で、vHPC 細胞の因果的役割と機能的柔軟性を行動的にテストしました。

まず、複数の時点にわたって、活動に依存した被験者内で細胞にアクセスするために、全ウイルス Fos と組み合わせた 4-ヒドロキシタモキシフェン (4-OHT) の制御下にある Fos ベースのトランスジェニック動物 TRAP218 を使用しました。ドキシサイクリン10（Dox）の制御下にある-ベースの戦略（図1a）。 iCre-ERT2リコンビナーゼを発現するTRAP2 + マウスは、4-OHTの代わりにDMSOを注射するとTdTomato発現を示さず（補足図1）、ウイルスのカクテル：AAV9-Flex-DIO-TdTomatoおよびAAV-cFosを両側に注射しました。 -tTA + AAV-TRE-EYFP。 cfos-tTA 戦略は、c-Fos プロモーターをテトラサイクリントランスアクチベーター (tTA) に結合させます。tTA は、タンパク質の形でドキシサイクリン (Dox) 依存的にテトラサイクリン応答エレメント (TRE) に直接結合し、発現を促進します。対象のタンパク質（すなわち、EYFP）の。これら 2 つの独立したシステムを組み合わせると、同じ対象内の vHPC 細胞にタグを付けるための 2 つの誘導可能なウィンドウが得られます (方法を参照)。

a Fos-CreERT2 マウスに、AAV-Flex-DIO-TdTomato と 1:1 で混合した AAV9-c-Fos-tTA および AAV9-TRE-EYFP を 1:1 の比率で混合したウイルスカクテルを vHPC に注射し、マウスでタグ付けの 2 つのウィンドウを開く機能。 b それぞれドキシサイクリンと4-ヒドロキシタモキシフェンに依存するTAG1とTAG2のタイムラインの概略図。嫌悪タグは 4 回の足へのショックで構成され、食欲タグは男性から女性への露出で構成されます。 c vHPC、特に vCA1 の矢状断面における二重メモリ分離の代表的な画像。 d vCA1の前後軸に沿ったDAPI上のEYFP + (嫌悪性)およびTdTomato + (食欲性)細胞の定量(%標識)は、価数の分離を示しています。 (N = 3) e 3 つの異なる行動経験中に活動する細胞を視覚化するための概略図。 EYFP では TAG1 がドキシサイクリン依存性であり、TdTomato では TAG2 が 4-OHT 依存性であり、最後に、TAG3 は行動経験の 90 分後に内因性 cfo を染色することにより免疫組織化学で視覚化されます。 f 三重記憶の重複を視覚化するためのグループの概略図 (グループあたり n = 4 ～ 6)。潜在的なタイムラインバイアスを避けるために、グループのバランスをとりました。 g vCA1 のトリプルメモリオーバーラップの代表的な画像。20 倍ズームで、さまざまな代表的なオーバーラップを示します。 h vCA1 のタグ付きニューロンの数は、EYFP、TdTomato、および cfos 間で同様です。採用間に統計的な違いはありません。 (多重比較一元配置分散分析; N = 10–12) i、嫌悪感 + 食欲不振 (グループ 1)、嫌悪感 + 嫌悪感 (グループ 2)、食欲不振 + 嫌悪感 (グループ 3) の EYFP + TdTomato のそれぞれの行動タグの重複パーセント、および食欲 + 食欲 (グループ 4)、(F (3, 12) = 170.0、P < 0.0001)。 j 拘束ストレス + ショック vs 加糖練乳 + 女性曝露における cfos+EYFP 重複細胞の NS 差。ｋ、類似の価数である嫌悪性とストレスと食欲とミルクは、異なる価数である食欲とストレスと嫌悪性とミルクの重なりと比較した場合、互いに高度に重なり合う。多重比較一元配置分散分析。 F (3, 12) = 20.77、P < 0.0001。 l EYFP + TdTomato + cfos のトリプルオーバーラップカウント (F (3, 12) = 10.55、ns、有意差なし、p > 0.05、P = 0.0011; エラーバーは平均 ± 標準誤差 (SEM) を表します。

前述のウイルスカクテルを vHPC に注入した後、この二重タグ付けシステムを使用して、食欲エングラムまたは嫌悪エングラムを処理する細胞を標識しました。手術と回復から 10 日後、タグ付けの最初のウィンドウを開くために、マウスの DOX 食餌を 48 時間摂取しなくなりました。 DOX を使用していない間、食欲体験をタグ付けするために、マウスを清潔なホームケージで 1 時間メスに曝露し 13,19 、残りの研究ではすぐに DOX 食に戻しました。嫌悪体験をタグ付けするために、2 番目の細胞セットの 24 時間後に雄マウスに 2 秒および 1.5 mA のフットショックを 4 回与えました。恐怖条件付け終了の 30 分後、マウスに 40 mg/kg の 4-OHT を注射し、72 時間静置しました (図 1b)。我々は最初に、vCA1の矢状断面の前軸と後軸に沿った食欲エングラムと嫌悪エングラムの間の顕著な解剖学的区別を観察しました（図1c）。食欲的エングラム細胞は主に後部セクションに位置していましたが、嫌悪性エングラム細胞は主にvCA1の前部セクションに存在し、内側セクション内で塩胡椒パターンが観察されました（図1c、d）。タグ付けの順序、タグ付けショック、その後の女性への曝露は、これらの細胞の解剖学的動員に影響を及ぼさないことがわかりました（補足図2）。

次に、上記と同じ二重タグ付け戦略を使用して、これらの食欲と嫌悪のタグが付けられた集団が、その後の同様の価数の経験中にリクルートされたかどうかを尋ねました。そのために、最後の行動経験、つまり加糖練乳または拘束ストレスへの曝露の90分後に内因性cFos発現を視覚化することで3番目のポイントを追加しました20、21、22、23（図1e、f）。経験の順序を制御するために、それぞれが2つのタグ付けされた細胞集団（つまり、恐怖条件付けによってタグ付けされた細胞に対して嫌悪感を持ち、男性と女性の相互作用によってタグ付けされた細胞に対して食欲的）を含む4つのグループのバランスをとり、その後にさまざまな3番目の経験を行いました。別の嫌悪感としての原子価、拘束ストレス、および他の食欲体験としての加糖練乳は、内因性 cFos 発現によって捕捉されました。私たちのグループは次のとおりでした: 嫌悪-食欲-抑制ストレス (グループ 1)、嫌悪-嫌悪-抑制ストレス (グループ 2)、食欲-嫌悪-加糖練乳 (グループ 3)、および食欲-食欲-加糖練乳 (グループ 4) ）図1fに示すように。各グループで、TdTomato、EYFP、およびcFosの細胞の共局在を測定し、3つの経験のうちの1つまたは複数でどの細胞が活性だったかを推測しました（図1g）。すべてのマウスは、タグ付けの方法や価数に関係なく、3 つのタグ付けアプローチすべてにわたってタグ付き細胞の同様の割合を示しました（図1hおよび補足図3）。

組織学的分析により、同じ経験（つまり、食欲と食欲）でラベル付けした場合、TdTomato と EYFP の共局在を示す細胞の割合が有意に高く、異なる価数の経験（つまり、食欲と嫌悪）でラベル付けした場合、共局在の割合が低かったことが明らかになりました。図1i。さらに、マウスを3つの嫌悪体験または3つの食欲体験にさらしたとき（図1l）、すなわちそれぞれグループ2およびグループ4に、TdTomato、EYFP、およびcFosの間の有意な共局在を観察しました。マウスが加糖練乳に曝露された場合、食欲タグ付き細胞が優先的に再活性化され、マウスが拘束ストレスに曝露された場合、嫌悪性タグ付き細胞が優先的に再活性化されました（図1j、k）。これらの発見を総合すると、vCA1 が部分的に重複していない 2 つの細胞セットに感情に関連した情報を指定しているという興味深い可能性が高まります。

今後、vHPC がこれらの嫌悪感や食欲をそそる経験をどのように処理するかをよりよく理解するための代用として、ショックと男性-女性のエクスポージャという 2 つの価数エングラムを選択しました。したがって、同じ二重タグ付け戦略を使用して、vHPC細胞の基本的な生理学的特性を特徴付けました（補足図4）。 TRAP2 マウスに同じ活性依存性ウイルスを同時注射し、前述と同じ方法でタグを付けました（補足図4a、b）。興味深いことに、発火頻度、閾値超過の特徴付け、適応率、入力率、またはスパイク率の違いは観察されませんでした（補足図4c-l）。これは、食欲と嫌悪感の経験のために部分的に重複しない細胞のセットをリクルートしたにもかかわらず、これらのタグ付けされた細胞自体は、同様の生理学的特徴を共有します。

