VEGF | 吉林省パッチケーブルグループ

分子精神医学 (2023)この記事を引用

メトリクスの詳細

脳における自然免疫の活性化は、アルツハイマー病 (AD) の顕著な特徴です。本研究では、トランスジェニック AD マウスモデルにおける野生型血清注射による自然免疫の制御を調査しました。我々は、野生型マウス血清による治療により、APP/PS1 マウスの脳内の好中球の数とミクログリアの反応性が大幅に減少することを発見しました。この効果を模倣して、Ly6G 中和抗体による好中球の除去は AD 脳機能の改善をもたらしました。血清プロテオーム解析により、血清サンプルに豊富に含まれる因子として血管内皮増殖因子 A (VEGF-A) とケモカイン (CXC モチーフ) リガンド 1 (CXCL1) が同定され、これらは好中球の遊走と走化性、白血球の遊走、細胞の走化性に重要です。外因性 VEGF-A は、in vitro でアミロイド β (Aβ) 誘発性のサイクリン依存性キナーゼ 5 (Cdk5) の減少と CXCL1 の増加を逆転させ、AD 脳への好中球浸潤をブロックしました。内皮 Cdk5 の過剰発現は CXCL1 および好中球浸潤に対する阻害効果をもたらし、それによって APP/PS1 マウスの記憶能力が回復しました。我々の発見は、血液由来のVEGFシグナル伝達と好中球浸潤との間のこれまで知られていなかった関連性を明らかにし、ADの潜在的な治療戦略として内皮Cdk5シグナル伝達を標的とすることを裏付けるものである。

アルツハイマー病 (AD) は、主に高齢患者に影響を与える一般的なタイプの認知症です。脳内のアミロイドベータ (Aβ) と神経原線維変化 (NFT) は、AD の主な病理学的特徴です。免疫細胞や関連サイトカインを含む循環因子が、AD マウスモデルの病理学的変化に関連している可能性があることを示唆する証拠が増えています[1、2、3、4、5]。末梢血中に最も豊富な自然白血球である好中球は、認知症を伴う AD 患者の血液 [6]、AD 患者の脳実質 [7、8]、およびいくつかの AD マウスモデルで増加していることが判明しています。 [4、9、10、11]。さらに、若いマウスの血液中の全身性因子は、老化したマウスの神経新生、シナプス可塑性、および認知機能を若返らせることができ[12、13]、またその逆も同様である[14]。このことは、全身性因子が宿主の行動、免疫の調節において重要な役割を果たしていることを示している。、および脳機能[15、16、17]。したがって、これらの研究は、好中球を含む自然免疫がアルツハイマー病の発症に重要な役割を果たしている可能性があることを示唆しています[4、6、7、8、18]。しかし、このメカニズムが若い血液を使用する治療や循環因子を含むその他の治療戦略にどのように関連しているのかについてはほとんどわかっていません。さらに、アルツハイマー病脳における自然免疫の恒常性の根底にある重要な全身的要因はまだ解明されていない。

血液由来の因子として、血管内皮増殖因子 A (VEGF-A) シグナル伝達は、AD 関連の神経変性と認知機能低下の停止に関与していることが示されています [19、20、21]。 VEGFシグナル伝達が不十分であると、マウスの脳認知を含む多臓器の老化に影響を与えることがわかっているが、VEGFシグナル伝達が強化されると、加齢に伴う脳の毛細血管の喪失を防ぎ、寿命を延ばすことができる[22]。 VEGF-A はまた、若いマウスの海馬の神経新生を増加させ [23、24]、加齢に関連する循環因子の必須センサーである海馬内皮細胞にシグナルを送ることができます [25]。 VEGF は、Aβ 誘発性 AMPA 受容体の喪失を防ぎ、シナプスへの直接作用を通じてシナプス機能不全を救済することがわかっています [26]。

この研究では、APP/PS1 マウスに野生型血清を注射した後、末梢および脳で炎症性好中球の数が減少することを明らかにしました。我々はさらに、APP/PS1 マウスの脳への好中球浸潤の過程における内皮 VEGF-A/サイクリン依存性キナーゼ 5 (Cdk5)/ケモカイン (CXC モチーフ) リガンド 1 (CXCL1) シグナル伝達の役割を解明しようと努めました。我々の結果は、脳内の免疫微小環境のバランスを再調整するための好中球および/または分子輸送シグナル伝達を標的とすることが、アルツハイマー病治療にとって有望な戦略であることを実証している。

C57BL/6 バックグラウンドを持つ生後 8 か月の雄 APP/PS1 (APPswePSEN1dE9) トランスジェニックマウス、年齢を一致させた野生型 (WT) マウス、および生後 4 ～ 6 週の雄 C57BL/6 マウスを、南京大学南京生物医学研究所（中国、南京）。ヒト KM670/671L 変異 APP 遺伝子と M146L 変異 PSEN1 遺伝子を共発現する APP/PS1 トランスジェニックマウスの両方の導入遺伝子のプロモーターは、マウスプリオンタンパク質のリードスルー転写物 (Prn) によって制御されます。 Cx3cr1-GFP トランスジェニックマウス (B6.129P-Cx3cr1tm1Litt/J) は、Jackson Laboratory (ストック番号: 005582) から購入しました。 250 mg/kg トリブロモエタノール (T48402、Sigma-Aldrich、セントルイス、ミズーリ州、米国) および 2.5% tert-アミルアルコール (240486、Sigma-Aldrich、セントルイス、米国) の腹腔内 (ip) 注射を使用して動物を麻酔しました。 MO、USA) 0.22 µm フィルター (Millipore、MA、USA) で濾過して血液を収集し、採取前に脳を冷生理食塩水および/または 4% PFA で灌流しました。すべての動物は温度と湿度が制御された条件下で飼育され、12 時間の明暗サイクル環境で維持されました。すべての実験プロトコルは、中山大学の施設内動物管理使用委員会の規定に準拠しました。 OFTおよびMWMテストで動かなくなったり、実験前または実験中に死亡したりするなど、明らかな病気のような行動の状態を示した動物は実験から除外されました。

マウス血清は、眼窩後出血後の若い雄 C57BL/6 マウス (n = 150、4 ～ 6 週齢) から収集されました。室温で 1 時間、4 °C で一晩インキュベートし、4000 × g で遠心分離した後、全血から血清を調製しました。プールしたマウス血清を孔径 0.22 µm の滅菌シリンジフィルター (Millipore) でろ過し、Slide-A-Lyzer™ カセット (Thermo Scientific) を使用して透析し、-80 °C で保存しました。生後8か月の雄APP/PS1マウス（n = 20）と同年齢のWT同腹子（n = 20）を、尾部に血清（200μL/注射）9回注射または等量の滅菌PBSで全身治療した。 3日ごとに静脈に投与します。恐怖条件付けテストの 48 時間後にすべてのマウス (生後約 9 か月) を屠殺しました。行動試験では n = 7 ～ 10、組織学的および生化学的アッセイでは n = 4 ～ 15 [27]。サンプルサイズは、AD における同様の以前の研究に基づいて選択されました [3、4、10]。すべてのサンプルは、ほぼバランスのとれたサンプルサイズを持つグループにランダムに割り当てられました。

恐怖条件付けは、幅 20 cm × 奥行き 20 cm × 高さ 30 cm の内寸を持つチャンバー (Coulbourn Instruments、米国) で実施されました。雄マウスを個別に試験チャンバーに入れました。ベースライン時間 (192 秒) の後、動物は 3 回のトーンショックペアリングを受けました。条件刺激 (CS) は純音 (持続時間 20 秒、4000 Hz、60 dB) で、その直後に連続的にスクランブル電気ショックがグリッド床に送られました (無条件刺激、US: 2 秒、0.5 mA)。各トーンショックペアリングの後に 64 秒間続け、マウスは 3 回目のショック後さらに 64 秒間状況 A に留まりました。条件付けの 24 時間後、マウスを試験チャンバーに 320 秒間戻し、凍結時間を記録しました (状況条件付け)。続いて、動物を、無香料の黒いプラスチックの内壁と床に寝具を敷いた新しい部屋に移し、192秒のベースライン期間中のすくみのスコアを付けた後、条件付けされた刺激と同じ音に320秒間曝露した（手がかり条件付け）。）。詳細なプロトコルは以前に説明されています[28]。

MWM テストは、以前に記載されているように、わずかに変更を加えて雄マウスを使用して実施されました [29]。簡単に説明すると、獲得段階では、マウスに、プールの内壁に置かれた明確な視覚的手がかりを使用して、プールの水面下 1.0 cm に位置する隠れたプラットフォームを見つける訓練試行を 1 日あたり 1 回与えました。各試行に与えられた最大時間は 60 秒でした。 1 匹のマウスは 60 秒以内にプラットフォームに到達できなかったため、手動でプラットフォームまで誘導し、ケージに戻す前に 10 秒間留まりました。各マウスの試行間隔は 10 分でした。プローブ段階では、プラットフォームが取り外され、マウスは逃げることができない状態で 60 秒間続く 1 回の試験が行われました。水泳の軌跡は、TopScanTM 2.0 (米国バージニア州レストンの Clever Sys., Inc.) ビデオ追跡システムで記録されました。すべての行動テストは、消灯フェーズの 10:00 から 17:00 の間に実行されました。

