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Molecular Psychiatry volume 27、pages 4905–4917 (2022)この記事を引用

3584 アクセス

16 オルトメトリック

メトリクスの詳細

すくみは、主要なストレス対処メカニズムを構成する保存された防御行動です。 数十年にわたる研究により、扁桃体、中脳水道周囲灰白質、視床下部が、すくみを含む恐怖反応の制御の中核的なアクチュエーターとしての役割を果たしていることが実証されている。 しかし、他の調節部位がこの配線された足場に与える役割は不明です。 今回我々は、足への電気ショックへの曝露によって引き起こされるすくみが、コリン作動性およびグルタミン酸作動性のLDTgニューロンの興奮性を変えることなく、VTAに投射する後背被蓋（LDTg）GABA作動性ニューロンを活性化することを示す。 この抑制性投射の選択的化学遺伝学的サイレンシングは、他の LDTg ニューロン サブタイプではなく、すくみ反応を弱めますが、条件付けされた恐怖記憶の形成は妨げません。 逆に、VTA 内の LDTg GABA 末端の光遺伝学的活性化は、すくみ反応を促進し、すくみの一般的な特徴である徐脈を誘発します。 注目すべきことに、この嫌悪感情報は、その後、別個のGABA作動性経路を介してVTAから扁桃体に伝達されます。 したがって、我々は、心的外傷後ストレス障害、パニック発作、社会恐怖症などの病理学的すくみ状態と潜在的なトランスレーショナル関連性を有する、LDTg-VTA-扁桃体領域を結び付ける回路機構を明らかにした。

ストレスは適応の重要な原動力です。 ストレス反応は生存を促進するため、ほとんどの場合有益です。 生物は、脅威などの環境ストレス刺激を受けると、専用の大脳回路を活性化して、多様な防御行動のレパートリーの中から最も適応的な反応を選択します[1]。 これらの先天的および学習された反応は、自然選択によって形成され、無脊椎動物と脊椎動物の両方で保存されています。 防御行動は、刺激の性質だけでなく、行動抑制や不安特性などの内的要因によっても異なります [2、3]。 行動出力の観点から見ると、防御行動は、すくむなどの受動的戦略から積極的な闘争・逃走反応まで多岐にわたり、これらの受動的モードと能動的モードの間の切り替えは、行動の柔軟性にとって不可欠です[1、4、5]。

すくみは、脅威に遭遇したときの身体の緊張した姿勢により、呼吸以外の動きが完全になくなることを特徴とする普遍的な恐怖反応です。 フリーズは過覚醒状態に相当するため、ストレス対処プロセスにおいて重要であり、意思決定を可能にし、その結果、最も適切な行動戦略を構築することができます。 すくみは、心的外傷後ストレス障害 (PTSD)、パニック発作、社会恐怖症などの脅威関連障害の病因と関連性がありますが [6,7,8,9]、基礎となる神経回路と細胞基質はまだ理解されていません。 。 多くの証拠は、中水道周囲灰白質（PAG）、視床下部、または扁桃体複合体などの脳構造が、げっ歯類と人間の両方において無条件および条件付きの脅威の検出、統合、および応答において主要な役割を果たしているということを示している[2、10] 、11]。 実際、病変、薬理学的介入、電気刺激から、より最近の光遺伝学および薬理遺伝学的ツールに至るまで、さまざまなアプローチを用いた数十年の研究により、扁桃体がこの恐怖防御システムの階層的ネットワークの中核ユニットとして位置づけられました[11]。 外側扁桃体は、皮質および視床核からの感覚および連合入力から情報を計算し、それが中央扁桃体出力核に伝えられます[2、11]。 この後者は、PAG および視床下部経路の活性に影響を及ぼし、その後、延髄および橋の活性に影響を及ぼし、その結果、内臓機能、筋収縮および疼痛感受性が変化します [12]。 しかし、ストレスが脳に及ぼす影響を考慮すると、ストレス対処は重要な調節脳ネットワークを動員する可能性が高く、それがすくみ反応を形成する可能性があります。 これらの経路を明らかにすることは、すくみなどの恐怖反応の病因を完全に理解し、これらの根底にある相互接続された皮質下および皮質領域の包括的な機能マップを構築するための重要なステップです。 人間の場合、この分散型防御ネットワークは、エピジェネティックな変化やシナプス変化によって維持される過度の活性化や持続的な規制緩和に悩まされる可能性があり、臨床的には激しい苦痛、外傷周囲反応、PTSDの状態として現れます[13]。