これらの生理学的類似性にもかかわらず、vHPC 細胞はストレスや接近回避行動に関与する無数の異なる脳領域に投影し、それによって感情や記憶に関わる多領域ネットワークを形成することが示されています 1。扁桃体 10,24,25、側坐核 26、内側前頭前皮質 27 などの領域で観察されているように、これらのネットワーク内には、経験が食欲性か嫌悪性かによって部分的に定義される構造的異質性が存在すると推測しました。次に、デュアルタグ戦略を使用して、被験者内で食欲体験とショック体験によってタグ付けされたvHPC出力を追跡し、感情処理における重要な役割を考慮して、次の標的領域の軸索蛍光強度を測定しました：BLA、NAc、PFC、背側視床下部、円蓋、歯状回（図 2a、b）。興味深いことに、内側 BLA (AP −1.8) と PFC (IL および PL を含む) の食欲的タグ付き vCA1 末端と嫌悪的タグ付き vCA1 末端の間で赤色と緑色の両方の蛍光シグナルが観察され、同時に以下の領域での構造分離の証拠も見つかりました。蛍光強度で測定したところ、基底内側扁桃体後部（BMP）、前交連前部（ACA）、円蓋、背側内側視床下部核（DMDおよびDMV）、および下層への主に強いEYFP（食欲）投射が観察された。歯状回 (図 2c–o)。さらに、前部BLA、後部BLA、NAcコア、およびDGの上層への主に強いTdTomato（嫌悪）投影が見つかりました（図2c–o）。これまでの研究では、PFC27、NAc26、BLA10.25などの領域のニューロンが、解剖学的に分離または不均一になる可能性のある方法で経験を集合的に処理することが実証されています。我々は、食欲と嫌悪のタグが付けられたvHPC端末は、独特の解剖学的パターンと、特定の価数の処理に関与するアンサンブルの活動依存性の動員の両方によって部分的に定義できる感情記憶処理のより大きなネットワークに埋め込まれていると仮定します。

a Fos-CreERT2 マウスに、デュアルメモリータグ付けのために、AAV-Flex-DIO-TdTomato と混合した AAV9-c-Fos-tTA および AAV9-TRE-EYFP を 1:1 比で混合したウイルスカクテルを vHPC に注射しました。 b タグ付けの実験的タイムライン。 EYFP は嫌悪性を表し、TdTomato は食欲性を表します。 c、d 端末投影の代表的な画像。前部、内側、後部のBLA、背側海馬、前頭前皮質、側坐核、背側視床下部核、および円蓋。 e、前部 BLA (対応のない学生の t 検定 t = 7.279、df = 4、p = 0.00019)、f 内側 BLA (t = 1.271、 df = 4; p = 0.2725)、g、後方 BLA (t = 14.95、df = 4; p = 0.0001)、h、BMP (t = 6.168、df = 4; p = 0.0035)、i、PFC (IL を含む)および PL) (t = 1.078、df = 4; p = 0.3419)、j、ACA (t = 50.68、df = 4; P < 0.0001)、k、NAc コア (t = 3.018、df = 4; p = 0.0392 )、l、円蓋 (t = 5.718、df = 4; p = 0.0046)、m、視床下部 t = 13.96、df = 4; p = 0.0002、n、DG の上層 (t = 54.94、df = 4; p < 0.0001)、o、DG の下層 (t = 11.73、df = 4; p = 0.0003)。 ns = p > 0.05。エラーバーは平均値±SEMを表します。スケールバーはすべて 100 μm です。

最近の研究では、異なる投影標的を含む vCA1 細胞の独特な分子プロファイルが特定されました。これらの vCA1 投影は、感情と記憶に関与する複数の領域に情報を伝達し、vCA1 セルの入力、出力、転写シグネチャなどの独自の構造的特徴によって組織化できるネットワークを形成します。私たちは、細胞集団全体が、食欲エングラムまたは嫌悪エングラムに関して、経験に基づいた明確な遺伝的差異を持っているかどうかという質問をしたかったのです。そこで、次に、vHPC 細胞の分子組成に異なる遺伝子プロファイルが含まれているかどうかを調べました。活動依存的な方法で vHPC 細胞の分子状況をカタログ化するために、食欲をそそる経験 (つまり、男性と女性の相互作用)、嫌悪感のある経験 (つまり、複数のショック)、または中立的な経験 (つまり、何もせずに同じ条件付けケージに曝露する) にタグを付けました。食欲刺激または嫌悪刺激;方法を参照;図3a)。次に、蛍光活性化セルソーティング (FACS) によって単離されたタグ付き核 (EYFP + ) を使用して RNA-seq を実行しました。その結果、食欲不振グループからのタグ付き核は約 0.6% であったのに対し、中性グループでは平均 0.35% の EYFP + 核がリクルートされました (図3b、c)。食欲グループと嫌悪グループは、中立経験グループよりも有意に多くのEYFP + 核を動員しました（図3c）。嫌悪性および食欲性のvCA1細胞を中立グループと比較して、嫌悪性vCA1細胞で474個の発現差のある遺伝子（DEG）を同定しました（図3d、f）。これには、340個の下方制御遺伝子と134個の上方制御遺伝子が含まれます（図3g）。また、中立群と比較して、食欲性vCA1細胞では1,025個の下方制御遺伝子と79個の上方制御遺伝子を含む1,104個のDEGを同定しました（図3e、f）（図3g）。食欲エングラム細胞には842のユニークなDEGがあり、嫌悪エングラム細胞には212のユニークなDEGがあり（図3f）、これら2つの集団における異なる転写ランドスケープを示唆しています。

a 嫌悪刺激（電気ショック）または食欲刺激（雌マウスとの社会的相互作用に従事する雄マウス）または嫌悪刺激または嫌悪感を持たない同じケージ内での中立条件付け時にEYFPによって標識されたvCA1細胞の2つのグループを標識、単離、および分析するための実験スキーム。食欲の刺激。 b、それぞれのグループからのAAV9-cFos-tTA + AAV9-TRE-ChR2-EYFPウイルスで標識されたマウスの海馬からのEYFP食欲性核のFACS単離 c、各グループからのEYFP食欲性核の割合（グループあたりN = 3） /timepoint、通常の一元配置分散分析、多重比較 ***P = 0.001、****P < 0.0001、ns = 有意ではない、p > 0.05)。 d log 2 比における遺伝子発現の相対倍率変化と、X 軸および Y 軸として log 2 比における FDR 調整された p 値を使用した火山プロット。中立グループと比較した嫌悪性 vCA1 細胞における上方制御および下方制御された遺伝子を示します。 FDR 調整後の p 値が 1e-5 プラス少なくとも 4 倍の差である上方制御または下方制御された遺伝子は、それぞれ赤または青で強調表示されました。 Wald 統計によってソートされた、最も重要な遺伝子の上位 20 個の遺伝子名が表示されました。 e 中立グループと比較した、食欲性vCA1細胞における上方制御および下方制御された遺伝子を示すVolcanoプロット。 f 食欲性vCA1細胞における1104個の示差的に発現される遺伝子(DEG)および嫌悪性vCA1細胞における474個のDEGを示すベン図。両方のグループで 262 DEG が確認されました。 g 嫌悪性および食欲性 vCA1 細胞の両方で 226 個の下方制御された遺伝子、および嫌悪性および食欲性 vCA1 細胞の両方で 35 個の上方制御された遺伝子を示す UpSet プロット。 1 つの遺伝子 (Nufip1) だけが、食欲エングラムでは上方制御されていましたが、嫌悪エングラムでは下方制御されていました。エラーバーは平均値±SEMを表します。

さらに、嫌悪性および食欲性のvCA1細胞で同定された上位20の下方制御されたDEGは互いに重複を示さず、嫌悪性および食欲性のvCA1細胞で上方制御された上位20のDEGのうち14は互いに重複しませんでした（図3d、e、補足表） 1 および 2)、これらのニューロンの異なるトランスクリプトームを裏付けています。興味深いことに、262の共有DEGのうち、食欲性vCA1細胞で上方制御され、嫌悪性vCA1細胞で下方制御される1つの遺伝子Nufip1（核脆弱X精神遅滞タンパク質相互作用タンパク質1）を同定しました（図3g）。この遺伝子は、C2H2 ジンクフィンガーモチーフと核局在化シグナルを含む核 RNA 結合タンパク質をコードしています 28。 NUFIP1 変異に関連する疾患には、生後数週間または数か月で始まる常染色体劣性優勢の進行性神経変性疾患であるペホ症候群 (浮腫、不整脈、視神経萎縮を伴う進行性脳症) が含まれます。その相互作用タンパク質FMRP1は、シナプスにおけるタンパク質合成に必須であり29、FMRP1をコードするFMR1遺伝子のCGG三ヌクレオチド伸長変異は、男性で最も一般的な知的障害である脆弱X症候群を引き起こす30。 NUFIP1 および他の DEG の機能的重要性をさらに調査すると、記憶の原子価が関与するトランスクリプトーム可塑性の機構に関する洞察が明らかになる可能性があります。