深い麻酔下で、マウスに冷滅菌生理食塩水を経心的に灌流し、脳を直ちに摘出した。一方の半球を液体窒素で凍結し、もう一方の半球を 4% パラホルムアルデヒドに 4 °C で 24 時間浸漬固定し、0.1 M リン酸緩衝液 (PB) 中の 15% スクロース、続いて 30% スクロースで平衡化しました。次に、Leica SM2000R スライディングミクロトーム (Leica Microsystems、リッチモンドヒル、オンタリオ州、カナダ) を使用して海馬の厚さ 40 μm の凍結切片を収集し、免疫蛍光染色が実行されるまで 4 ° C で保存しました。脳スライスは、240 μm の間隔をあけた 5 つの冠状スライスの連続した等距離で選択されました。凍結した半球をホモジナイズし、以下を含むRIPA（放射性免疫沈降アッセイ）緩衝液（50 mM Tris-HCl、pH 7.4、150 mM NaCl、1% Triton X-100、1% デオキシコール酸ナトリウム、および0.1% SDS）中で4℃で抽出しました。 TissueRuptor ホモジナイザー (Qiagen、DUS、ドイツ) を使用した 1% ホスファターゼ阻害剤および 1% プロテアーゼ阻害剤 (Sigma-Aldrich、ミズーリ州、米国)。ホモジネートを 12,000 × g (Eppendorf, HAM, Germany) で 30 分間遠心分離し、上清を RIPA 可溶性画分として収集しました。ペレットを2% SDSおよび50 mM Tris-HCl、pH 7.4で再抽出した。上清をSDS可溶画分として回収した。

以下の一次抗体を使用しました：マウス抗 Aβ1-42 (1:1,000; A5213、Sigma-Aldrich)、ラット抗 CD68 (1:400; MCA1957、Bio-Rad)、ウサギ抗 Iba-1 (1:1,000; A5213、Sigma-Aldrich) 1,000; 和光化学）、マウス抗グルタミン酸受容体 1（1:400; ab183797、Abcam）、マウス抗シナプトフィジン（1:200; S5768、Sigma-Aldrich）、ラット抗マウス Ly6G（1:200; BP0075、 Bioxcell）、マウス抗ミエロペルオキシダーゼ（MPO、1:1,000; AF3667-SP、研究開発）、マウス抗好中球エラスターゼ（NE、1:1000; MAB4517-SP、研究開発）、ラット抗Ki67（1:500; SolA15）、eBioscience）、ウサギ抗Claudin5ポリクローナル抗体（1:400; YT0953、Immunoway）、マウス抗pCdk5（1:400; C-7、Santa Cruz）およびマウス抗Cdk5（1:400; DC 17、Santa Cruz））。以下の二次抗体を使用しました:Alexa Fluor 647 ロバ抗マウス、Alexa Fluor 594 ロバ抗ラット、Alexa Fluor 488 ロバ抗ヤギ、Alexa Fluor 555 ヤギ抗ウサギ、および Alexa Fluor 488 ヤギ抗ウサギ (1: 400、インビトロジェン）。 PE 結合抗 CD31 (1:100; 553373、B&D)、FITC 結合抗 CXCL1 (1:100; IC4532G、B&D)、および DyLight 649 標識レクチン (1:200; L32472、InvitrogenTM) 抗体を使用しました。いくつかの免疫蛍光実験。詳細な免疫蛍光プロトコルは以前に記載されています[30]。

LSM 780 または 800 共焦点レーザー走査型顕微鏡 (Carl Zeiss Microscopy) を使用して、潜在的な技術的アーチファクトを回避するために同じパラメーターを使用して切片の代表的な画像をキャプチャしました。 ImageJ ソフトウェア (NIH) を使用して、各画像の対象領域における蛍光シグナルの平均強度を定量化しました。補足図4の共局在の分析については、ZEN 2.3（Carl Zeiss Microscopy）を使用したCdk5およびpCdk5とCXCL1の蛍光強度プロファイル分布分析。詳細な説明では、ZEN 2.3 (青版) を使用して共焦点蛍光顕微鏡を開き、「処理」を選択し、次に「プロファイル定義」を選択すると、蛍光シグナル分布が矢印を横切るグラフィックで表示されます。蛍光強度データリストは「プロファイルテーブル」にあります。 3D 再構成では、LSM 780 顕微鏡によるデジタルズーム 2.0 を備えた 63 倍油浸レンズを使用して、元の共焦点 Z スタック画像が取得されました。次に、Imaris ソフトウェア (Bitplane、バージョン 8.4) を利用して、「サーフェスツール」を使用して 3D 再構成画像をレンダリングし、取得しました。再構成後、図 7H (右) および I に示すように、デジタルズームツールを使用して画像を拡大しました。GluA1+ 涙点は、「スポットツール」を使用してレンダリングされました。ミクログリア内部に分布する涙点は、飲み込まれたシナプス涙点として定義されました。ミクログリア表面およびミクログリアの外側に分布する接触涙点からの距離は0μm未満であるが、ミクログリア表面からの距離は0.25μm未満である。

末梢血単核球 (PBMC) 分析のために、別のセットの APP/PS1、APP/PS1 + 血清、および APP/PS1 + Ly6G マウスからの 200 µL の全血サンプルを、1% ヘパリンナトリウムを含む 2 mL 遠心管に収集しました ( 10μL）。抗凝固後、溶液を等量の滅菌生理食塩水で希釈した。 PBMC は、製造元の指示に従って塩化アンモニウム - カリウム (ACK) 溶解緩衝液を使用して単離されました。動物に冷たい滅菌生理食塩水を灌流して残りの末梢血を除去し、脳を採取した。脳免疫細胞の生成方法は、わずかに変更を加えて以前の研究で使用されました [31]。脳を迅速に解剖し、冷たいハンクス平衡塩類溶液 (HBSS) に浸しました。脳をハサミで切り刻み、氷冷HBSS中でダウンスホモジナイザーを使用して気泡を入れずに30回ホモジナイズした。次に、細胞懸濁液を予冷した 15 mL チューブに移し、予湿した (HBSS) 70 μm ナイロンメッシュを通して濾過しました。ミエリンと破片は、修正冷40% Percoll (Merck Millipore、17-0891-02) 勾配を使用し、加速も制動も行わずに500 × gで30分間遠心分離することにより除去しました。免疫細胞のペレットには、15 mL チューブの底にミクログリア、単球、好中球が含まれていました。サンプルは、FITC 結合抗 CD45 (0.25 mg/106 細胞; 11-0451-81、eBioscience)、PE-Cyn7 結合抗 CD11b (0.125 mg/106 細胞; 25-0112-81、eBioscience) で標識されました。、ＡＰＣ結合抗ＣＤ６２Ｌ（０．５ｍｇ／１０６細胞；５５３１５２、Ｂ＆Ｄ）、ＦＩＴＣ結合抗ＣＸＣＲ４（０．５ｍｇ／１０６細胞；５５１９６７、Ｂ＆Ｄ）、ＰＥ結合抗Ｌｙ６Ｇ（０．５ｍｇ／１０６細胞；５５１９６７、Ｂ＆Ｄ）。 E-AB-F1108D、Elabscience）、EF450 結合抗 Ly6C（0.5 mg/106 細胞; 48-5932-80、Invitrogen）、PE 結合抗 CD31（0.25 mg/106 細胞; B&D、553373、MEC 13.3） )、BB700 結合抗 VEGFR2/FLK-1 (0.25 mg/106 細胞; 742184、B&D) および FITC 結合抗 CXCL1 (0.6 mg/106 細胞; IC4532G、B&D) 抗体を 1:100 希釈で 30氷上で1分。実験サンプルはフローサイトメーター (Beckman CytoFLEX S、カリフォルニア州、米国) を使用して分析されました。

WT + PBS、WT + 血清、APP/PS1 + PBS、および APP/PS1 + 血清グループ (4 つの血清サンプルの n = 1 混合物) の血清のサイトカインプロファイルを、マウスサイトカイン抗体アレイ (CAT # QAM-CAA-4000; RayBiotech、ATL、米国）を使用し、実験プロトコルに従ってテストしました。変化倍数 (<0.67 および >1.5) およびシグナル強度 (>150) によるランキングを含む要因の組み合わせを使用して、ロバストな変化を特定し、タンパク質のメタランキングを生成しました。示されたサイトカインの相対シグナル強度とジーンオントロジー (GO) 機能強化データが傾向グラフで表示されます。 Quantibody® マウスサイトカイン抗体アレイ 4000 を使用したアッセイの詳細なプロトコルは、以前に記載されています [32]。

好中球除去手順は以前に記載されています[4、10]。最初の血清注射の 24 時間前に、3 日ごとに 0.3 mg の抗マウス Ly6G 抗体またはアイソタイプコントロール (InVivoPlus 抗マウス Ly6G、1A8; BE0075-1、Bioxcell、ニューハンプシャー州、米国) の腹腔内注射により好中球を枯渇させました。抗ly6G抗体と血清の注射は、行動検査まで4週間継続されました。末梢好中球レベルは非常に低いままであり、これは行動試験後の免疫蛍光アッセイによって確認されました。好中球処置は潜在的なリバウンド効果を排除するために継続的に行われた。