後背側被蓋核 (LDTg) は大脳辺縁系領域と相互接続されており、体性感覚、視覚、聴覚の刺激に反応します [14]。 主に報酬指向の行動 [15,16,17] や逆説的な睡眠 [18, 19] におけるその役割について研究されていますが、最近の研究では、LDTg がストレス関連情報を伝達できることが示されています [20, 21]。 LDTg は、食欲と負の価数の行動を調節する動機のバランスの強力な調節因子を構成します。 網様体形成の一部として、LDTg は行動の覚醒にも寄与し、恐怖反応に影響を与える重要な要素である感覚統合を促進します [22, 23]。 したがって、我々は、LDTg がすくみ反応などの防御行動に寄与している可能性があると仮説を立てました。 これをテストするために、電気生理学的生体内および体外記録と行動分析を組み合わせて、電気ショック誘発性のすくみを評価しました。 LDTg をすくみ反応と因果的に結び付けるために、ウイルスタグを付けた脳回路に薬理遺伝学的アプローチと光遺伝学的アプローチを採用しました。 我々は、LDTg GABA作動性の腹側被蓋野（VTA）への投射に関係し、その後扁桃体ニューロンに影響を与えて無条件すくみ反応を調節することを示唆する非標準的経路を明らかにした。

すべての手順は、実験動物の管理と使用に関する欧州委員会 (2010/63/EU) の推奨事項に従い、フランス国家倫理委員会 (#9185-2017020911476246 および #16459-2018061116303066) によって承認されました。 雄の C57BL/6J マウス (Janvier Labs、フランス)、vGAT-CRE マウス (The Jackson Laboratory、ストック番号: 028862)、vGluT2-CRE マウス [24]、および ChAT-CRE マウス (The Jackson Laboratory、ストック番号: 006410）。 トランスジェニック マウスはヘテロ接合性であり、C57BL/6J バックグラウンドで戻し交雑されました。 マウスは、午前 8 時から午後 8 時まで点灯し、12 時間/12 時間の明暗サイクルで 1 ケージあたり 4 ～ 5 匹のマウスを飼育しました。マウスは、餌と水を自由に摂取できました。 強化されたハウジングは、木の咀嚼ブロック、プラスチックのイグルー、巣作りを容易にする綿で構成されていました。 行動実験に使用されたすべてのマウスは、in vivo 光遺伝学実験のための腹腔内注射およびレーザー ケーブルへの接続によって誘発されるストレスを制限するために、各試験の前 1 週間毎日触られました。 すべての試験は少なくとも生後 2 か月の成体マウスで行われ、同腹子は対照として使用されました。 すべての実験は ARRIVE ガイドラインに従って実行されました。

クロザピン-N-オキシド (CNO) は Enzo Life (フランス) から購入し、ケタミンとキシラジンは Centravet (フランス) から購入し、ピクロトキシンは Sigma-Aldrich (フランス) から購入しました。 インビボ投与用のすべての薬剤は、0.9% NaCl の生理食塩水で希釈されました。 参考文献に以前に記載されているように、マウスには生理食塩水(10mL/kg)またはCNO(1mg/kg)のいずれかを投与した。 [20]。