嫌悪性および食欲性のvCA1細胞に関連するトランスクリプトームの分子サインについてより深い洞察を得るために、嫌悪性および食欲性のvCA1細胞の上方および下方制御された経路のジーンオントロジー（GO）分析を実行しました（図4a〜d）。我々は、嫌悪性vCA1細胞における最も上方制御される経路には、イオンチャネル型グルタミン酸受容体活性などの神経伝達物質複合体が関与していることを発見した（図4a）。この発見は、文脈的恐怖条件付け後のイオン依存チャネル活性のカテゴリーに富む1,206個の遺伝子に関連する海馬内の3,759個の異なってメチル化されたDNA領域を同定した脳組織を用いた以前の研究と一致している29,31,32。興味深いことに、嫌悪性vCA1細胞における最も下方制御された経路にはDNAミスマッチ修復が関与していることがわかりました（図4b）。食欲性vCA1細胞の上位上方制御経路にはイオンチャネル性グルタミン酸受容体活性も含まれていますが（図4c）、食欲性vCA1細胞の上位下方制御経路は、食欲性vCA1で下方制御される経路とは異なり、軸索組織および微小管束形成が豊富です（図4d）。細胞（図4b）。次に、嫌悪性 vCA1 細胞と食欲性 vCA1 細胞間の RNA-seq データを直接比較しました。 47個の上方制御遺伝子と447個の下方制御遺伝子を含む494個のDEGを同定しました（補足図5aおよび補足表3）。さらに、核エキソソームRNAse複合体などの食欲性エングラムでは5つの経路が上方制御され、軸糸アセンブリなどの嫌悪性vCA1細胞と比較して16の経路が下方制御されていることがわかりました。補足図5b、c）。複数の比較から得られた、嫌悪性vCA1細胞と食欲性vCA1細胞の間で異なって変化したシグナル伝達経路は、これらのニューロンが実際に転写的に異なる部分集団を表すという我々の結論を裏付けるものである。将来の方向性の 1 つは、これらの DEG の機能と変化したシグナル伝達経路を調査することです。概念実証として、GeneMANIA33 を適用して、図 4e-h の上位 20 DEG の機能を予測しました。たとえば、脳特異的血管新生阻害剤2（BAI2）は、嫌悪性vCA1細胞で上方制御されるDEGに対して独自に同定され（図4e）、イオンチャネル性グルタミン酸受容体は、食欲性vCA1細胞で上方制御されるDEGにのみ関係しています（図4g））。同様に、WNTシグナル伝達経路コンポーネントDisheveledは、嫌悪性vCA1細胞で下方制御されたDEGに対して独自に同定され（図4f）、TRPV1-4チャネルは、食欲性vCA1細胞で上方制御されたDEGにのみ関与します（図4h）。これらの予測された遺伝子の損失機能と利得機能の研究により、異なる記憶価数を持つエングラムニューロンの分子シグネチャに関する機構的な洞察が得られるでしょう。

遺伝子オントロジー (GO) モジュールを使用した、嫌悪性エングラムにおける上方制御された経路の遺伝子濃縮セット分析。ドットのサイズは遺伝子数を表し、ドットの色は FDR を示します。 FDR 調整 P 値が 0.25 より小さい経路は、著しく濃縮されていると見なされます。 b 嫌悪性vCA1細胞における下方制御された経路のGO分析。 c 食欲性vCA1細胞における上方制御された経路のGO分析。 d 食欲性vCA1細胞における下方制御された経路のGO分析。嫌悪性 vCA1 細胞および食欲性 vCA1 細胞におけるそれぞれ上方制御および下方制御された遺伝子の上位 20 個の GeneMANIA ネットワーク。赤色のノードを持つ遺伝子は、中立サンプルと比較して嫌悪性 vCA1 細胞で上方制御されます (e) または下方制御されます (f)。緑色のノードを持つ遺伝子は、中立サンプルと比較して食欲性 vCA1 細胞で上方制御 (g) または下方制御 (h) されます。灰色のノードは、これら 20 個の異なって発現される遺伝子と相互作用する遺伝子を表します。各ネットワーク内の InterPro ドメインデータベースによってサポートされる共有タンパク質ドメインは、嫌悪性 vCA1 細胞については赤色で、食欲性 vCA1 細胞については緑色でラベル付けされました。各共有タンパク質ドメインの詳細な説明は、補足表 4 にリストされています。これらの遺伝子間の相互作用ネットワークカテゴリは、パネル g の隣の凡例に注釈が付けられています。

上述のエングラムニューロンにおける異なるトランスクリプトームプロファイルに加えて、最近の研究により、エングラムにおけるエピジェネティックな制御の転写プライミングの役割が明らかになりました 34。動的なエピゲノムランドスケープが異なる価数を持つエングラムニューロンの特異性にも寄与しているかどうかを調べるために、還元表現重亜硫酸塩シークエンシング（RRBS）を実行して、嫌悪性および食欲性のvCA1細胞におけるDNAメチル化ランドスケープを特徴付けました。図5a、bに示すように、中立群と比較して嫌悪性vCA1細胞ではDNAメチル化の変化が20％を超え、p値が0.05未満である1939個の特異的にメチル化されたシトシン（DMC）、および食欲性vCA1細胞では3117個のDMCを同定しました。細胞。これらの DMC は、5'UTR、プロモーター、エクソン、イントロン、3'UTR、転写終結部位 (TTS)、遺伝子間、非コード領域などのゲノムのさまざまな位置に位置しており、転写レベルでの機能出力が異なることを示唆しています。興味深いことに、嫌悪性vCA1細胞におけるこれらのDMCのゲノム分布は、食欲性vCA1細胞におけるものとはわずかに異なります（補足表5）。これらのDMCに基づいて、DMRごとに少なくとも2つのDMCを含む差次的にメチル化された領域（DMR）を特定しました（図5c、d）。これらの DMR を使用すると、これらの DMR を含む、またはそれに近い、示差的にメチル化された遺伝子 (DMG) を同定できます。メチル化レベルの変化が20%を超え、p値が0.05未満である上位20のDMGは、嫌悪性vCA1細胞と食欲性vCA1細胞の間に重複を示さず、異なる記憶価数がDNAメチル化の異なる変化を引き起こすことを示唆しています。食欲性vCA1細胞の266個のDMGと嫌悪性vCA1細胞の98個のDMGのうち、一般的に共有されているのは32個のDMGだけであり（図5e、補足データ1）、エングラム細胞のこれら2つの集団の間の異なるDNAメチル化状況が確認されています。最後に、嫌悪性および食欲性のvCA1細胞におけるDMGのジーンオントロジー（GO）分析を実行しました（図5f、g）。嫌悪性vCA1細胞の経路は主にシナプス接続の構造と機能が豊富であることがわかりました（図5f）。ただし、食欲性vCA1細胞の豊富な経路は、軸索成長、シナプス接続、イオンチャネル、RNAポリメラーゼII転写調節複合体など、はるかに多様です（図5g）。嫌悪性 vCA1 細胞と食欲性 vCA1 細胞の間で異なって濃縮されたこれらの経路は、記憶価の特異性を与える転写レベルでの DNA メチル化に起因する区別された機能出力の可能性を示唆しています。将来の興味深い方向性の 1 つは、記憶の固定と想起の際のこれらの DNA メチル化変化の維持と機能を調査することです。全体として、図 1 と 2 の結果は次のとおりです。図３、４、および５は、嫌悪性および食欲性のｖＣＡ１細胞の異なる分子サインがトランスクリプトームレベルおよびエピゲノムレベルで反映され、記憶の異なる価数に寄与している可能性が高いことを示した。

中立グループと比較して、嫌悪性 a または食欲性 b の vCA1 細胞における DNA メチル化の変化が 20% を超え、p 値が 0.05 より小さい、示差的にメチル化されたシトシン (DMC) を示すボルケーノプロット。さまざまなゲノム位置 (3'UTR、5'UTR、エクソン、遺伝子間、イントロン、非コーディングプロモーター、TSS) の DMC が色分けされています。嫌悪性 c および食欲性 d の vCA1 細胞において、DMR ごとに少なくとも 2 つの DMC を含む異なるメチル化領域 (DMR) を示すボルケーノプロット。上位 10 個の過剰メチル化領域と低メチル化領域が個別にピンクまたは青で強調表示され、最も近い遺伝子に注釈が付けられました。 e 嫌悪性および食欲性のvCA1細胞で同定されたcおよびdのDMRに関連する、異なるメチル化遺伝子（DMG）を示すベン図。 f、嫌悪性vCA1細胞におけるDMGのGO分析。 g 食欲的vCA1細胞におけるDMGのGO分析。