血清と海馬の両方における CXCL1、CCL3、CXCL16、CXCL9、HGF、FetuinA、EGF、FGF2、IL-22、TGFB1、および VEGF-A (Beijing 4A Biotech) の濃度を以前に記載されているように測定しました [29、30]。。血液サンプルを 4 °C で遠心分離し (4000 × g で 15 分間)、血清を別のチューブのセットに移しました。海馬をRIPA溶解バッファー（20 mM Tris-HCl（pH 8.0）、137 mM NaCl、1% NP40、10% グリセロール、1 mM PMSF、1 μL/mL アプロチニン、1 μg/mL ロイペプチン、および 0.5 mM ナトリウム）中でホモジナイズしました。バナジン酸塩）。

マウス脳微小血管内皮細胞 (MBEC、bEnd.3、Procell、CL-0598、武漢、中国) を製造業者の指示に従って培養しました。簡単に説明すると、MBEC を、コーティングされていない T75 フラスコ内の 10% ウシ胎児血清/ダルベッコ変法イーグル培地 (DMEM) および 1% ペニシリン - ストレプトマイシン (Life Technologies, Inc.) 中で 37 °C、5% CO2 で培養しました。培地全体の交換は一日おきに実施した。 MBEC は、37 °C で 1 分間、0.25% トリプシン処理を使用して継代されました。合計 10,000 細胞/cm2 を無血清培地で 24 時間培養し、血清 (20 μL)、抗 VEGF-A 抗体 (2 μg) および VEGF-A タンパク質 (20 ng/mL) で 24 時間処理しました。 h (CME0014、北京 4A バイオテック)。

bEnd.3 細胞におけるマウス Cdk5 遺伝子の CRISPR/Cas9 ノックアウトには、スモールガイド RNA (sgRNA) を使用しました。 sgCDK5#2: CCGGGAAACTCATGAGATTG。 sgRNA 配列は NCBI オンラインツール (https://www.ncbi.nlm.nih.gov) で検証されました。 sgRNA 配列は、以前に記載されているように、以前に構築されたベクター pSB-CRISPR にクローン化されました [33]。 pSB-CRISPR ベクターツールの効率は、特異的な抗 Cdk5 抗体を使用したウェスタンブロッティングによって確認されました。

1% ホスファターゼ阻害剤 (Sigma-Aldrich) および 1% プロテアーゼ阻害剤カクテル (Sigma-Aldrich) を含むタンパク質溶解バッファー (P0013C、Beyotime) を使用して、培養 bEnd.3 細胞および脳組織から総タンパク質を抽出し、12,000 × で遠心分離しました。 g (30 分、4 °C)。総タンパク質濃度はBCAタンパク質アッセイキット(Beyotime、P0012)を使用して測定し、3.5 mg/mLに調整しました。合計 30 μg のタンパク質を 4 ～ 10% SDS-PAGE で分離し、ポリフッ化ビニリデン (PVDF) 膜に転写しました。メンブレンを、5% ミルクを含む Tween-20 を含むトリス緩衝生理食塩水 (TBST) でブロックし、Ki67 (1:2,000、SolA15; eBioscience)、Cdk5 (1:2,000、DC 17; Santa Cruz) に対するモノクローナル抗体を使用して分析しました。 p-Cdk5 (1:2,000、C-7; Santa Cruz)、マウス抗グルタミン酸受容体 1 (1:2000; ab183797、Abcam)、マウス抗シナプトフィジン (1:2000; S5768、Sigma-Aldrich)、マウス抗-PSD95 (1:2000; ab13552、Abcam)、総タウ (D1M9X、1:2000、46687、Cell Signaling Technology)、リン酸化タウ Ser199/202 (1:2000、AB9674; Sigma-Aldrich)、およびウサギ抗β -アクチン (1:2,000、4970; Cell Signaling Technology)。ブロットは、Image Quant Las4000mini システムを使用してスキャンされました。 ImageJ ソフトウェア (NIH) をバンドの平均強度に使用しました。

APP/PS1 マウスには、わずかに変更を加えて以前に記載されたように 2 μg/kg/日の組換えマウス VEGF-A または生理食塩水を 3 日間腹腔内注射しました [34]。系統的組換え AAV-BR1-CMV-mCdk5-P2A-EGFP (BR1-mCdk5) または AAV-BR1-CMV-EGFP (BR1-CON) を、生後 30 週の APP/PS1 マウス (生後 7.5 ヶ月) に注射しました。尾静脈 (mCdk5; 1.0 × 1012 ゲノム粒子/マウス)。 AAV注射の2週間後に、血清注射などのさらなる治療を行った。 AAV は、以前の研究に従ってトリプルプラスミドトランスフェクションシステムによって生成されました [35]。簡単に言うと、1 つのプラスミドはキャプシド BR1 を含み、2 番目のプラスミドは ITR に隣接する Cdk5 遺伝子を含み、3 番目のプラスミドはヘルパー遺伝子を提供します。

海馬の一次内皮細胞は、以前に記載されているように単離されました[36]。簡単に説明すると、BR1-mCdk5またはBR1-CONで処理したAPP/PS1マウスの海馬を細かく刻み、400U/mLコラゲナーゼを含むPBS中の2%(vol/vol)FBSを用いて37℃で30分間消化した。酵素消化後、組織を 300 × g、4 °C で 5 分間遠心分離してペレット化し、上清を廃棄しました。細胞ペレットを DNase I (0.5 mg/mL) を含む 2% (vol/vol) FBS を含む PBS に再懸濁し、単細胞懸濁液を 22% Percoll の上に静かに加え、560 × g、4 °C で 1 分間遠心分離しました。チューブの底にある血管細胞を取得するのに 10 分。精製した細胞を、抗CD31-PE抗体（0.25 mg/106細胞; B&D）を使用してFACS Caliburフローサイトメーター（BD influxTM、ニュージャージー州、米国）で分析しました。

マウス海馬内皮細胞は上記のように単離されました[36]。海馬内皮細胞からの全 RNA は、RNAiso Plus (Sangon Biotech、上海、中国) を使用して単離されました。 cDNAは、GoScriptTM cDNA逆転写キット（Promega、米国ウィスコンシン州マディソン）を使用して合成しました。特定の mRNA の発現は、蛍光ベースのリアルタイム定量 PCR (RT-PCR) を使用してアッセイされました。 TransStart Tip Green qPCR SuperMix (TransGen Biotech、北京、中国) を使用して、各サンプルについて 3 回定量 PCR を実行しました。プライマー配列の詳細は以下のとおりです。

Cdk5 (順方向)、59-CAATGCAGAAATACGAGAAACTGG-39;

Cdk5 (逆)、59-CTTTGAGTAGACAGATCTCCCG-39;

Cxcl1 (フォワード)、59-ACCGAAGTCATAGCCACACTC-39;

Cxcl1 (逆方向)、59-CTCCGTTACTTGGGGACACC-39。

血液脳関門（BBB）の透過性は、以前に記載されているようにわずかに修正を加えたエバンスブルー染色を使用して評価されました[30]。簡単に説明すると、最後の VEGF-A 投与 1 日後に、エバンスブルー色素 (E2129; Sigma-Aldrich) の 0.9% 生理食塩水中 2% 溶液を 2 mL/kg の用量で尾静脈を介して APP/PS1 マウスに静脈内注射しました。注射。２時間後、すべてのマウスに麻酔をかけ、冷０．９％生理食塩水を経心臓的に灌流した。エバンスブルー漏出を検出するために、脳組織サンプルを 99% ジメチルホルムアミド中でホモジナイズし、50 °C のウォーターバスで 48 時間インキュベートしました。 12,000 × g (30 分間、4 °C) で遠心分離した後、上清を収集し、マイクロプレートリーダーを使用してサンプルの吸光度を 620 nm で測定しました。

海馬の冠状脳スライス (厚さ 300 μm) を、生後 5 ～ 6 か月の雄 APP/PS1 マウスとその WT 同腹仔から、ビブラトーム (Leica VT1000) を使用して、110 (mM) を含む事前に冷却した溶液中で調製しました。塩化コリン、7 MgCl2・6H2O、2.5 KCl、0.5 CaCl2・H2O、1.3 NaH2PO4、25 NaHCO3、20 グルコース、95% O2 および 5% CO2 で飽和。スライスをすぐに人工脳脊髄液 (ACSF) に 35 °C で 30 分間移し、その後記録チャンバーに移しました。 125 NaCl、2.5 KCl、2 CaCl2・H2O、1.3 MgCl2・6H2O、1.3 NaH2PO4、25 NaHCO3、および 10 グルコースを含む ACSF の記録 (mM)。すべての ACSF 溶液は、安定した pH 緩衝 (pH 7.3) と適切な酸素添加を確保するために、使用前にカルボゲン (95% O2/5% CO2) で飽和させる必要があります。歯状回 (DG) 錐体ニューロンの細胞体からの全細胞パッチクランプ記録は、赤外 (IR) 微分干渉コントラスト (DIC) 顕微鏡 (ECLIPSE FN1、Nikon) の下で得られました。 mEPSC を記録するために、保持電位を -70 mV に保持し、GABAA 受容体と活動電位をそれぞれ 20 μM ビククリンメチオジド (BMI) と 1 μM テトロドトキシン (TTX) でブロックしました。ガラスピペットに、(mM) 100 CsMeSO4、25.5 CsCl、10 HEPES、8 NaCl、0.25 EGTA、10 グルコース、4 MgATP および 0.3 Na3GTP (pH 7.3、285 mOsm) を含む内部溶液を充填しました。データを10 kHzでデジタル化し、1 kHzでフィルタリングし、multiClamp 700B増幅器およびpClamp11.2ソフトウェア(Molecular Devices)を備えたDigidata 1500Bを使用して記録した。直列抵抗が初期値の 20% 以内で変動したときにデータを収集し、Mini Analysis Program (Synaptosoft) および pClamp 11.2 ソフトウェア (Molecular Devices) を使用して分析しました。電気生理学の方法は、以前に報告された研究に従って実行されました[37、38]。