ウイルスは以下の施設から購入しました: Addgene (プラスミド #50475 AAV8-hSyn-hM4D(Gi)-mCherry、プラスミド #44362 AAV8-hSyn-DIO-hM4D(Gi)-mCherry、プラスミド #44361 AAV8-hSyn-DIO-hM3D (Gq)-mCherry、プラスミド #20298 AAV5-EF1a-double floxed-hChR2(H134R)-EYFP-WPRE-HGHpA、プラスミド #20297 AAV5-EF1a-double floxed-hChR2(H134R)-mCherry-WPRE-HGHpA) および Plateformeモンペリエのベクトル学 (イヌ アデノウイルス 2 型、CAV-2-Cre)。 投影および細胞型に特異的な方法での調節のために、チューリッヒのベクターコア施設からのウイルスを使用しました（識別子：v190-8 AAV-8/2-hSyn1-dFRT-hM4D(Gi)-mCherry(rev)-dFRT-WPRE- hGHp(A)、識別子:v171-retrograde ssAAV-retro/2-hSyn1-chI-dlox-EGFP_2A_FLPo(rev)-dlox-WPRE-SV40p(A))、AAV および CAV-2-Cre の力価は 1012 ppl 以上でした/mL および ≥1013 ppl/mL。

定位固定フレーム(Kopf Instruments)を使用して、定位固定注射を行った。 全身麻酔は、ケタミン (150 mg/kg) とキシラジン (10 mg/kg) の混合物を使用して達成されました。 すべてのウイルスを、100 nL/分の速度で、部位あたり最終体積 200 nL となるよう両側に注射しました (300 nL を注射した VTA を除く)。 マウスは手術時に生後5～6週で、十分なウイルス発現を可能にするために、薬理遺伝学的実験には少なくとも3週間、光遺伝学的検査には6週間の回復期間が与えられた。 定位座標 (前後: AP、中外側: ML、背腹: DV) は、成体マウスの脳の Paxinos アトラス [25] に基づいており、若いマウスで手術を行う際に適応されました。 これらは、AP および ML 座標のブレグマからのミリメートル (mm) でここに与えられます。DV は、注射部位の頭蓋骨から取得されます。 座標は次のとおりでした:LDTg:AP −4.70、ML ± 0.50、DV −3.60。 VTA: AP −2.80、ML ± 0.60、DV −4.70。 CeA: AP −0.75、ML ± 3.00、DV −5.05。 vILPAG: AP −4.00、ML ± 0.60、DV −2.50。 BLA: AP −1.30、ML ± 3.20、DV −4.60。 LS: AP + 1.0、ML ± 0.2、DV -3.35。

LDTg ニューロンを沈黙させるために、AAV8-hSyn-hM4D(Gi)mCherry を C57Bl6J マウスの LDTg に両側注射しました。

LDTg コリン作動性、グルタミン酸作動性、および GABA 作動性ニューロンを特異的に沈黙させるために、AAV8-hSyn-DIO-hM4D(Gi)mCherry をそれぞれ ChATCre、vGluT2Cre、および vGATCre マウスの LDTg に両側注射しました。

突起特異的サイレンシングのために、野生型マウスの水道周囲灰白質（PAG）、扁桃体中心部（CeA）またはVTAにCAV-2-Creを、LDTgにhSyn-DIO-hM4D(Gi)-mCherryを両側注射した。 （以下、LDTghM4→PAG、LDTghM4→CeA、LDTghM4→VTAマウスと呼ぶ）。 VTAg→BLA投影の選択的操作のために、BLAにCAV-2-Creを、VTAにhSyn-DIO-hM4D(Gi)-mCherryを両側に注入しました。

LDTgのVTA投影を選択的に活性化するために、VTAにCAV-2-Creを、野生型マウスのLDTgにhSyn-DIO-hM3D(Gq)-mCherryを注入しました（以下、LDTghM3→VTAと名付けます）。

投影および神経伝達物質特異的な操作のために、vGATCre マウスの VTA に逆行性 AAV-retro/2-hSyn1-chI-dlox-EGFP_2A_FLPo(rev)-dlox-WPRE-SV40p(A) と AAV-8 を両側に注射しました。 LDTg の /2-hSyn1-dFRT-hM4D(Gi)-mCherry(rev)-dFRT-WPRE-hGHp(A) (以下、GAThM4 と呼びます。LDTg→VTA)。