vCA1 は、BLA、NAc、および mPFC35 への単シナプス投射を持つことが知られています。これまでの研究では、これらの脳領域、特に NAc26,36 と BLA24,37 において、これらの脳領域が食欲と嫌悪の両方の経験の調節に重要であることが示されており、各行動について分子的および地形的に異なる細胞集団が同定されている。したがって、最初にAAV9-cFos-tTAとAAV9-TRE-ChR2-EYFPまたはAAV9-TRE-EYFPのウイルスカクテルをvCA1に注入することにより、行動の駆動におけるタグ付きvHPC細胞体とその選択された末端の因果的役割をテストしました。次に、vCA1またはその末端、vCA1–BLA、vCA1–NAc、vCA1–PFCのいずれかの上に光ファイバーを両側に移植しました（図6a）。私たちは最初に、刺激後のcFosレベルの増加を評価することによって、すべての端末が対応する下流ターゲットを活性化できることを発見しました（補足図6）。 10 日間の回復後、マウスの別のグループを DOX から取り出し、嫌悪感 (つまりショック) または食欲旺盛 (つまり、オスとメスの相互作用) の経験をタグ付けしました。図6bに示すように、最初の実験セットでは、1日目に嫌悪タグを付けたマウスをリアルタイム場所嗜好性/回避（RTPP/A）チャンバーに配置し、ベースラインレベルを評価しました。 3 日目に、動物を PTPP/A チャンバーに戻しました。今回は、片側で両側に 20 Hz の光刺激を受け、もう一方の側では刺激を受けませんでした。 vCA1 – BLAまたはvCA1 – NAc末端の光刺激は嫌悪感を引き起こすことがわかりました（図6e、f）が、EYFPコントロール、vCA1細胞体刺激、およびvCA1-PFC末端は統計的にベースラインレベルから逸脱しませんでした（図6c）、d、g）。実験の5日目に、以前に報告されているように、マウスに誘導プロトコルを適用し、エングラムが駆動する行動を切り替える能力をテストしました。嫌悪タグを付けた雄マウスを雌マウスと一緒に新しい部屋に10分間入れ、曝露期間中ずっと光刺激を受けさせた。その後、動物を部屋に戻し、7 日目の行動変化を評価しました。この誘導後テストでは、誘導前に嫌悪感を引き起こしたにもかかわらず、vCA1-BLA 末端の光刺激が嗜好性を駆動するのに十分であることが観察されました。事前にテストしてください (図 6e)。また、誘導プロトコルは、以前は嫌悪感を引き起こすのに十分であったvCA1-NAcターミナルが、行動を調節する能力を逆転またはリセットし、ベースラインレベルに戻ったことも明らかにしました（図6g）。最後に、EYFP コントロール、vCA1 細胞体、または vCA1-PFC 刺激には変化が見られませんでした（図 6c、d、g）。

AAV9-c-Fos-tTA AAV9-TRE-ChR2-EYFP または AAV9-TRE-EYFP のウイルスカクテルをマウスの vCA1 に注射し、光ファイバーを vCA1 の細胞体または vCA1 から BLA までの末端に両側に配置しました。、Nacc、または PFC を別のグループに分けます。次に、マウスに嫌悪体験または食欲体験のいずれかのタグを付け、リアルタイムのオプトプレイス回避と選好を受けさせました。 a vCA1の細胞体とBLA、NAcc、およびPFCのそれぞれの末端のChR2-EYFP標識細胞の代表的な画像。 b 被験者がvCA1細胞体の刺激、またはBLA、NAcc、またはPFC末端へのvCA1投影を受ける恐怖報酬プロトコル。 c–g ベースライン、誘導前、および誘導後における刺激側の好みの割合（EYFP コントロールの場合は n = 7 被験者、vCA1 の場合は n = 8 被験者、BLA の場合は n = 8 被験者、NAcc の場合は n = 7、およびPFC、**P = 0.0018、***P = 0.0006、反復測定一元配置分散分析とそれに続くテューキーの多重比較検定)。 h 被験者がvCA1に由来するBLA、NAcc、またはPFC端末の刺激を受ける恐怖に対する報酬プロトコル。 i–m、ベースライン、誘導前、および誘導後における刺激側の好みの割合（EYFP の場合は n = 7、vCA1 の場合は n = 9、BLA の場合は n = 8、NAcc の場合は n = 7、PFC の場合は n = 7、ns = p > 0.05、**P = 0.0032、****P < 0.0001、反復測定一元配置分散分析とそれに続くテューキーの多重比較検定。エラーバーは平均 ± SEM を表します。)。

次に、BLA、NAc、またはPFCへの食欲タグ付きvCA1端末が行動を調節するのに十分であるかどうかを尋ねました（図6h）。上記の発見と同様に、vCA1-BLA（図6k）およびvCA1-NAc（図6l）末端の光刺激は、他のグループ（図6i、j、m）ではそうではありませんでしたが、駆動するのに十分でした。場所の好み。実験の誘導段階では、マウスを恐怖条件付けチャンバーに入れ、そこで複数回の足にショックを与え、同時に食欲タグを付けた末端に光刺激を与えました。この実験では、これらの vCA1 端末が、上記の実験を反映した方法で優先順位を駆動するための容量を切り替えまたはリセットできるかどうかを評価しました。実際、導入後のテストでは、vCA1–BLAグループは運転嗜好から嫌悪感に切り替わりますが（図6k）、vCA1–NAcグループは運転嗜好からベースラインレベルにリセットします（図6l）。さらに、ニュートラルタグ付き動物ではこの効果は観察されず（補足図7）、EYFPコントロール、vCA1細胞体刺激グループ、またはvCA1–PFCにおけるRTPP / Aタスクの統計的に有意な行動の変化も見られませんでした。刺激グループ（図6i、j、m）。重要なのは、光刺激が運動行動の増加を引き起こすかどうかをテストしたことです。オープンフィールドでの光のオンまたはオフのエポック中に、すべてのグループの移動距離に有意な差は見つかりませんでした（補足図8）。さらに、vCA1 細胞体刺激から観察される選好または回避の欠如は、行動の駆動における vCA1 の役割が末端特異的な方法で決定される可能性を高めました 35。この概念は、特定の細胞体の軸索に沿った計算により、下流のターゲットに応じて動作を差動的に駆動できることを示唆する最近の研究と一致します8。総合すると、これらの結果は、vHPC 細胞体が、部分的に重複していない分子および神経細胞の特徴と明確な投影パターンを共有しているにもかかわらず、行動的に関連する価数特異的な内容を下流の標的に中継していることを示唆しています。これは、vHPC 軸索出力が特定の動作の独立した特徴を優先的に経路指定することを示す証拠によって裏付けられています7。

今回我々は、分子レベル、細胞レベル、および投影特異的レベルで部分的に異なる定義された細胞集団において、vHPC が食欲と嫌悪の経験を処理することを示しました。また、機能的にプラスチックの突起に特化した端末を通じて動作を駆動する能力も実証しました。我々の免疫組織化学的データは、vCA1 には少なくとも 3 つのニューロン集団が含まれていることを示唆しています。1 つは前後の位置と食欲または嫌悪価に対する優先的な反応に基づいて区別できる 2 つのサブセット、もう 1 つは両方に反応し、おそらく生物学的偏向を反映している 3 番目の集団です。顕著性のために5. それらの正確な脳全体の構造的および機能的出力は依然として不明であるが、我々が観察した嫌悪感に反応するvCA1細胞集団は、視床下部25およびPFC38に情報を伝達する最近観察された不安細胞のスーパーセットであると我々は推測している。さらに、嫌悪性または食欲性を処理する vCA1 細胞は、おそらく異なる解剖学的タイプ、受容体タイプ、および細胞タイプで BLA および NAc に情報を送り、それらを神経支配し、特に記憶情報を統合する能力を最適化します 25。

さらに、トランスジェニック活性に依存したタグ付け戦略と全ウイルスベースの蛍光色素発現を組み合わせることにより、我々の設計は、被験者内で複数のアンサンブルを視覚化することを可能にし、これは、2つの別個の活性を有する単一のアンサンブルをモニタリングおよび操作する以前の研究と合体する。タイムポイントも26．これらのアプローチを遺伝子配列決定戦略と組み合わせることで、これらのツールは、嫌悪行動と食欲行動を処理する細胞のタグ付け、操作、および分子文書化を可能にし、脳全体の方法で2つの間の地形的類似点と相違点をカタログ化する可能性を開きます。例えば、将来の研究では、食欲タグと嫌悪タグが付けられたvCA1細胞の前後軸に沿った分子組成を調べ、これらの細胞のトランスクリプトームプロファイルが価数とその物理的位置の両方で異なるかどうかをテストする可能性があります。さらに、vCA1 の食欲タグと嫌悪タグの付いた末端が、扁桃体と海馬内での分離の証拠を示したことは興味深い。その結果、その後の研究では、行動に対するそれらの寄与を機能的に解明し、イメージングと端末固有の摂動アプローチを組み合わせて、それらが送信している情報の種類を測定することを目指す可能性があります。