ワイドタイプの APP/PS1 マウスおよび血清を注射した APP/PS1 マウスからの全血サンプル合計 100 μL を心臓穿刺によりヘパリンコートチューブに採取しました。すべての末梢血サンプルを自動血液分析装置 (Sysmex、XT-2000i、シスメックス株式会社、日本) で分析しました。以下の血液パラメータが分析されました:白血球数 (WBC)、赤血球数 (RBC)、好中球 (Neu)、リンパ球 (Lym)、単球 (Mon)、好酸球 (Eos)、好塩基球 (Bas)、ヘモグロビン ( HGB）、ヘマトクリット（HCT）、平均赤血球体積（MCV）、平均赤血球ヘモグロビン（MCH）、平均赤血球ヘモグロビン濃度（MCHC）、血小板数（PLT）、平均血小板体積（MPV）、血小板分布幅（PDW）。

すべての結果は少なくとも 3 回の独立した実験を表し、平均値 ± SEM として表されます。統計分析のために、対応のない両側スチューデント t 検定 (2 つのグループ間)、または一元配置または二元配置 ANOVA (ボンフェローニまたは LSD 比較検定)、またはコルモゴロフ – スミルノフ検定を実行しました。 MWM テスト結果では、二元配置反復 ANOVA が実行されました。血液学的プロファイル分析には、一元配置 ANOVA (分散の等均一性) または Dunnett T3 (分散の不等均一性) を使用しました。データ分布は正常であると仮定されました。これは QQ プロットまたはヒストグラムでもテストされました。分析とグラフ作成は、GraphPad Prism バージョン 8.0 (GraphPad 8.0) を使用して実行されました。 P < 0.05 は統計的に有意であるとみなされました。

自然免疫はアルツハイマー病の病態に関連している[39、40、41]。 APP / PS1 マウスの野生型血清処理に対する自然免疫細胞の応答を調査するために、フローサイトメトリーを使用して、末梢血単核細胞（PBMC、図1A、B;補足）のCD45 +およびCD45 + / CD11b +免疫細胞サブセットの活性を分析しました。図 1A、B) および脳細胞懸濁液 (図 1G、H)。興味深いことに、血清処理後、末梢血 (図 1C、D、F) と脳 (図 1I、図 1I、 J、L) 疾患モデルにおける。注目すべきことに、血清注射によりCD11b+ / Ly6Chi / Ly6Glo単球の細胞数が有意に増加しました（図1C、E）。これはCD11b+ / CD45hiに反映された結果と一致しています（補足図1B、C）。予期せぬことに、血清処理したAPP / PS1マウス脳におけるCD11b + / Ly6Chi / Ly6Glo単球（図1I、K）とCD11b + / CD45hi単球（補足図1E、F）の数の間に一貫性のない結果が観察されました。好中球が好中球細胞外トラップ（NET）を生成する可能性があることを考慮して、抗好中球エラスターゼ（NE）または抗ミエロペルオキシダーゼ（MPO）免疫蛍光染色によってADマウスの脳内のNETの存在を分析しました。実際、実質ではNETを伴う好中球が観察され、主に脳室、脈絡叢、軟髄膜、Aβプラーク、皮質血管の周囲に局在しています（図2A〜D）。一貫して、Ly6G抗体治療は、ADマウスの海馬、心室腔および軟髄膜に隣接するNE+またはMPO+好中球を消失させた(図2E、F)。次に、フローサイトメトリー分析により、AD マウスモデルにおける浸潤好中球の表現型を調査しました。有害な過剰反応性 Ly6G+/CXCR4hi/CD62Llo 老化好中球サブセットの数は、WT コントロールと比較して APP/PS1 マウスの脳で有意に増加していましたが、これらの影響は血清または Ly6G 中和抗体処理によって防止されました (図 2G、H)。まとめると、これらの結果は、AD マウスへの血清注射が末梢好中球の数を減少させ、脳への過剰反応性好中球サブセットの移動を防止したことを示唆しています。

PBMC (A、B) および脳 (G、H) における免疫細胞 (P1)、単細胞 (P2)、CD45+ 白血球 (P3)、および CD45hi/CD11b+ 単球 (P4) のフローサイトメトリーソーティングゲート戦略。 AB および GH の赤い矢印は、P1 に基づく P2 サブセット、P2 に基づく P3 サブセット、および P3 に基づく P4 サブセットを表します。 C 単球は、Ly6C と Ly6G の発現に基づいて明確に異なる集団を持っています。 D–F PBS および血清の PBMC における CD45+ 白血球 (P3)、Ly6Chi/Ly6Glo 単球 (C の青いゲートで示される)、および Ly6Ghi/Ly6Clo 好中球 (C の赤いゲートで示される) 頻度のフローサイトメトリー分析-処理したAPP/PS1マウス。 I 単球は、Ly6C 発現に基づいて明確に異なる集団を持っています。 J-L PBS の脳における CD45+ 白血球 (P3)、Ly6Chi/Ly6Glo 単球 (I の青いゲートで示される)、および Ly6Clo/Ly6Ghi 好中球 (I の赤いゲートで示される) の頻度のフローサイトメトリー分析-および血清処理した8〜9か月齢のAPP/PS1マウス（データは平均値±semとして表示;対応のないスチューデントの両側t検定、*p < 0.05; **p < 0.01; ***p < 0.001 ; n = 1 グループあたり 5 ～ 6）。

3V (A)、海馬領域周囲 (B の左パネル)、および脈絡叢 (B の右パネル) の NE+ 白血球 (赤血球) の代表的な共焦点画像。生後8〜9か月のAPP/PS1マウスの、Aβプラーク（緑色染色）が沈着している髄膜および実質（C）および脳血管周囲（Dの右パネル）におけるMPO+白血球（赤血球）。脳血管は、Zen ソフトウェアを使用した Hoechst 染色 3D に基づいて特定されました。抗Ly6G抗体またはアイソタイプ対照抗体で処置したAPP/PS1マウスの海馬、3V、血管および軟膜におけるNE+ (E) およびMPO+ (F) 細胞の数の定量化（データは平均値±標準誤差として表示） ; 対応のないスチューデントの両側 t 検定、n = 5 ～ 6; **p < 0.01; ***p < 0.001)。 G、H 血清または抗Ly6G抗体で処理したAPP / PS1マウスおよびWTコントロールにおけるCXCR4hi / CD62Llo染色に反映される、脳に浸潤する過剰反応性好中球のフローサイトメトリー分析（n = 4〜5）。一元配置分散分析とそれに続くボンフェローニ多重比較検定。 ***p < 0.001。股関節海馬、3V 第三脳室、DG 歯状回、CP 脈絡叢、スケールバー: A および B で 20 μm。 C、Dは50μm。

循環する免疫微小環境は、AD における脳の恒常性において重要な役割を果たしています [40、41、42]。我々は、血清注射によりAPP/PS1トランスジェニックマウスの末梢および大脳好中球の数が減少することを示した。しかし、末梢好中球の減少がADマウスの実質への浸潤をどのように弱めるのかはまだ不明である。したがって、我々はまず、マウスサイトカインアレイを使用して、WT + PBS、WT + Serum、APP/PS1 + PBS、およびAPP/PS1 + Serum マウスの血清のサイトカインプロファイルを分析しました。差次的発現タンパク質（DEP）に基づく教師なし階層クラスタリングは、血清によって誘導される別個のタンパク質発現ネットワークを示しました（図3A、B）。上位 82 位のタンパク質を補足表 1 に示します。ジーンオントロジー (GO) 分析により、主に好中球遊走、白血球遊走、および走化性に関与するタンパク質が大幅に濃縮されていることが示されました (図 3C、D)。上位82位にランクされたタンパク質（下方制御されたタンパク質23個と上方制御されたタンパク質59個）を使用した遺伝子とゲノムの京都百科事典（KEGG）分析により、サイトカイン-サイトカイン受容体相互作用とケモカインシグナル伝達経路のネットワークが明らかになりました（補足図2A、B）。

マウスサイトカイン抗体アレイ分析は、PBS または血清で処理した APP/PS1 マウス（8 ～ 9 か月齢）および PBS または血清で処理した同年齢の WT マウスの血清で実行されました。 A、B WT + PBS マウスと APP/PS1 + PBS マウスの間、および APP/PS1 + PBS と APP/PS1 + 血清マウスの間で、下方制御された (青) サイトカイン発現と制御されていない (赤) サイトカイン発現が血清中に検出されました。 APP/PS1+血清対APP/PS1+PBSグループにおける23個の下方制御されたサイトカイン(C)および59個の上方制御されたサイトカイン(D)の遺伝子オントロジー濃縮分析(生物学的プロセス)。 E 4 つのグループの血清中の重複するサイトカインを示すベン図。青は、APP/PS1 + PBS 対 WT + PBS グループを表します。赤は、APP/PS1 + 血清対 WT + PBS グループを表します。緑色は、APP/PS1 + 血清対 APP/PS1 + PBS グループを表します。 F WT + PBS、WT + 血清、APP/PS1 + PBS、および APP/PS1 + 血清マウスの血清間で重複する 36 個のサイトカインを示す教師なしクラスター化遺伝子発現ヒートマップ分析。