光ファイバー (200 μm コア、0.39 NA、[26] のプロトコルに従って作成) を 15° の角度で VTA に両側から移植しました (AP: -2.8 mm; ML: -1.5 mm; DV: -4​​.2 mm)。ウイルス注射から –5 週間後 光ファイバーは、嵌合スリーブ (ThorLabs、ADAL1-5) によってパッチコード (Doric Lenses、MFP_200/240/900-0.22_1m_FC-ZF1.25(F)) に接続され、光ファイバーに接続されました。ロータリー ジョイント (Doric Lenses FRJ_1x2i_FC-2FC_0.22) 自体をレーザー源 (ThorLabs S1FC473MM) に接続しました。行動テスト前の 1 週間、マウスを 1 日あたり 30 分間光ファイバー接続に慣れさせました。実験当日、マウスは行動を実行しました。接続後の 10 分 [21] の慣れ後にテスト. 青色 (470 nm) レーザーの出力は、光ファイバーの先端で測定して 10 mW mm-2 でした. 光刺激は 50 Hz、20 ms のパルスで送達されました。対照群のマウスは同じ処置を受け、同じ強度のレーザー刺激を受けましたが、ウイルス注射や光ファイバーの移植が間違って行われたマウスは除外されました。 刺激パラメータは、私たちの研究室で行われた生体外の電気生理学的記録と出版された文献[21]の両方に基づいていました。

条件付けされた場所嫌悪テストでは、中立コンパートメントで接続された 2 つの異なるチャンバー (異なる視覚的および触覚的手がかりを持つ) を使用しました。 1日目、対照マウスとvGAT-Cre ChR2マウスは20分間装置を自由に探索した。 2日目から4日目まで、マウスをペアのチャンバーにランダムに割り当て(ペアリングはバランスをとった)、光刺激(50Hzの周波数、20msの持続時間、5分間隔で5分間の持続時間で照射)を受けた。 20分間のコンディショニングセッションを毎日2回実施し、マウスがペアのチャンバーで光刺激を受け、ペアになっていないチャンバーでは光刺激を受けないようにした（午前と午後のセッションは平衡）。 5日目、マウスは刺激のない状態で装置を自由に探索しました。 結果は、5 日目 (テスト) と 1 日目 (テスト前) の間のペアのチャンバーで費やした時間の違いとして表されます。

すべての行動試験では、特に明記しない限り、試験開始の少なくとも 1 時間前にマウスを実験室に隣接する馴化室に収容した。 特に明記しない限り、行動試験の 30 分前に生理食塩水または CNO を注射しました。 各試験の後、マウスは、すべての試験が完了して最終的にホームケージに戻るまで、未試験のマウスとの社会的相互作用を避けるために、一時的に新しいケージに収容された。

電気ショックによるすくみを測定するために、各マウスを防音試験室に個別に入れました。床は 27 本のステンレス鋼棒 (直径 4 mm) が 1 cm 間隔で配置され、電気ショックを与えるために発電機に接続されています。ショッカー LE 100-26 Panlab Harvard Apparatus Bioseb)。 マウスを装置内で 3 分間自由に探索させた後、58 秒間隔で 3 回連続足部電気ショック (強度: 0.7 mA、持続時間: 2 秒) を与えました。 最後の足へのショックの１分後、マウスは試験室に留まった。 マウスの活動レベルは、マウスの動きによって引き起こされる体重の変動を評価するために、フロアグリッドの下に配置された高精度センサープレート（ロードセルカプラー LE 111 Panlab Harvard Apparatus Bioseb）を通じて記録されました。 各テストは、装置の上に設置されたビデオ カメラ (Samsung SDP-860) を使用して記録されました。 すくみは、累積持続時間少なくとも 2 秒間、呼吸以外の動きが完全に欠如していることと定義されました。 実験条件を知らない実験者が、ビデオ録画を使用して各マウスのすくみ行動を手動で記録しました。

活性化型 hM3 DREADD システムで使用される凍結パラダイムの閾値未満バージョンを 2 日間実行しました。 初日、マウスを上記のようにテストチャンバーに入れ、5分間自由に探索させました。 2 日目に、マウスに生理食塩水または CNO を注射し、すぐに試験チャンバーに導入しました。 マウスを自由に探索できるように 1 分間放置し、その後足に 2 回電気ショックを与えました (強度: 0.7 mA、持続時間: 2 秒、間隔は 58 秒)。 次に、マウスを 15 分間静置し、試験の最後の 5 分間に上記と同じ方法を使用してすくみ行動を評価しました。