活動に依存した方法で細胞にアクセスするために使用される膨大な数の遺伝的ツールを考慮すると、エングラムの解釈を制限することが重要です。たとえば、vCA1 アンサンブルは、学習と記憶にわたってサイズと活動パターンが大幅に異なります。これらの数値は単一のパーセンテージの範囲であり、使用する前初期遺伝子マーカー、タグ付け戦略、齧歯動物系統、および使用するウイルスツールに応じて細胞の最大 35% に達する可能性があります 36、39、40、41。適切なことに、我々は、タグ付けが行われるのに必要な時間枠を考慮すると、我々のデュアルタグ付け戦略はタグ付けされた細胞の数を部分的にオーバーサンプリングしていると考えています（例：Dox を停止して 48 時間、4OHT 注射後 72 時間 42、43、44、45）。そして将来の実験では、現代のタグ付けアプローチの時間分解能を向上させて、経験関連のタグ付けとバックグラウンドのタグ付けまたは漏洩性の信号対雑音比を高めることを目指す可能性があります。さらに、cFos+ 細胞は、脳全体に分布するエングラムのサブセットのみを反映し、遺伝子発現のタイムスケールが比較的遅いために活性依存マーカーが捕捉できない可能性がある多数の初期遺伝子、細胞型、および相補的な生理活性を動員します。。実際、cFos+細胞は最近の神経活動を示しますが、最近活動していた細胞は必ずしもcFosを発現する必要はなく、特にcFos発現に独自の閾値を持っていると考えられる脳領域や細胞種全体にわたってcFosを発現する必要はないことに注意してください。これらの点は、メモリエングラムの複雑な性質を強調し、固有の技術的制限を考慮してデータを解釈する際に正当な注意が必要であることを強調しています。私たちは、遺伝的タグ付け戦略と複雑な行動中のリアルタイムイメージングを組み合わせた多面的なアプローチが、神経活動、遺伝子改変、学習と記憶に応じたシステムレベルの変化の間の関係を解くのに役立つと信じています。

私たちの末端操作は、さまざまな単一、二分岐、三分岐プロセスを介した vCA1 細胞体からの情報の末端特異的ルーティングを実証する最近の研究と一致しています 8,46,47。私たちのデータは、活性化されたvCA1末端が好みや嫌悪を引き起こす可能性があるという機能獲得の実証を提供しますが、後者がおそらく細胞体と、すべてではないにしてもほとんどの対応する軸索出力を活性化することを考えると、細胞体の刺激によってこれらは不明瞭になったと考えられます。前者は、別のターゲット領域に投影する vCA1 から出現する一連の端末を選択的に変調し、他のターゲット領域に投影する vCA1 端末には最小限の影響しか与えません。さらに、私たちの価電子スイッチ実験の根底にある分子基盤は不明のままですが、遺伝子に存在する学習と記憶に対する迅速かつ永続的な応答を考慮すると、トランスクリプトームの可塑性が、端末が行動のどの側面を駆動するかを切り替える能力を与える可能性があると考えています。タグ付けされたセルのレベル34。

実際、マウスの海馬における包括的な転写ランドスケープは、記憶の形成と想起の全期間にわたって動的であり、その経験依存性の変化は主に学習後数分以内にタグ付けされた細胞に特異的に存在し、数週間持続します47。今後の実験では、誘導プロトコールの前後に細胞に対してRNA-seqを実行して、その後の転写変化を測定し、そのような機能的可塑性を媒介する推定上の遺伝子座を同定する可能性がある。さらに、我々の配列決定データは、腹側海馬がどのようにして食欲と嫌悪のエングラムを遺伝的に解析するのか、それらの経験がどのようにして個別の遺伝子の上方制御と下方制御に変化を引き起こすのか、そしてこれらの経験がどのように持続的な影響を与えるのかについての理解を深めます。メチル化研究によるエピジェネティックなゲノムの解析 (図 4)。たとえば、将来の研究は、vCA1 とその下流ターゲットの間の分子および射影定義による接続性を MAPSeq1 で評価する最近の研究に基づいて構築することができ、同時にデュアルメモリタグ付けアプローチなどの活動依存コンポーネントを追加して、組織化原理を測定することができます。細胞の歴史を考慮した方法で腹側海馬とその突起を観察します。この研究は特に、腹側海馬の組織とその非ランダムな入出力パターンを特徴付けるための影響力のあるプラットフォームを提供し、このロジックには、食欲と嫌悪の経験が独特の入出力海馬に関与するような、活動に依存して定義された次元が含まれていると仮定します。回路も同様。

最後に、終末が原子価特異的行動を駆動する能力を切り替えたりリセットしたりできる生理学的基盤は依然として不明であるが、将来の研究では、恒常性可塑性、樹状突起の成長と収縮、軸索に沿ったカウンターコンディショニングによって促進される変化などの候補メカニズムが考慮される可能性がある。 vCA1 と BLA または NAc の間の樹状突起インターフェイス24、37。この推測に沿って、これまでの研究では、背側海馬には嫌悪行動や食欲行動を引き起こすのに十分な機能的に可塑的な細胞体の定義されたセットが含まれている一方、BLAには刺激された解剖学的位置に応じて各行動を引き起こすのに十分な固定集団が含まれていることが実証されています。前後軸およびその投影特異的部位7、8、24、25、37。その後の研究は、私たちの二重記憶タグ付けアプローチを利用して、どの細胞タイプと回路が感情的記憶に対してもそのような固定的または経験依存的な反応を示すかを遺伝学的および生理学的にマッピングすることを目的としている可能性があります。私たちの研究では、他の多くの脳領域（BLA24など）で観察されているように、vCA1細胞はそれ自体どちらかの価に固定されているのではなく、経験に依存して食欲不振になるのではないかと考えられます（BLA24など）。ただし、これらの vCA1 細胞のサブセットが、経験に依存しない方法で特定の価数を処理するように優先的に調整される可能性は依然としてあります。実際、経験自体がこれらのニューロンを食欲的または嫌悪的に変化させるという概念は、その後の経験がそれらの能力を柔軟な方法で変化させ、特定の価数に関連する特定の行動を駆動する可能性を排除するものではありません。

さらに、私たちの研究では、図1では価数の基準が満たされていましたが（たとえば、海馬細胞は、刺激の特徴とは独立した方法で、正の価数と負の価数の刺激に対して差動的に反応しました）、その後のデータセットは単一の食欲に焦点を当てていました（徹底的な分子的、解剖学的、および行動的プロファイリングのための、単一の嫌悪感体験（例：男性と女性の社会的相互作用）および単一の嫌悪感体験（例：足へのショック）。重要なのは、価数について直接主張するには、タスク構造を一定に保つ必要があることをここで強調することです。たとえば、現在のデータの別の解釈は、遺伝子濃縮プロファイルと解剖学的分離で観察された違いは、使用されるタスクの固有の違い（例：男性と女性の社会的相互作用と状況的恐怖条件付け）によるものであり、価性そのものではないというものです。。したがって、社会的手がかりと文脈的手がかりのマルチモーダルな統合を必要とする男性と女性の社会的相互作用は、条件付けされた手がかり（たとえば、文脈）が条件付けされた文脈的恐怖条件付けと比較して、独自の遺伝子セットと腹側海馬の解剖学的構造を動員する可能性が依然として残っています。無条件の手がかり（ショックなど）と関連しているため、タスク固有の分子的および解剖学的活動が動員されます。したがって、将来の研究は、単峰性刺激そのものに関連する価数を除いて、環境の特徴がすべてではないにしてもほとんどが一定に保たれるタグ付け体験に焦点を当てる可能性があることを提案します。同様のまたは異なる原子価は、細胞集団に差別的に関与します。これは、図1の同様の価数の複数の経験を利用することによって部分的に説明されると考えていますが、今後の追加実験では、タスク構造と価数をパラメータ的に変化させながら、推定上のネガティブタグとポジティブタグが付いた細胞を画像化する生体内記録アプローチを実装する可能性があります。。この概念に基づいて構築された、当社の RNA-Seq および DNA メチル化データは、健康な状態と病的な状態の両方で、記憶が価数に依存してゲノムの機能を変更する追加の手段を提供します。例えば、我々のメチル化データにより、食欲性vCA1細胞の266個のDMGの中からPin148,49が同定された。このPin148,49は、特にcis p-tauの広がりの調節による神経変性における神経保護特性で知られている。追跡研究では、精神疾患や神経変性疾患を軽減する手段として、これらの DMG を変更することによって、これらの食欲エングラムを活用する可能性があります。

一緒に、我々は、海馬には、時空間単位の情報を処理することに加えて、嫌悪感と食欲情報を処理する個別の細胞のセットが含まれており、内容固有の情報と行動に関連した情報を分子的に定義され投影固有の方法で下流領域に中継していると提案します。このようにして、複数の記憶エングラムのためのマルチシナプスの生物学的基質を集合的に提供します。