さらに、WT + PBS、WT + 血清、APP / PS1 + PBS、およびAPP / PS1 + 血清マウスの血清中の36 DEP（補足表2）が、ベン図（図3E）およびヒートマップ（図3E）によって特定されました。 3F）。ケモカイン、成長因子、およびサイトカインは、CXCL1、CCL3、CXCL16、CXCL9、HGF、FetuinA、EGF、FGF2、IL-22、および TGFB1 を含む 36 の DEP から同定されました。これらの因子は、好中球/白血球の遊走と走化性が著しく豊富です。さらに、ELISA キットを使用して、WT + PBS、APP/PS1 + PBS、APP/PS1 + 血清マウスの血清と脳で結果を確認しました（図 4A ～ J）。

私たちのデータは、血清中のCXCL1 (A)、CCL3 (B)、CXCL16 (C)、およびFetuinA (F)のレベルが大幅に増加し、CXCL9、HGF、IL-22、およびTGFB1のレベルが大幅に低下したことを示しました。 APP/PS1 マウス (8 ～ 9 か月齢) と、年齢を一致させた WT マウス (D、E、I、および J) のマウスの比較。しかし、これらの増加した変化は、血清処理後に WT + PBS マウスで検出されるレベルに回復しました。 WT + PBS、APP/PS1 + PBS、および APP/PS1 + 血清マウス (G、H) の血清では、EGF および FGF2 のレベルに明らかな差異は認められませんでした。 K 上位 82 位のタンパク質を使用したオンラインツール STRING に基づくタンパク質間相互作用 (PPI) ネットワークは、走化性サイトカインおよび血管新生因子シグナル伝達 (CXCL1 および VEGF-A) 周りに最も強力なネットワークを生成しました。平均濃度は血清の pg/mL で表されます。一元配置分散分析とそれに続くボンフェローニ多重比較検定。データは平均値±標準誤差として表示されます。 ns は重要ではありません。グループごとに n = 6。 *p < 0.05; **p < 0.01; ***p < 0.001。

サイトカイン抗体アレイ試験の結果と一致して、好中球遊走に関連するCXCL1、CCL3、およびCXCL16ケモカインのレベルは、APP/PS1 + PBSマウスの脳で有意に増加した。 4〜6週齢の野生型血清処理後、これら3つのケモカインの発現増加は末梢と脳の両方で正常化し、同年齢（9か月齢）のWTマウスのレベルに達しました（図4A〜）。 C;補足図3A–C）。注目すべきことに、トップランクのタンパク質を使用した創意工夫経路分析（IPA）は、CXCL1およびVEGF-Aシグナル伝達の周囲に最も強力なネットワークを生成しました（図4K）。さらに、血清の有無にかかわらずワイドタイプマウス、APP/PS1 マウスで血液分析装置を使用して検査を実施しました。フローサイトメトリー試験のデータ（図1E;図S1C）と一致して、血液学的データは、血清注射により好中球数が大幅に減少し、単球数が増加したことを示しました（補足表3）。これらの結果は、血清由来の全身循環ケモカインが、AD マウスモデルにおける脳への炎症誘発性好中球浸潤を調節する可能性があることを示しています。

次に、APP/PS1 マウスにおける好中球の接着/浸潤の根底にある分子機構を調査しました。我々は、虚血性脳卒中[43]、多発性硬化症[44]、神経炎症の複数のマウスモデル[45、46、47]における好中球誘引ケモカインであるサイトカインCXCL1に焦点を当てた。内皮特異的 Cdk5 ノックアウトは CXCL1 発現を増加させ、てんかんにおける進行性星状膠症を引き起こしました [48]。以前の研究と一致して、Aβまたは血清処理後のbEnd.3細胞のCXCL1レベルとCdk5 / pCdk5レベルの間に負の関係があることがわかりました（図5A;補足図4A、B）。共局在分析により、Cdk5、pCdk5、およびCXCL1タンパク質が脳微小血管内皮細胞の細胞質に存在することが確認されました（補足図4C、D）。ただし、Cdk5およびpCdk5の分布は、細胞質内のCXCL1の分布とは明らかに異なりました（補足図4E、F）。

bEnd.3 細胞 (CD31+) における CDK、pCDK、および CXCL1 発現の代表的な画像。スケールバー: 10 μm。 B bEnd.3 細胞の細胞増殖マーカー Ki67、リン酸化 Cdk5、および Cdk5 のウェスタンブロッティング (WB) 細胞を Aβ (2 μM)、血清 (20 μL)、抗 VEGF-A 抗体 (2 μg)、および組換え VEGF-A タンパク質 (20 ng/mL)。 C ウェスタンブロット分析を使用した Ki67、pCdk5、および Cdk5 タンパク質のバンドの定量化。グループあたり n = 5。 D 上清中の C に関連する CXCL1 レベルの ELISA 分析。グループあたり n = 6。 E Cdk5 阻害剤ロスコビチン (20 μM) は、bEnd.3 細胞における VEGF-A 誘導性の Cdk5 リン酸化を阻害します。グループあたり n = 3 ～ 4。 F VEGF-A刺激の有無にかかわらず、bEnd.3細胞におけるCXCL1発現に対するsgRNAを使用したCDK5ノックアウトの効果。グループあたり n = 6。 G、H WT、APP/PS1 マウス、抗 Ly6G 抗体または VEGF-A 組換えタンパク質で処理した APP/PS1 マウスにおける脳血管新生 (レクチン +) の代表的な画像と定量化。 1グループあたりn = 8匹のマウス、1匹あたり5つの脳スライスからの12の画像フィールドを分析し、値として平均した。スケールバー: G. I-J で 50 μm。APP/PS1 マウスの皮質毛細血管における抗 MPO 抗体によって染色された好中球接着の代表的な画像と定量化 (白色の双線形; Z-Stack ツールに基づいて識別された血管)。一元配置分散分析とそれに続くボンフェローニ多重比較検定。 ns は重要ではありません。 1グループあたりn = 6匹のマウス、動物あたり4つの脳スライスからの10の画像フィールドを分析し、値として平均した。 *p < 0.05; **p < 0.01; すべての ***p < 0.001。スケールバー: I で 20 μm。同等の結果をもたらした 3 つの別々の in vitro 実験がデータによって示されています。

さらに、VEGF-Aは血清処理後のIPAによる別の重要な分子であることがわかり（図4K）、血清曝露によりAPP / PS1マウスの循環VEGF-Aレベルが増加しました（補足図5）。さらに、VEGF-A シグナル伝達は老化の進行において脳機能を調節します [22]。 Cdk5 の阻害またはサイレンシングは、アクチン細胞骨格に干渉することにより内皮細胞の遊走と血管新生を減少させます [49、50]。一貫して、我々のデータは、インビトロでのAβ処理後の内皮細胞増殖の減少がCdk5の低発現と並行していることを示し(図5B、C)、これはCdk5と血管新生との間の潜在的な関連性を示唆している。したがって、我々は、VEGF-AがCdk5シグナル伝達を介してCXCL1発現に影響を与える可能性があると仮説を立てます。まず、VEGF-A 抗体処理後の bEnd.3 細胞における Cdk5 発現およびリン酸化の Aβ 誘発性減少を血清が防止できないことがわかりました (図 5B、C)。血清の有益な効果と同様に、VEGF-A も Aβ によって誘導される CXCL1 発現の増加を有意に防止しました (図 5D)。 VEGF-Aが低CXCL1発現をどのように媒介するかをさらに研究するために、Cdk5の阻害剤であるロスコビチンを使用してCdk5活性を調べた（図5E）。ロスコビチンがCXCL1発現に対するVEGF-Aの阻害効果を弱めることがわかりました（補足図6A〜G）。これらの結果と一致して、CRISPR-Cas9遺伝子編集によるbEnd.3細胞の内皮Cdk5遺伝子のノックアウトもVEGF-A媒介CXCL1抑制を妨げ、代わりに上清中のCXCL1レベルの3倍の増加を誘導した（図5F）。

脳毛細血管における好中球の付着は皮質血流を減少させ、その結果血管異常が生じ、アルツハイマー病の複数のマウスモデルにおいて脳病理を悪化させる[10、11]。我々は、APP/PS1 マウスにおいて血清が血管新生を促進し、毛細血管セグメントを減少させることを観察しました (図 5G、H)。皮質毛細血管における好中球接着の役割を調査するために、APP/PS1 マウスの末梢好中球を枯渇させるために Ly6G 中和抗体を投与しました。我々の結果は、Ly6G 抗体が毛細血管の数を増やすことによって血清の有益な効果を模倣することを示しました (図 5G、H)。実際、Ly6G抗体処理により、皮質毛細血管に隣接するMPO+好中球の数が約90%減少した(図5I、J;図2D、F)。これらのデータは、血清が好中球の接着/浸潤を防ぐことで脳毛細血管密度を増加させる可能性があることを示唆しています。