凍結およびその閾値未満バージョンで使用されたすべてのマウスは、他の行動試験では再使用されませんでした。

インビボ光遺伝学的操作のために、マウスを同じ試験箱に入れ、装置を自由に探索できるように５分間放置した（慣れ、オフ）。 次に、脳内照明を 1 分間 (ON)、その後 1 分間照明なしで (OFF) 受けました。 感電は行われなかった。 嫌悪記憶の形成をテストするために、マウスを 24 時間後に同じ状況に再曝露しました。 ビデオカメラは、さらなる行動分析のためにテストチャンバーの側面に設置されました。

O-maze テストは不安レベルを測定するために使用されました。 各マウスを、四分円で交互に配置された 2 つの開いたアームと 2 つの閉じたアームからなる円形迷路に配置しました (歩行レーンの幅: 5 cm、全体の直径: 55 cm、壁の高さ: 12 cm、床からの高さ: 60 cm) ) オープンアーム内で 200 ルクスの周囲光。 迷路の上に置かれたビデオカメラを使用して、マウスの動きを５分間記録した。 実験グループを知らされていない実験者が、オープンアームで費やした時間をスコア化しました。

オープンフィールドテストは、運動活動を測定するために使用されました。 各マウスを周囲光 200 ルクスの 40 × 40 cm のオープンフィールドに 5 分間置き、自由に探索できるように放置しました。 マウスの動きは、装置の上に設置されたビデオカメラを使用して記録された。 遠隔移動は、AnyMaze ソフトウェア (Stoelting、フランス) を使用して自動的に分析されました。

ハーグリーブステストは、痛みの感受性を測定するために使用されました。 各マウスを、赤色光で照らされた部屋の小さな透明なプラスチック製のコンパートメントに置き、30分間馴化させた。 次に、放射赤外線源 (強度: 190 ± 1 mW cm2) をマウスの後足の下に置き、足を引っ込めるまでの時間を測定しました。 毎日、各後足について少なくとも 1 分間の間隔をあけて 2 つの測定を行い、平均潜時を計算しました。 テストは、各試行の間に 1 日の間隔を置いて 3 日間繰り返されました。 最後の 2 つの試験の結果のみが盲検実験者によって分析されました。 注目すべきことに、ハーグリーブス試験を受けたマウスは、CNO前曝露の潜在的な影響を回避するために、最初にO迷路で試験され、次に各試験の間に4日の間隔を置いてオープンフィールドで試験された。

マウスを麻酔し（ケタミン１５０ｍｇ／ｋｇ、キシラジン１０ｍｇ／ｋｇ）、切片調製のために経心臓的にａＣＳＦを灌流した。 LDTg 記録では、KCl 2.5、NaH2PO4 1.25、MgSO4 10、CaCl2 2.5、グルコース 11、スクロース 234、および次に、スライスを、NaCl 119、KCl 2.5、NaHPO4 1.25、MgSO4 1.3、CaCl2 2.5、NaHCO3 26、およびグルコース 11 を含む (mM) aCSF 中で 37 °C で 15 分間インキュベートし、その後室温に保ちました。 。 スライスを移し、2.5 mL/min aCSF を灌流した記録チャンバー内で 32 ～ 34 °C に維持しました。 正立顕微鏡（Olympus France）を使用して、視覚化された全細胞電圧クランプまたは電流クランプ記録技術を使用して、それぞれシナプス応答または興奮性を測定しました。 電流クランプ実験は、Multiclamp 700B (Molecular Devices、カリフォルニア州サニーベール) を使用して得られました。 Digidata 1440 AコンバーターおよびpCLAMP 10.2ソフトウェア（Molecular Devices、CA）を使用してシグナルを収集し、保存しました。 すべての場合において、アクセス抵抗は-10 mV (0.1 Hz)のステップで監視され、抵抗が20%を超えて増加した場合、実験は破棄されました。 内部溶液に含まれる内容 (mM): KD-グルコン酸 135、NaCl 5、MgCl2、HEPES 10、EGTA 0.5、MgATP 2、および NaGTP 0.4。 脱分極 (0 ～ 300 pA) または過分極 (0 ～ 450 pA) の 800 ms 電流ステップを使用して、LDTg および VTA ニューロンの興奮性と膜特性を評価しました。 VTA 記録の場合、以前と同様に 250 μm の水平スライスを取得し、記録を開始する前に aCSF 中で 37 °C で 1 時間インキュベートしました。