FosCreER (Jax ストック: #021882) および野生型雄 C57BL/6 マウス (生後 2 ～ 3 か月; Charles River Labs) をケージあたり 5 匹のマウスのグループで飼育しました。動物の飼育室は、12:12 時間の光サイクル (07:00 に点灯) で維持されました。マウスには、手術前の最低 48 時間、40 mg/kg のドキシサイクリン (Dox) を含む食餌を与え、食餌 (ドキシサイクリン食餌) と水を自由に摂取させました。マウスには術後最低10日間の回復期間が与えられた。活動依存性標識の時間枠を開くために、行動タグ付けの 48 時間前に、Dox 含有食を標準的なマウスの餌に (自由に) 置き換えました 1,2。すべての被験者は、ボストン大学の施設内動物管理使用委員会によって承認されたプロトコール 17-008 に従って治療されました。実験はすべて、AALAC および IACUC 基準によって定められた動物実験および研究に関連するすべての倫理規制に準拠しました。

定位注射と光ファイバーインプラントは、以前に報告された方法に従います1、2。すべての手術は定位固定誘導の下で行われ、その後の座標はブレグマ（mm）に対して与えられ、背腹注射は頭蓋骨に対して計算されゼロに設定されました。マウスを定位固定フレーム（Kopf Instruments、Tujunga、CA、USA）に配置し、導入中は 3% イソフルランで麻酔をかけ、手術中は麻酔（酸素 L/分）を維持するために 1 ～ 2% に下げました。角膜の乾燥を防ぐために両目に眼科用軟膏を塗布しました。除毛クリームで毛を取り除き、手術部位をエタノールとベタジンで３回洗浄した。これに続いて、頭蓋骨を露出させるために切開が行われた。両側開頭術には、直径 0.5 mm のドリルビットを使用して、注射部位の上の頭蓋骨に窓を開けることが含まれていました。 vCA1の座標は、前後方向(AP)が-3.16、中外側方向(ML)が-3.1、背腹方向(DV)が-4.6でした。 BLA の場合、-1.8 AP、± 3.1 ML、および -4.7 DV。 NAc の場合、-1.25 AP、± 1.0 ML、および -4.7 DV。 PFC の場合、1.70 AP、± 0.35 ML、および -2.8 DV。すべてのマウスに、マイクロシリンジ内の 10 μl ハミルトンマイクロシリンジ (701LT; Hamilton) に取り付けられた鉱油を充填した 33 ゲージの斜めの針を使用して、100 μl min-1 の制御速度で部位あたり 300 nl のカクテルを注射しました。ポンプ (UMP3; WPI)。針は、注射後５分間標的部位に留まり、その後除去された。すべてのターゲットについて、両側光ファイバーを注射部位の 0.5 DV 上に配置しました。頭蓋骨に固定された宝石用ネジはアンカーとして機能しました。接着セメント（C&B Metabond）の層に続いて歯科用セメント（AM Systems）の層を手術部位に広げました。手術後、マウスに０．１ｍＬの０．３ｍｇ／ｍｌブプレノルフィンを（腹腔内に）投与し、手術中および回復中に加熱パッド上に置いた。組織学的評価により、ウイルスの標的化と繊維の配置が確認されました。オフターゲット注入からのデータは分析に含まれませんでした。

pAAV9-cFos-tTA、pAAV9-TRE-eYFP、およびpAAV9-TRE-mCherryは、以前に記載されているように構築されました(Ramirez et al., 2015)。注射前に、AAV9-c-Fos-tTA を AAV9-TRE-eYFP または AAV9-TRE-ChR2-EYFP (UMass Vector core) と 1:1 の比率で組み合わせました。このカクテルをさらに 1:1 の比率で AAV9-CAG-Flex-DIO-TdTomato (UNC Vector Core) と組み合わせました。

光ファイバーインプラントは、自動ソフトウェア（Doric Lenses）によって制御される450 nmレーザーダイオードに接続されたパッチコードに差し込まれました。すべての実験の開始時にレーザー出力をテストして、パッチコード (ドリックレンズ) の端に少なくとも 15 mW の出力が供給されることを確認しました。

以前に報告された9、10、11、12ように、動物がDoxを摂取していない場合は、行動タグ付けの48時間前にDox食を標準的な実験用飼料（自由に）に置き換えました。メスの曝露: 1 匹のメスのマウス (PD 30 ～ 40) を、ケージ上部が透明な清潔なホームケージに入れました。次に、実験用の雄マウスをチャンバーに入れ、2時間自由に対話させました。恐怖への曝露: マウスをコンディショニングチャンバーに入れ、8 分間のトレーニングセッション中に 1.50 mA (2 秒) のフットショックを 4 回受けました。タグ付け後、Dox を食餌に再導入し、雄マウスを Dox 食餌を与えられるホームケージに戻しました。 4-OHT タグ付けの場合、4-ヒドロキシタモキシフェン (Sigma: H7904) を 100% エタノールで希釈し、5 分間ボルテックスしました。溶液に入ったら、コーン油を加え、溶液を超音波処理して、１０ｍｇ／ｋｇストックの希釈を達成した。溶液の準備ができたら、4-OHT を注射用のシリンジに充填し、残った溶液は将来使用するために -20℃ に置きました。タグ付けの日に、行動の 30 分後に 200 mg の 10 mg/ml ストック (2 mg 4OHT) を FoscreER マウスに IP 投与し、72 時間静置しました。動物を注射に順応させ、オフターゲットタグ付けを防ぐために、タグ付けプロトコールの前にマウスに生理食塩水またはDMSOを少なくとも2回注射した。

すべての行動分析は、その日の明周期（07:00 ～ 19:00）中に実施されました。すべての行動実験の前に、マウスを 3 ～ 5 日間、1 日あたり 5 ～ 10 分間扱った。テストチャンバーは、光ファイバーホルダー (38 × 23.5 × 42 cm) を備えた特注の長方形のボックスで構成されていました。赤いテープがチャンバーを中央で分割し、2 つの半分を作成しました。刺激の右側と左側はランダム化されました。 1日目はベースラインレベルを評価するために使用され、その間マウスはアリーナを自由に探索するために10分間与えられました。いずれかの側に45〜55％を超える選好を示した場合、動物はベースライン日に再実行されました。動物は、少なくとも45/55の好みを持つまでチャンバーに順応させた。ベースラインが達成されると、最初のエングラムタグの翌日、マウスは、10分間の試験期間にわたって、チャンバーの指定された側に入る際に光刺激（20Hzで15msのパルス）を受けた（群間でバランスがとれた）。マウスが刺激側に入ると、Noldus USB-IO Box を介した EthoVision ソフトウェアからの TTL 信号が刺激発生器 (STG-4008、マルチチャンネルシステム) をトリガーしました。 6 ビデオカメラ (Activeon CX LCD アクションカメラ) で各セッションを記録し、治療条件を知らない実験者が各セッションの時間を記録しました。統計分析には、グループ差スコア[刺激側の時間(秒) - 非刺激側の時間]を比較する一元配置分散分析と、マッチングまたは反復測定の一元配置分散分析を使用した日にわたる変化が含まれていました。動作図は BioRender で作成されました。

光遺伝学的恐怖誘発のために、被験者は光刺激 (20 Hz、15 ミリ秒) を伴うショックチャンバーに 500 秒間置かれました。フットショック(1.5mA、2秒間)を198秒、278秒、358秒、および438秒の時点で投与した。光遺伝学的報酬誘導中、最初の恐怖タグとは別の部屋で、被験者はメスのマウスと一緒に清潔なホームケージに入れられました。光刺激 (20 Hz、15 ms) を雄マウスに 10 分間加えました。

免疫組織化学は、以前に報告されたプロトコルに従います15、16、18。マウスに 3% イソフルランを過剰投与し、冷 (4 °C) リン酸緩衝生理食塩水 (PBS)、続いて PBS 中の 4% パラホルムアルデヒド (PFA) で経心的に灌流しました。脳を抽出し、PFA 中で 4 °C で一晩保存しました。ビブラトームを使用して50μmの冠状切片を順番に収集し、冷PBSに収集した。切片を、シェーカー上でＰＢＳＴおよび５％正常ヤギ血清（ＮＧＳ）またはウシアルブミン血清（ＢＳＡ）中で室温で１時間ブロックした。切片を一次抗体（1:1000 ギニア抗 c-Fos [SySy]、1:1000 ウサギ抗 RFP [Rockland]、1:5000 ニワトリ抗 GFP [Invitrogen]）を含むウェルに移し、培養上でインキュベートしました。次いで、切片を PBST で 10 分間 (x3) 洗浄し、二次抗体 (1:200 Alexa 555 anti-rabbit [Invitrogen]; 1) と 2 時間インキュベートしました。 :200 Alexa 抗ギニア 647 [Invitrogen]; 1:200 Alexa 488 抗ニワトリ [Invitrogen])。さらにＰＢＳＴで１０分間洗浄を３回行った後、切片をマイクロスライド（ＶＷＲＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，ＬＬＣ）上にマウントした。 DAPI を含む Vectashield Hart Set mounting Medium (Vector Laboratories, Inc) を適用し、スライドにカバースリップをかけて、一晩乾燥させました。