次に、血清由来 VEGF-A が in vivo での好中球接着と脳毛細管喪失の遮断に必要であるという仮説を検証しました。したがって、組換えVEGF-Aタンパク質をAPP / PS1マウスに適用したところ、VEGF-AがCdk5およびpCdk5の活性を促進し（補足図7A〜F、I〜N）、脳血管新生を増加させ、小さな毛細血管セグメントを減少させることができることがわかりました（図7A〜F、I〜N）。図５Ｇ、Ｈ）、その後、ＡＰＰ／ＰＳ１マウスにおける好中球接着が減少した（図５Ｉ、Ｊ）。同様に、Ly6G中和抗体は、毛細血管の数および皮質毛細血管に隣接する好中球の接着に関して、血清およびVEGF-Aタンパク質と同様の利点を示した(図5I、J)。注目すべきことに、PBS処理APP / PS1マウスと比較して、VEGF-A処理APP / PS1マウスの脳のBBB透過性と完全性のさらなる悪化は観察されませんでした（補足図8A〜C）。まとめると、これらの結果は、血清由来 VEGF-A が Cdk5 活性を介して CXCL1 発現を抑制し、その結果 AD マウス脳への好中球動員が阻害されることを示しています。

次に、認知障害における脳内の遊走性好中球の役割を決定するために、文脈的恐怖条件付けとモリス水迷路テストを使用して空間学習と記憶のパフォーマンスを評価しました。恐怖条件付けトレーニング中、すべてのグループは同等のベースラインすくみ時間を示しました（補足図9A）。ただし、好中球枯渇後のAPP / PS1マウスの恐怖記憶テストでは、すくみ行動が文脈（補足図9B）では大幅に増加しましたが、手がかり（補足図9C）では増加しなかったことを発見しました。成績は、WT マウスおよび血清処理 APP/PS1 マウスの成績と同様でした (補足図 9B)。 MWMテストでは、APP / PS1マウスにLy6G抗体を投与すると、獲得段階中の隠れたプラットフォームの位置のパフォーマンスも向上しました（補足図9D）。空間プローブ段階では、好中球が枯渇したAPP / PS1マウスは、ターゲット象限内でより多くの時間を費やし、より長い距離を移動しました（補足図9E、F;象限内の時間と距離はそれぞれ46.7％と53.4％増加）。 APP / PS1 マウスよりもプラットフォームを通過する回数が有意に多かった（補足図9G; 2倍増加）。さらに、すべてのグループの水泳速度に明らかな違いは観察されませんでした（補足図9H）。末梢血、脳および髄膜における欠失効率は、フローサイトメトリー分析および免疫蛍光染色によって確認されました（図2A〜F、補足図10A〜F、補足図11A〜E）。ただし、Ly6G 抗体の投与は、OFT の探索能力と移動速度に反映されるように、CD3+ T リンパ球の割合 (補足図 11F-I)、または APP/PS1 マウスの健康状態には影響を与えませんでした (補足図 11F-I)。 .11J–L）。これらの結果は、Ly6G 抗体による治療が APP/PS1 マウスの記憶行動に有益な効果をもたらすことを示しています。

APP/PS1 脳における好中球浸潤と記憶障害における Cdk5 シグナル伝達の役割をさらに決定するために、AAV2-BR1-CMV-mCdk5-P2A-EGFP (BR1-mCdk5) を使用して脳内皮 Cdk5 過剰発現を誘導し、行動解析を実施しました。実験スキームに従ってテストします (図 6A ～ D)。 RT-PCRにより、AAV送達後の脳内皮細胞においてCdk5 mRNAが増加したことが確認された(図6E、F)。免疫蛍光染色を使用すると、Cdk5タンパク質レベルの同様の増加が海馬で観察されました（補足図12A、B）。

実験の詳細のスキーム。系統的な AAV-mCdk5 発現は、30 週齢 (約 7.5 か月) の APP/PS1 マウスで測定されました。２週間後（生後８ヶ月）、ＡＡＶ処理した雄のＡＰＰ／ＰＳ１トランスジェニックマウスに、生後４週間のＣ５７ＢＬ／６マウスからの血清２００μＬを３日ごとに９回静脈内注射した。最後の血清注射後に、恐怖条件付けテスト (FCT) および MWM テストを含む行動分析を実行しました。両端の逆方向末端反復 (ITR) と、EGFP を備えた CMV プロモーター駆動の mCdk5 (BR1-mCdk5) または CMV プロモーター駆動の EGFP (BR1-CON) を示す AAV2-BR1 コンストラクトの概略図。 B–D 恐怖条件付け手順の概略図。 B トレーニング日 (状況 I); C コンテキストテスト日 (コンテキスト I)。 D 試験日の案内（コンテキスト II）。 E、F 海馬由来の初代内皮細胞における Cdk5 および CXCL1 の相対 mRNA レベルを、BR1-mCdk5 および BR1-CON を注射した 32 週齢の APP/PS1 マウスで評価しました (グループあたり n = 4)。 BR1-mCdk5 または BR1-CON を尾静脈から注射した APP/PS1 マウスの側脳室の脳微小血管 (緑、G) および好中球 (赤、H) における CXCL1 発現の代表的な共焦点画像。スケールバー: G で 10 μm。 BR1-Cdk5 または BR1-CON を注射した APP/PS1 マウスの脳における好中球 (Ly6Ghi/Ly6Clo) の代表的なフローサイトメトリー分析と定量化 (1 グループあたり n = 4 ～ 5 匹のマウス)。 K MWM タスクのプローブ段階における脱出軌道の代表的なヒートマップ。 L BR1-mCdk5 または BR1-CON を注射した APP/PS1 マウス (8 ヶ月齢) および年齢を一致させた WT マウスを MWM タスクで評価しました。 M、N グループ内のターゲット象限 (TQ) で費やされる頻度と時間。 O 文脈凍結テスト。行動試験では、グループあたり n = 7 または 10 匹のマウス。すべてのデータは平均値±標準誤差として示されています。二元配置反復分散分析、ボンフェローニ多重比較検定。 *p < 0.05; **p < 0.01; ***p < 0.001。

インビトロの結果と一致して、免疫蛍光染色によって示されるように、脳血管におけるCXCL1発現は、APP/PS1マウスにおけるCdk5過剰発現後に減少した(図6G)。さらに、内皮 Cdk5 の過剰発現により、脳への遊走性好中球が減少し (図 6H-J)、脱出潜時が短縮され (図 6L)、プラットフォームを通過する頻度が増加しました (図 6K、M)。そして、MWMテストにおけるターゲット象限の持続時間（図6N）、および手がかりではない文脈記憶テストにおけるフリーズ時間の増加（図6O）。したがって、これらの結果はインビトロデータとほぼ一致しており、Cdk5の過剰発現が脳内皮細胞におけるCXCL1分泌を減少させることを実証している。

まとめると、我々の結果は、Cdk5シグナル伝達の強化が好中球浸潤を阻害し、記憶障害を救済することを裏付けており、これはADマウスモデルにおける血清治療の有益な効果を示唆している。

シナプス喪失は通常、AD 患者 [51] および疾患のマウスモデル [52] で早期に検出されます。したがって、我々は次に、シナプス前マーカーのシナプトフィジンおよびAMPA受容体GluA1に対する血清の影響を調べた。以前の研究[53、54]と一致して、生後8〜9か月のAPP/PS1雄マウスモデルでは、観察と比較して、海馬のDGおよびCA3におけるシナプトフィジンおよびGluA1発現の有意な減少が示されたが、CA1では示されなかった。年齢が一致したWTコントロールでは（図7A〜E;シナプトフィジンについては、DGおよびCA3がそれぞれ32.6％および47.8％減少しました。GluA1については、CA3が42.5％減少しました）。ウイルス誘発性のCdk5過剰発現の後、APP / PS1マウスでシナプスタンパク質の減少が大幅に回復したことがわかりました（図7E、F）。これは、血清とLy6G抗体で処理されたAPP / PS1マウスの結果と一致しています（補足）図 13A ～ H)。さらに、ウエスタンブロット分析では、皮質におけるGluA1、シナプトフィジンまたはPSD95発現の差異は、異なるグループで観察されなかった（補足図13I、J）。