VTA 内の機能的なシナプス接続を調べるために、LDTg に AAV-DIO-ChR2-YFP を、VTA に AAV-hSyn-DIO-mCherry を vGATCre マウスに注射しました。 これにより、光遺伝学的に GABA 作動性 LDTg 末端を活性化しながら、mCherry を発現する VTA GABA 作動性ニューロンを同定することができます。 マウスの別のバッチで、LDTg に同じ注射を実行し、古典的な基準に基づいて以前に行われたように、推定上の VTA DA ニューロンが同定されました [20、27]。 VTA グルタミン酸作動性ニューロンを明確に同定するために、vGluT2Cre マウスに VTA に AAV-hSyn-DIO-mCherry を、LDTg に非 cre 依存性 AAV-hSyn-ChR2-YFP を注射しました。 我々は、グルタミン酸受容体拮抗薬（AP5 50μMおよびDNQX 10μM）およびコリン作動性受容体拮抗薬（メカミラミン10μMおよびアトロピン1μM）を使用して、光遺伝学的刺激のGABA作動性成分を薬理学的に単離した。 最後に、VTA→BLA ニューロンを記録するために、LDTg に AAV-DIO-ChR2-YFP を、BLA にレトロ AAV-hSyn-tdTomato を vGATCre マウスに注射しました。 VTA の水平セクションは以前に行われたように準備されました [20]。 VTA における蛍光タグ付きニューロンの全細胞電圧クランプ記録は、AMPA 電流をブロックする DNQX の存在下で、以前と同じ内部溶液を使用して Vm = −40 mV で実行されました。 光電流は、対物光路を介して LED によって送出される 5 ms の青色光パルスによる光学照明 (0.1 Hz) によって誘導されました。 20 回の掃引をオフラインで平均し、ピーク振幅を測定して光誘発電流のサイズを評価しました。 GABA-A 受容体媒介電流は、最終濃度 50 μM で適用されたピクロトキシン (Sigma、フランス) 浴を使用してブロックされました。

すべての場合において、オフライン分析は、Clampfit 10.2 (Axon Instruments、米国) および Prism (Graphpad、米国) を使用して実行されました。

脳の固定を達成するために、ケタミン (150 mg/kg) とキシラジン (10 mg/kg) の混合物を使用してマウスを麻酔し、冷リン酸緩衝液 (PB 0.1 M Na2HPO4/NaH2PO4、pH 7.4) で経心臓灌流を受け、その後パラホルムアルデヒド (PFA 4%、PB 0.1 M で希釈)。 脳を 4% PFA 中で 4 °C で一晩放置し、その後 40 μm の浮遊スライスに切断しました。 切片を使用して、各動物の定位ウイルス注射およびインビボ光遺伝学的実験のためのカニューレ移植の正しい位置を評価した。

cFos標識のために、側坐核、扁桃体または外側中隔を含む脳切片を、10％正常ヤギ血清（NGS）を含むPBS-BT（PBS 0.5％ BSA、0.1％ Triton X-100）中でインキュベートしました（30分間）。 次いで、切片を一次抗cFos (1:1000、Abcam anti-rabbit1:1000、Cat Ab190289)とともにPBS-BT、1% NGS中で36時間インキュベート(4℃)しました。 切片を PBS ですすぎ、ヤギ抗ウサギ Alexa488 二次抗体 (1:1000、Vector Laboratories、カリフォルニア州バーリンゲーム)、ネコヤギ抗ウサギ Alexa488 二次抗体 (1:1000、Vector Laboratories、カリフォルニア州バーリンゲーム) 中でインキュベートしました (2 時間)。 ; Cat. DI-1488-1.5) in PBS-BT, 1% NGS. 切片を PBS ですすぎ、Mowiol でマウントする前に DAPI で 5 分間インキュベートしました. cFos 陽性細胞の定量化のための画像は、TCS SP5 共焦点顕微鏡を使用して取得しました(Leica Microsystems). 治療を知らない実験者が、ImageJ を使用して手動でカウントしました。カウントは、分析された各領域の 2 つの隣接する脳切片と 2 つの半球で行われました。各マウスの平均値が平均され、各実験条件 (つまり、コントロールまたはChR2) cFos+ 細胞/mm2 として。