正確な両側注射を行った動物のみを定量化のために選択した。蛍光画像は、20X 対物レンズで共焦点顕微鏡 (Zeiss LSM800、ドイツ) を使用して取得しました。 cfos の定量化のために、行動の 90 分後にすべての動物を屠殺し、免疫組織化学的分析を行いました。 vCA1 内の EYFP、TdTomato、および c-Fos 免疫反応性ニューロンの数を数えて、それぞれの領域の活性細胞の数を測定しました。マウスあたり 3 ～ 5 枚の冠状スライス (互いに 50 μm の間隔)、平均値を取得。各 N 値には、3 ～ 5 匹のマウスに対する 3 ～ 5 個の画像定量化が含まれます。設定された関心領域 (ROI) 内の eYFP 陽性、TdTomato 陽性、c-Fos 陽性、および DAPI 陽性細胞の数は、ImageJ (https://imagej.nih. gov/ij/)。 ROI のサイズは、脳、動物、実験、グループ全体で標準化されました。 2 つのカウンターは実験グループと対照グループを認識しませんでした。タグ付き細胞の割合を計算するために、蛍光陽性細胞の数を数え、それらを DAPI 細胞の総数で割りました。重複は、DAPI に対するパーセンテージとしてもカウントされました。たとえば、EYFP と TdTomato の両方について陽性の細胞は、DAPI に対してカウントされました。ベン図チャートは、DAPI ではなく 100% に正規化された EYFP + 、TdTomato + 、および cfos+ 細胞の割合の代表的なグラフです。

50ミクロンの冠状切片を、上記のようにニワトリ抗GFP(1:1000)およびウサギ抗RFP(1:1000)で染色した。蛍光画像は、共焦点顕微鏡 (Zeiss LSM800、ドイツ) を使用して 20 倍の倍率で撮影しました。すべてのレーザーおよびイメージング設定は、すべての動物およびイメージングされたすべての脳領域にわたって一貫して維持されました。関心領域 (ROI) は、画像、セクション、動物全体で一貫して維持されました。 ROI は、ランドマークを使用し、Paxinos & Franklin Mouse Brain Atlas を参照して特定されました。蛍光の定量化は ImageJ で実行されました。選択ツールを使用して ROI を手動で選択した後、領域統合密度と平均グレー値の情報を収集するように設定しました。画像はEYFPとTdTomatoについて別々に分析されました。各画像内で、正規化の手段を得るために、末端の平均蛍光および陰性領域のバックグラウンド/ベースラインレベルに関する情報を収集しました。ここから、修正のために次の式を使用しました。

全蛍光 (CTF)50,51,52

これにより、対象となる EYFP 対 TdTomato 端末の平均蛍光強度の任意の単位が得られました。

取得した画像ファイル(.czi)をImageJで開きました。図 1 の画像の処理には、強度の最大化、外れ値ノイズの除去、および画像のコントラストの調整が含まれます。

条件付け後に ChR2-YFP 導入遺伝子 1 で標識した生後 5 週齢の雄マウスをイソフルランで安楽死させました。マウスの脳を迅速に抽出し、顕微解剖によって海馬領域を分離しました。 8匹のマウスを各実験条件ごとにプールした。単一細胞懸濁液は、成人脳解離キット (Miltenyi Botec、カタログ番号: 13-107-677) のガイドラインに従って調製されました。簡単に説明すると、gentleMACS プログラム: 37C_ABDK_01 を備えたヒーター付きのgentleMACS Octo Dissociator 上に置かれた C チューブ内で、海馬サンプルを消化酵素とともにインキュベートしました。プログラム終了後、MACS SmartStrainer (70 μm) を通してサンプルを適用しました。次いで、破片除去ステップおよび赤血球除去ステップを適用して、単一細胞懸濁液を得た。

単一細胞懸濁液を、メーカーのプロトコルに従って BD FACSAria セルソーターにかけ、EYFP 単一細胞集団を単離しました。

FACSで単離されたYFP陽性細胞のRNAを、Trizol(Life Technologies)を使用し、続いてDirect-zolキット(Zymo Research)を製造業者の指示に従って使用することによって抽出した。次に、SMART-Seq® v4 Ultra® Low Input RNA Kit (TaKaRa) を使用して RNA-seq ライブラリーを調製しました。

Illumina からの結果として得られた読み取りは、FastQC53 で確認したところ良好な品質でした。リードの最初の 40 bp は、STAR26 を使用してマウスゲノム (mm10) にマッピングされ、Ensembl GRCm38.91 遺伝子アノテーションでインデックス付けされました。読み取り数は、unstructed オプション 55 を指定した Subread パッケージの featureCounts54 関数を使用して取得されました。リードはライブラリーサイズによって正規化され、負の二項分布に基づく示差的発現分析がDESeq256で行われました。 FDR 調整後の p 値が 0.00001 未満プラス 4 倍を超える差を持つ遺伝子は、差次的に発現しているとみなされました。生データは遺伝子発現レベルとともに NCBI Gene Expression Omnibusas GSE198731 に寄託されています。遺伝子オントロジー分析では、タンパク質をコードする遺伝子をその倍率変化によってランク付けし、GseaPreranked ツールの入力として使用しました57。 GSEA の出力に基づいて、カスタム R スクリプトを使用してドットプロットが作成されました。 FDR 調整後の p 値が 0.25 未満の経路は濃縮されているとみなされました。 GeneMANIA ネットワークは GeneMANIA33 によって解析されました。結果として得られる遺伝子の最大数は 20、結果として得られる属性の最大数は 10 でした。すべてのネットワークに等しい重みが割り当てられました。ネットワークプロットは Cytoscape58 によって生成されました。

FACSで単離されたYFP陽性細胞のゲノムDNAを、DNeasy Blood & Tissue Kit（Qiagen）を製造業者の指示に従って使用することにより抽出した。次に、ゲノム DNA を MspI 酵素 (NEB) で消化し、EpiNext™ DNA サイズ選択キット (EpigenTek) を使用してサイズを選択し、100 ～ 600 bp の DNA 断片を濃縮しました。選択された DNA フラグメントを使用して、EpiNext™ High-Sensitivity Bisulfite-Seq Kit (EpigenTek) を製造業者の指示に従って使用して配列決定ライブラリーを調製しました。

生のリードは、cutadapt59 を使用してトリミングされ、Bismark60 を使用してマウスゲノム (mm10) にマッピングされました。MOABS61 の Mcomp モジュールを使用して、異なるメチル化シトシン (DMC) および領域 (DMR) を呼び出しました。少なくとも 5 つのリードでカバーされたシトシンのみがさらなる分析に使用されました。 DNA メチル化レベルの差が 0.2 より大きく、フィッシャー正確検定の P 値が 0.05 より小さい場合は、DMC とみなされました。生データは、GSE208137 として NCBI Gene Expression Omnibus に寄託されます。異なるメチル化領域には少なくとも 2 つの DMC が含まれており、2 つの DMC 間の最大距離は 300 bp でした。 DMC および DMR の注釈には Homer62 ソフトウェアが使用されました。 GO 分析は R パッケージのclusterProfiler63によって行われました。

FosCRE-ERT2 雄マウスの腹側海馬に、AAV-CAG-FLEX-TdTomato + AAV-cfos-tTA + AAV-TRE-EYFP を 1:1 の比率で注射しました。動物は実験のために平衡を保たれ、半分には4OHTによる食欲的タグ付けとDoxによる嫌悪性タグ付けを受け、残りの半分には4OHTによる嫌悪性タグ付けとDoxによる食欲的タグ付けを受けました。腹側海馬の冠状スライスは、タグ付け経験から 3 ～ 5 日後に、以前に注射された動物から調製されました。動物をイソフルラン麻酔で深く麻酔し、首を切り落とし、脳を取り出した。脳スライスは酸素灌流スクロース代替人工脳脊髄液 (ACSF) 中で調製されました。溶液には、185 mM NaCl、2.5 mM KCl、1.25 mM NaH2PO4、mM MgCl2、25 mM NaHCO3、12.5 mM グルコース、および 0.5 mM CaCl2 が含まれていました。 400 μm スライスを Leica VT 1200 (Leica Microsystems) で切り出し、125 mM NaCl、25 mM NaHCO3、25 mM D-グルコース、2 mM KCl、2 mM CaCl2、1.25 mM NaH2PO4、および 1 からなる 30 °C ACSF 中でインキュベートしました。 mM MgCl2 に 20 分間加えた後、室温まで冷却しました。二光子イメージングシステム (Thorlabs Inc.) を使用して、食欲細胞と嫌悪細胞を区別しました。イメージングシステムには、モードロック Ti:Sapphire レーザー (Chameleon Ultra II、Coherent) が装備されており、20 倍の NA を使用して Alexa Fluor 488 および 568、tdTomato および EYFP 蛍光色素を励起するために、920 nm ～ 950 nm の波長に設定されています。 1.0対物レンズ（オリンパス）。 2 つの集団間の差異がニューロンのタグ付けに使用されたウイルスの種類に起因しないことを確認するために、2 つのグループの動物を用意しました。 1つのグループでは食欲的な記憶はtdTomatoでタグ付けされ、嫌悪的な記憶はEYFPでタグ付けされ、もう1つのグループではその逆です。先端が 0.6 ～ 1 μm のパッチクランプ電極を水平プーラー (Sutter Instruments) を介して引っ張り、ピペット抵抗を 4 ～ 6 MΩ の間で記録しました。ピペットは、120 mM グルコン酸 K、20 mM KCl、10 mM HEPES、7 mM diTrisPhCr、4 mM Na2ATP、2 mM MgCl2、0.3 mM Tris-GTP、および 0.2 mM EGTA を含む細胞内液で満たされました。 KOHでpH 7.3に緩衝。 0.15% 重量/体積の Alexa Fluor (Thermo Fisher Scientific) 488 ヒドラジド (tdTomato 細胞からの記録用) または 567 (EYFP 細胞からの記録用) を添加して、イメージングシステムの下で記録ピペットを視覚化しました。セルに侵入する前に、ピペットの静電容量の中和とブリッジバランスの補正が実行されました。データは、Multiclamp 700B (Molecular Devices) および Digidata 1550 (Molecular Devices) を使用し、サンプリングレート 10 kHz で取得しました。