WT マウス、AAV-Cdk5 で処理した APP/PS1 マウス、およびコントロールの海馬の CA1、CA3、および DG におけるシナプトフィジンと GluA1 の代表的な共焦点画像 (A ～ D) および定量化 (E)。 IR: 免疫反応性。スケールバー、100μm。 F 海馬における GluA1、PSD95、およびシナプトフィジンを含むシナプスタンパク質のウェスタンブロット分析。データは平均値±標準誤差として表されます。一元配置分散分析および LSD 多重比較テスト、グループあたり n = 4 匹のマウス (動物あたり 5 つの脳スライスからの 10 以上の画像フィールドを分析し、値として平均した)。 *p < 0.05; **p < 0.01、ns は有意ではありません。 G H-K での実験の概略図。 H GluA1+ 涙点を飲み込むミクログリア突起 (Cx3cr1-GFP) の共焦点画像と 3D 再構成。ミクログリアによって飲み込まれた涙点の割合を評価しました。データは平均値±標準誤差として表されます。一元配置分散分析および LSD 多重比較テスト、グループあたり n = 5 匹のマウス (動物あたり 5 つの脳スライスからの 34 個以上のミクログリアを分析し、値として平均した)。 *p < 0.05; **p < 0.01。 I ミクログリア内部に分布する飲み込まれた涙点、ミクログリア表面からの距離は 0 μm 未満です。ミクログリアの外側に分布する涙点に接触していますが、その距離はミクログリア表面から0.25μm未満です。紫色の点は I (下) に示されています。 J WT マウスのミクログリア突起と GluA1+ 涙点、APP/PS1 マウスの Aβ プラーク (青色)、および接触した GluA1 涙点 (0.25 μm 未満) の 3D 再構成を分析しました (7 匹のマウスからの n = 25 ～ 44 細胞) 。 3D 再構成ミクログリアの K Sholl 解析 (1 グループあたり 3 匹のマウスからの n = 14 ～ 21 細胞)。 *p < 0.05; **p < 0.01。スケールバー: H、I で 1 μm。 J で 5 μm、K で 10 μm。L ワイドタイプマウス、APP/PS1 マウス、および AAV-Cdk5 で処理した APP/PS1 マウスからの DG 錐体ニューロンにおける mEPSC の代表的な痕跡、スケールバー: 1 秒、20 pA。 M mEPSC の平均頻度。 N mEPSC の平均振幅。コルモゴロフ・スミルノフ検定。 *p < 0.05; ***p < 0.001; M および N では、1 グループあたり 3 匹のマウスからの n = 19 または 20 細胞。

ミクログリアは補体依存的にシナプス刈り込みを促進します[52]。 AD マウスで観察されるシナプスの喪失は、ミクログリアの貪食作用の増加によるものである可能性があります [27、52]。本研究では、ミクログリアがニューロンシナプスと直接相互作用するかどうかをテストするために、APP / PS1マウスの海馬の3D再構成画像を使用して、蛍光レポーターを発現するミクログリアとシナプス涙点（GluA1 +）の関連を調査しました（図7G）。我々は、GluA1+ シナプスを 2 つのサブセットに分類しました。飲み込まれた点（ミクログリア表面から 0 μm 未満の距離でミクログリア内に分布、図 7H の黄色の点、図 7I の薄紫の点）と接触点（ミクログリアの外側に分布し、ミクログリア表面からの距離が 0 μm 未満）ミクログリア表面からの距離は 0.25 μm 未満、図 7I、下の紫色の点）。我々のデータにより、Cx3cr1GFPミクログリアに飲み込まれるか接触するGluA1+シナプススポットの大幅な減少が、Cdk5過剰発現APP/PS1マウスでは回復されることが明らかになった（図7H-J）。 Sholl分析は、APP/PS1マウスにおけるミクログリア分岐の複雑性の低下が、脳内皮細胞におけるCdk5の過剰発現によって正常化されることを示した(図7K)。

APP/PS1 マウスのシナプス機能障害が AAV-Cdk5 治療後に回復したかどうかをさらに調べるために、DG の錐体ニューロンのシナプス特性を調べました。錐体ニューロンからの全細胞記録は、APP/PS1 マウスでは自発的 mEPSC の頻度は劇的に減少したが、振幅は減少しなかったが、これらの効果は Cdk5 過剰発現後にワイドタイプのレベルに回復したことを示した（図 7L-N）。 GluA1+ シナプスのデータと併せて、これらのデータは、Cdk5 の過剰発現により、APP/PS1 マウスの DG 錐体ニューロンにおけるシナプス入力の減少が回復することを示しました。

予想通り、アイソタイプ IgG 抗体を投与された APP/PS1 マウスのミクログリアはアメーバ様形態を示し、高レベルの CD68 を発現し、より小さな体積を示しました（補足図 14A ～ C）。注目すべきことに、Cdk5の過剰発現、血清およびLy6G抗体処理は、ミクログリア（Iba-1 + / CD68 +）の過剰な活性化を大幅に軽減するだけでなく、ミクログリアのプロセスの長さと体積を恒常性型に部分的にシフトさせました（補足図14A〜F）。。血清は脳内のAβ分布（補足図15A〜D）もRIPAおよびSDS可溶性Aβ40およびAβ42（補足図15E〜L）も変化させず、ミクログリアに対するこれらの影響がAβ斑とは無関係であることを示唆しています。さらに、血清処理後の脳内のリンタウおよび総タウのレベルを特定しましたが、これはAPP / PS1脳の海馬と皮質の両方の総タウおよびリンタウのレベルには影響を与えませんでした（補足図16A）。 –D）。さらに、140 kDa のタウ多量体 (高分子量バンド) も血清注入後に測定されました。同様に、高分子量タウレベルは、対照と比較して変化しませんでした（補足図16A〜D）。まとめると、我々の結果は、血清による好中球浸潤の阻害が、APP/PS1 脳の海馬におけるシナプス喪失と神経炎症を部分的に緩和することにより、認知障害を改善することを明らかにした。

末梢好中球や中枢ミクログリアを含む自然免疫系は、神経変性疾患において重要な役割を果たしています[4、6、39、55]。好中球は初期自然免疫の重要なエフェクター細胞であり、脳 [10、56] および末梢 [6] の炎症に寄与します。この研究では、血清注射により過剰反応性好中球の脳への動員が阻害され、好中球血管外トラップ（NET）が減少し、それによってADマウスの記憶障害が改善されることが判明した。機構的に、我々の研究は、アルツハイマー病脳におけるCXCL1分泌の減少において内皮Cdk5活性を媒介する血清因子VEGF-Aに関連する好中球浸潤の根底にある輸送機構を解明した。我々はさらに、血清および内皮Cdk5過剰発現によるアルツハイマー病脳への好中球浸潤の阻害が、ミクログリアによるシナプス刈り込みの減少と海馬におけるシナプス活性の上昇により、少なくとも部分的に記憶障害を改善することを明らかにした。

以前の研究では、好中球特異的マーカーである Ly6G シグナル伝達を遮断すると、血管および神経の炎症部位への好中球の遊走が減少することが示されています [57]。その結果、血清注射により、特に脳血管およびAβプラーク付近の好中球付着が劇的に減少し、ADマウスの記憶障害が改善されることが実証されました。さらに、血清注射後、脳毛細血管セグメントが回復し、好中球浸潤がブロックされ、脳血流と灌流が増加し[10]、認知能力が向上しました。 DEP に基づく PPI 分析では、血清由来のサイトカイン VEGF-A および CXCL1 媒介性の走化性も示されました。一貫して、組換えVEGF-Aは、AD脳への好中球浸潤の阻止においてLy6G抗体と同様の効果を示した。したがって、我々は、野生型由来血清中のVEGF-AがADマウスの記憶障害を改善したが、これはおそらく好中球浸潤の減少の結果であると結論付けた。

VEGFシグナル伝達は加齢に伴い脳内で著しく減少するが、VEGFシグナル伝達の増加は加齢に伴う毛細血管喪失、灌流障害、組織酸素化の低下から保護され[22]、これらはアルツハイマー病患者でも観察される[58、59、60]。さらに、CSF中のVEGFは、特にアミロイド陽性およびタウ陽性の個人における縦方向の記憶能力と関連しており[61]、VEGF関連変異体はアルツハイマー病のリスクに影響を与えている可能性がある[62]。したがって、これらの報告は、VEGF シグナル伝達が AD の発症に関与していることを示唆しています。以前の研究では、ラット下垂体細胞におけるCdk5活性の阻害によりVEGF-A発現が減少することが示され[63、64]、内皮におけるVEGF-AとCdk5の間に根底にある関連性が存在することを示唆している。興味深いことに、本研究では、組換え VEGF-A が、bEnd.3 細胞における Aβ 媒介 Cdk5 阻害を直接防止し、内皮細胞増殖を促進し、AD マウスモデルにおける脳毛細血管喪失を防止しました。

サイクリン依存性キナーゼファミリーのメンバーである CDK5 は、内皮細胞の増殖、移動、および血管新生を調節し、AD の主要な病理学的特徴に関与しています [65、66、67、68]。我々の研究では、内皮Cdk5の過剰発現がCXCL1分泌とAD脳への末梢好中球浸潤を阻害した。実際、以前の研究では、内皮特異的 Cdk5 ノックアウトが CXCL1 誘発星状神経膠症を上方制御することによりマウスの自発発作を引き起こすことが報告されています [48]。海馬における Cdk5 mRNA 発現の低下 [69] およびタウ関連 AD 患者の前頭前皮質微小血管における CXCL1 遺伝子発現の増加という所見 [70] と併せて、これらの結果は、脳内皮細胞における Cdk5 欠損が CXCL1 分泌を促進することを示している [71] 。したがって、我々の研究は、血清由来のVEGF-AがCdk5活性を調節することによってCXCL1分泌を抑制し、それによって脳への好中球の遊走を防ぐことを実証している。

好中球とミクログリアの相互作用は、二光子生体内顕微鏡法を使用した LPS 誘発炎症モデルで報告されています [72]。さらに、ミクログリア由来の IL-1β とケモカイン CXCL1 は、Syk アダプター CARD9 依存的に好中球を真菌に感染した CNS に動員します [45]。今回我々は、ミクログリアの活性化とシナプスの喪失が、血清、内皮Cdk5の過剰発現、または好中球浸潤の遮断によって防止されることを示した。したがって、好中球は、AD マウスモデルにおけるミクログリアの剪定を促進する炎症誘発性シグナルを提供する可能性があります。興味深いことに、我々は、ADマウスモデルにおいて浸潤好中球がいくつかの脳領域でNETを放出するが、抗Ly6G抗体と血清処理によって阻止されることを実証した。この相互作用は、NET を介したミクログリアの活性化とニューロンシナプスの剪定の興味深いメカニズムを表す可能性があります [73]。 ADマウスモデルにおけるミクログリアの活性化とシナプス刈り込みにおける好中球産生NETの役割を調査するには、今後の研究が必要である。