以前に公開されたとおりに実行しました [28、29]。 簡単に説明すると、電気生理学実験のための定位手術は、1.0〜1.5％イソフルラン（50％空気/50％O2中、1L/分）麻酔下で実施されました。 0.5% 酢酸ナトリウム中の 2% ポンタミン スカイブルー溶液で満たされたガラス製マイクロピペットを VTA 内に下げました (-3.16 mm/ブレグマ、0.5 mm/正中線、3.5 ～ 4.5 mm/脳表面) [25]。 細胞外電位は、Axoclamp-2B 増幅器およびフィルター (300 Hz/0.5 Hz) を使用して記録されました [30]。 スパイクはオンラインで収集されました (CED 1401、SPIKE 2、Cambridge Electronic Design、英国)。 VTA ドーパミン ニューロンは、十分に確立された電気生理学的特徴 [31、32] に従って同定されました。これには、(i) ≧ 1.1 ms の活動電位 (活動電位の開始から負の谷まで測定)、(ii) 自発的発火速度（≤10 Hz） (iii) 生体内で 2 ～ 10 個のスパイクによって構成される単一およびバーストの自発発火パターン。 バーストの開始は 80 ミリ秒未満のスパイク間間隔で定義され、バーストの終了は 160 ミリ秒以上のスパイク間間隔で定義されました [33]。 推定上の VTA GABA ニューロンは、十分に確立された電気生理学的基準に従って同定されました。(i) 活動電位 <1 ms。 (ii) VTA 境界は、最初の VTA DA ニューロンの背側 100 μm に定義されました [33,34,35,36]。 VTA ドーパミン ニューロンの発火とバーストに関するいくつかのパラメーターを 100 秒にわたって分析しました。発火率の累積確率分布と、平均値 ± SEM の棒グラフ、バースト率、バーストにおけるスパイクの割合 (% SIB) です。 GABA ニューロンの発火頻度を 100 秒にわたって分析しました。 結果は平均±SEMとして表されます。

心拍数は、MouseOx Pulse 非侵襲性酸素濃度計 (Starr Life Sciences) を使用して記録しました。 簡単に説明すると、記録の 24 時間前にマウスの首の周囲の毛を剃りました。 記録日に、個々のマウスを麻酔し、1.0 ～ 1.5% イソフルラン下 (50% 空気/50% O2、1 L/分) に維持しました。 首のカラーとシステムはメーカーの指示に従って設定され、VTA の LDTg GABA 末端を刺激するために光ファイバーが頭に接続されました。 10 分間のベースラインを得た後、3 つの光刺激プロトコルを 2 分間隔で 50 Hz で 1 分間実施しました。 心拍数は 5 Hz のサンプリング レートで取得され、Excel を使用して分析されました。 ベースラインからの心拍数の偏差は、平均と SD を使用してトレース全体の Z スコアを構築することによって計算されました。 データは平均±SEMとして表されます。

データは、Prism (GraphPad、米国) を使用して分析されました。 分布の正規性は、最初にコルモゴロフ-スミルノフ検定を使用してテストされました。 グループの数と正規性検定の結果に応じて、スチューデント t 検定、マンホイットニー大学、または二元配置分散分析とその後の事後シダック検定を使用してグループを比較しました。 図中のデータは平均値±SEMとして表されています。 統計的有意性は従来 *p < 0.05 で確立されていました。 **p < 0.01; ***p < 0.001。