脳スライスの電気生理学データ分析は、pyABF パッケージ (http://swharden.com/pyabf/) を使用してカスタム作成されたスクリプトを使用して Python で実行されました。スパイク形状解析の場合、スパイクの開始はその一次導関数を使用して特定され、対応する電圧はスパイク開始と呼ばれます。スパイク半値幅は、ピーク電圧の 2 つの半分の間の時間を示します。スパイク特性の動的解析のために、段階的な電流注入が実行されました。発火閾値はニューロンが少なくとも単一のスパイクを発火する電圧であり、発火開始は対応する電流です。 FI ゲインは、最低点火周波数から最高点点火周波数までの点火周波数の変化を注入電流で割ったものとして計算されました。適応率は、スパイクの最後の 200 ms の平均スパイク間間隔 (ISI) をスパイクの最初の 200 ms の平均 ISI で割ることによって得られました。食欲記憶細胞と嫌悪記憶細胞の比較は、動物またはスライス間の潜在的な差異を制御するために、単一スライス内、動物内、および動物間で行われました。 3 つの状況すべての結果が類似していたので、異なるグループを比較するためのプールされたデータ d'Agostino-Pearson K2 検定を使用してデータの正規性を決定しました。正規性の結果に基づいて、独立した t 検定 (正規分布) またはボンフェローニ補正を使用した両側のマン・ホイットニー・ウィルコクソン検定のいずれかが使用されました。

被験者はランダムにグループに割り当てられました。サンプルサイズを決定するために統計的手法は使用されませんでした。グループあたりの被験者の数は以前に発表された研究の数に基づいており、図のキャプションで報告されています。

行動実験は、3 人の異なる実験者を用いて少なくとも 3 回繰り返されました。最初の実験は別の機関で行われ、最後の 2 回の反復はボストン大学で行われました。行動に関する調査結果は、実験者 (男性 1 名、女性 2 名) にまたがってだけでなく、施設間でも同様でした。元の所見を確認するために、配列データも 2 回複製しました。すべての行動カウンターおよびセルカウンターおよびスコアラーは、実験グループと対照グループについて盲検化されました。

行動実験については、7 ～ 10 の範囲のサンプルサイズで実施されました。標的を誤った動物、またはウイルスが一方的に発現した動物は実験から除外された。組織学的分析の場合、サンプルサイズはグループごとに 3 ～ 4 匹の動物の範囲でした。 RNA シーケンスまたは RRBS データは、実験グループあたり 8 匹の動物からなるプールされたサンプルグループを使用して実施されました。モック、またはタグなしのコントロールのサンプルサイズは 2 匹のマウスでした。電気生理学実験の場合、サンプルサイズは 4 ～ 8 匹の動物の範囲でした。データは、Prism (GraphPad Software、カリフォルニア州ラホーヤ) を使用して分析されました。データは、必要に応じて、対応のある t 検定 (2 因子)、対応のない t 検定、一元配置または二元配置 ANOVA と反復測定 ANOVA (3 つ以上の因子) を使用して分析されました。事後分析（Tukey の多重比較検定）を使用して、統計的に有意なアルファが p < 0.05 に設定された場合（両側）、治療効果と相互作用効果を特徴付けました。統計分析は図のキャプションで報告されています。表示された棒グラフを含むすべてのグラフは、平均の標準誤差 (SEM) を表します。

研究デザインの詳細については、この記事にリンクされている Nature Research レポートの概要をご覧ください。

RNA シーケンスおよびメチル化データは、NIH プラットフォーム、Gene Expression Omnibus (GEO) を通じて公開されており、それぞれ RNA-seq データ: GSE198731 および RRBS-seq データ: GSE208137 として提供されます。行動データは上級著者のリクエストに応じて入手できます。図の基礎となるソースデータ。 1、2、3、および 6 は補足データ 2 にあります。この研究の結果を裏付ける追加データは、合理的な要求に応じて責任著者から入手できます。

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最初の実験が行われた研究室スペースを提供してくださったハーバード大学脳科学センターのジョシュア・サンズ博士とその研究室、特に研究室の初期メンバーであるエミリー・マーフェルド氏、エミリー・ドゥーセット氏、ステファニー・グレラ氏、ジョセフ氏に感謝します。ザキ。さらに、技術サポートを提供してくれた脳科学神経工学センターとハーバード大学フェロー協会のサポートに感謝します。この研究は、NIH 早期独立賞 (DP5 OD023106-01)、NIH Transformative R01 賞、脳行動研究財団からの若手研究者助成金、ルートヴィヒファミリー財団助成金、マックナイト財団記憶障害賞、ボストン大学システム神経科学センターおよびニューロフォトニクスセンター、およびコロンビア大学スタートアップパッケージ (UR011118)。

神経科学大学院プログラム、ボストン大学、ボストン、02215、MA、米国

モニカ・シュポケイト

ボストン大学システム神経科学センター心理脳科学部、ボストン、02215、マサチューセッツ州、米国

モニカ・シュポカイト、エヴァン・ルシュ、スティーブ・ラミレス

神経科学大学院プログラム、ブラウン大学、プロビデンス、02912、ロードアイランド州、米国

オリビア・マッキシック

生理学および細胞生物物理学科、コロンビア大学医療センター、ニューヨーク、10032、ニューヨーク、米国

シャオナン・グアン & X. ショーン・リュー

ホワイトヘッド生物医学研究所、MIT、ケンブリッジ、02142、MA、米国

ユアン・ビンビン

ボストン大学生体医工学部、ボストン、02215、MA、米国

バハール・ラーセパー、フェルナンド・R・フェルナンデス、ジョン・A・ホワイト、スティーブ・ラミレス

ニューロフォトニクスセンターおよびボストン大学フォトニクスセンター、ボストン、02215、MA、米国

バハール・ラーセパー、フェルナンド・R・フェルナンデス、ジョン・A・ホワイト

ロヨラ大学シカゴ心理学部、シカゴ、イリノイ州、60660、米国

ステファニー・L・グレラ

PubMed Google Scholar でこの著者を検索することもできます

MS と OM は組織学を実施し、分析しました。 MS、OM、ER は光遺伝学的実験を実行し、分析しました。 BY、XG、および XSL は、RNA シーケンスと Reduced Representation Bisulfite シーケンスおよび対応する分析を実行しました。 BR、FRF、JAW は in vitro 生理学的実験と分析を実施しました。 MS、OM、XSL、SR がプロジェクトを設計しました。 MSXSL と SR が原稿を書きました。 SLG は統計分析を実施しました。著者全員が原稿を編集しコメントしました。

X.ショーン・リューまたはスティーブ・ラミレスへの通信。

著者らは競合する利害関係を宣言していません。

主な取り扱い編集者: George Inglis。この原稿は、別の Nature Portfolio ジャーナルで以前にレビューされています。この原稿は、Communications Biology でのさらなる審査なしで出版に適していると考えられました。

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転載と許可

Shpokayte, M.、McKissick, O.、Guan, X. 他海馬細胞は、陽性エングラムと陰性エングラムを分離します。 Commun Biol 5、1009 (2022)。 https://doi.org/10.1038/s42003-022-03906-8

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受信日: 2022 年 6 月 21 日

受理日: 2022 年 8 月 26 日

公開日: 2022 年 9 月 26 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s42003-022-03906-8

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ネイチャー神経科学 (2023)

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