重要なことに、我々は免疫活性化を介した脳への単球の補充がアルツハイマー病に対して有益な効果を発揮する可能性があることを以前に実証していた[27、74、75]。現在の研究では、血清処理後に末梢単球が増加しましたが、APP/PS1 マウスの脳では単球/マクロファージではなく好中球浸潤が大幅に減少していることがわかりました。これが、アルツハイマー病の病態における浸潤好中球の重要な役割に特に焦点を当てる理由です。血液の若返りは、ニューロンのシグナル伝達経路に関与するさまざまな遺伝子の発現を正常レベルに向けて調節する可能性もあります。たとえば、若い血漿には、再生に依存する Notch シグナル伝達の活性化 [76]、成長分化因子 11 経路の回復 [12、77]、オキシトシンレベルの上方制御 [78]、およびサイクリックAMP応答エレメント結合タンパク質の活性化。

VEGF-A は、脳内の神経新生と血管新生を促進する神経保護サイトカインです [79、80]。一貫して、我々は、血清がADマウスにおける不十分な循環VEGF-Aレベルを回復するという証拠を提供した。組換え VEGF-A は、in vitro で内皮細胞の増殖を促進し、in vivo での毛細血管の喪失を防止しました。したがって、VEGF-A は、特に年齢 [22、79] やアルツハイマー病 [81] において、十分な血中酸素を得るために脳灌流と血流を改善するのに重要である可能性があります。したがって、内皮VEGF-A/Cdk5シグナル伝達は、好中球浸潤の調節を通じてAD病態を改善する潜在的な治療戦略である可能性がある。

VEGF-A に加えて、血管内皮細胞の機能に関与する VCAM1、HGF、クラスタリンなどの他の濃縮血液由来因子も脳機能を改善する可能性があります。実際、脳内皮の VCAM1 遺伝子欠損は、ミクログリアの反応性や記憶機能など、若い脳に対する老化した血漿の有害な影響を打ち消します [16]。最近、HGF は、AD の別のマウスモデルである SAMP8 マウスにおいて、海馬の神経新生と認知機能に有益な効果があることが示されました [82]。補体カスケード阻害剤であるクラステリンは、脳内皮細胞に結合し、mThy-1-hAPP751 マウスの神経炎症を軽減することができます [83]。他の血清因子が VEGF-A と連携して作用するかどうかはまだ不明ですが、私たちの研究は、アルツハイマー病の脳機能を回復するための血液由来因子の応用を拡張します。血清因子を使用した、より標的を絞った治療法または併用療法については、さらなる研究が必要です。

VEGF は、さまざまな種類の細胞の複数のシグナル伝達経路で幅広い機能を持っています。例えば、アストロサイトに対するVEGFの効果をブロックするとBBBの破壊が逆転し[84]、内腔VEGFシグナル伝達を阻害するとBBBの完全性と脳血流が増加し、APP/PS1マウスの毛細血管密度が減少した[85]。この研究では、低用量のVEGF-A注射により、同じ系統のADマウスモデルの脳毛細血管密度が回復することを観察しました。これは、Aliの研究において抗VEGF治療により毛細血管密度が減少したことを示すデータと一致しています。しかし、VEGF-A注射後の我々のADマウスモデルでは、BBBの完全性と透過性の有意な変化は観察されませんでした。考えられる理由は、私たちが使用したAPP/PS1マウスモデル（8か月）が、アリの研究で使用された動物（10〜14か月）よりも若いことです。別の説明としては、低用量のVEGF-A治療後にBBB透過性の一時的な増加が起こる可能性があり、これは数時間以内に回復できるというものである[86]。したがって、当然のことながら、ＶＥＧＦ－Ａで処置したＡＰＰ／ＰＳ１マウスでは、ＢＢＢの透過性および完全性はさらに悪化しなかった。

さらに、エンドセリン-1 (EDN1) やフィブリノーゲン (FG) など、多くの循環タンパク質が BBB 透過性の調節に関与していることが確認されており、AD 患者の前頭皮質で増加すると報告されている [87]。したがって、細胞型、疾患モデル、疾患段階に応じて、BBB 透過性、毛細血管密度、血流における VEGF-A の特定の役割を解明する必要があります。さらに、8か月齢の血清がアルツハイマー病に対して4～6か月齢の血清と同じプラスの効果をもたらすかどうかという問題は、依然として未解決のままであった。これは現在の研究における限界であり、将来的に対処する必要がある。

若年または運動時の血清/血漿からの血液由来因子は、高齢動物とアルツハイマー病マウスモデルの両方において、学習と記憶だけでなく、神経新生、シナプス可塑性、炎症などの脳機能に利益をもたらすことが提案されています。したがって、他の神経変性疾患への血液因子の適用は検討に値します。我々のデータは、内皮VEGF-A/Cdk5シグナル伝達が好中球輸送分子を媒介するという証拠を提供し、脳内皮VEGF-A/Cdk5がアルツハイマー病の潜在的な治療標的として機能する可能性があることを強調しています（図8）。

ADマウスの脳への好中球浸潤の過程における内皮VEGF-A/Cdk5/CXCL1シグナル伝達の役割が提案されている。野生型血清由来 VEGF-A は、Cdk5 活性の上方制御を介して脳血管内皮 CXCL1 発現を抑制し、それによって AD マウスの脳への好中球の動員を停止し、記憶障害を改善します。 VEGF-AR VEGF-A 受容体、CXCR2 CXC モチーフケモカイン受容体 2。

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Lin Zhang 氏、Hongyang Zhang 博士、Bs に感謝します。 Zhenyan Yu の親切なサポートに感謝します。また、自然免疫関連の実験についてご提案をいただきました Qunfang Yuan 氏と Juntao Zou 博士にも感謝いたします。中山大学中山医科大学の医学コアラボプラットフォームに感謝いたします。

この研究は、中国国家科学財団 (82271473、81971021、81901339、82172547、および 82172636)、中央大学基礎研究基金 (19ykpy99)、科学イノベーション 2030 - 脳科学および脳にインスピレーションを得た知能技術専攻の支援を受けました。プロジェクト (2021ZD0201100 および 2021ZD0201102)、広州科学技術計画プロジェクト (202002030441)、および中国広東省自然科学財団 (2019A1515011184、2020A151501001)。

方方斉

現在の住所: 神経内科、メイヨークリニック、ロチェスター、ミネソタ州、55905、米国

Fangfang Qi、Zejie Zuo、Kaishun Hu、Shengwen Wang、Long-Jun Wu、Kaihua Guo の著者も同様に貢献しました。

広東省解剖生理学部門中山大学中山医科大学第一附属病院先端医療技術センター脳機能と疾患の主要研究室、広州市、510080、中国

Fangfang Qi、Rui Wang、Tong Wu、Hao Liu、Jiaoling Tang、Qingbo Wang、Yunjie Yang、Jie Xu、Zhibin Yao、Kaihua Guo

中山大学ジャーナル編集部、広州、510080、中国

方方斉

中山大学第三附属病院リハビリテーション医学科、広州、510630、中国

ズオ・ゼジエ

広東省悪性腫瘍エピジェネティクスおよび遺伝子制御重点研究所、広東・香港RNA医学共同研究所、孫文記念病院、中山大学、広州、510120、中国

胡開春

2017 年度臨床医学 5 年間プログラム、中山大学医学部、深セン、528406、中国

謝玉峰

中山大学孫文記念病院神経科、広州、510120、中国

リレン・タン

幹細胞生物学および組織工学センター、教育省幹細胞および組織工学の主要研究所、中山大学、広州、510080、中国

チャン・シャオラン

神経科、メイヨークリニック、ロチェスター、ミネソタ州、55905、米国

Jiaying Zheng & Long-Jun Wu

中山大学孫文記念病院脳神経外科、広州、510120、中国

王盛文

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KG、KH、L-JW、および FQ は、この研究の設計とデータの分析に貢献しました。 SW、L-JW、FQ が原稿を書きました。 FQ、SW、ZZ、RW、YX、HL、JT、TW は、行動評価、共焦点レーザー走査型顕微鏡、生化学実験など、ほとんどの実験を実施しました。 XZおよびQWには血清を投与した。 LT は in vitro で実験を実施しました。残りの著者全員が元のデータの作成に参加し、原稿の批判的な評価を提供しました。著者全員が最終原稿を承認しました。

Shengwen Wang、Long-Jun Wu、Kaihua Guo との通信。

著者らは競合する利害関係を宣言していません。

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Qi、F.、Zuo、Z.、Hu、K. 他。血清中のVEGF-Aは、好中球浸潤をブロックすることにより、APP/PS1トランスジェニックマウスの記憶障害を防ぎます。モル精神医学（2023）。 https://doi.org/10.1038/s41380-023-02097-w

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受信日: 2022 年 7 月 28 日

改訂日: 2023 年 4 月 17 日

受理日: 2023 年 4 月 27 日

公開日: 2023 年 6 月 6 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s41380-023-02097-w

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