凍結の処理におけるLDTgの関与を評価するために、我々は、電気足ショックの投与前にLDTgニューロンを遠隔から沈黙させる化学遺伝学的アプローチを使用した。 野生型C57BL/6Jマウスに、阻害性DREADD（AAV-hSyn-hM4D-mCherry）をLDTgに注射した（以下、LDTghM4マウスと呼ぶ）（図1a、左パネル）。 活動チャートに示されているように、足へのショック伝達により運動活動が低下し、すくみ姿勢で過ごす時間が増加しました（図 1a、中央パネル）。 生理食塩水で処理したマウスのすくみを定量化したところ、足にショックを与えるたびにこの行動が徐々に増加することが示されました。 対照的に、LDTg ニューロンのサイレンシングは、すくみ反応曲線の顕著かつ有意な下方シフトを引き起こしました（図 1a、右パネル）。 このすくみの減少は、生理食塩水およびCNOで処理したLDTghM4マウスがオープンフィールド高架O迷路およびHargreavesテストで同様の反応を示したため、運動活動、不安レベル、または痛みに対する感受性の変化によって引き起こされたものではありませんでした（図1b、c、図1b、c、それぞれd）。 重要なことに、24時間後（2日目）に同じ状況に再曝露すると、両方のグループで同等の条件付けされたすくみ反応が生じたため、すくみの減少は嫌悪記憶の形成を妨げませんでした（図S1）。 これらの結果は、LDTg ニューロンの活動が恐怖の凍りつきの発現には必要であるが、嫌悪事象の記憶形成には必要ではないことを示しています。

a 左パネル:野生型マウスに、LDTg中のAAV-hsyn-hM4-mCherryを注射した。 顕微鏡画像は、参考文献 [25] の冠状 LDTg 解剖学的構造とは対照的に、正しい注射部位で赤色蛍光を示しています。 3 週間後、LDTghM4 マウスに生理食塩水または CNO を 30 分注射し、その後 3 回足部電気ショックを与えました。 中央のパネル: テスト中のマウスの活動を示す代表的なトレース。 右パネル：生理食塩水と比較して、CNOで治療したマウスでは足の電気ショックに対するすくみ反応が減少する。 点は、0 ～ 3 分、3 ～ 4 分、4 ～ 5 分、および 5 ～ 6 分の時間間隔での凍結に費やした時間の平均 ± SEM パーセンテージを表します。 相互作用処理 × ショック F (3, 111) = 10.12; 二元配置分散分析とそれに続くシダックの比較検定を繰り返し測定、***P < 0.001)。 b オープンフィールドでの運動活動は、LDTg 阻害の影響を受けませんでした (P = 0.1072、t 検定)。 c 不安レベルは O 迷路テストでは影響を受けませんでした (P = 0.3741、t テスト)。 d 疼痛感受性は、Hargreaves テストでは影響を受けませんでした (P = 0.7339、t テスト)。 e 野生型マウスに、LDTg中のAAV-hsyn-DIO-hM4-mCherryおよびVTA中のCAV-2-CREを注射した。 VTA への LDTg 投影の化学遺伝学的サイレンシングにより、凍結が減少します。 相互作用処理 × ショック F (3, 63) = 11.56; 二元配置分散分析とそれに続くシダックの比較検定を繰り返し測定、***P < 0.001)。 f VTA への LDTg 投影の過剰活性化により、フリーズが増加します。 ｈＭ４（Ｇｉ共役、抑制性）をｈＭ３（Ｇｑ共役、興奮性）に置き換えた以外は、「ｅ」と同じ注射。 マウスにショックを与えたのは 2 回だけで、最後のショックを与えてから 10 分後にすくみ反応を 5 分間測定しました。 マウスがすくむのに費やした時間の割合（***P < 0.001、マン・ホイットニー検定）。

LDTg とすくみを結び付ける回路を解明するために、我々は、すくみ反応の制御に古典的に関連している 2 つの領域である腹側外側水道周囲灰白質 (vlPAG) と扁桃体中央部 (CeA) への LDTg 投影の投影特異的化学遺伝学的操作を行った [11, 37]。 ]。 したがって、vlPAGまたはCeAのいずれかに逆行性CAV-2-Creを注入し、LDTgにCre依存性阻害性DREADD（AAV-hSyn-DIO-hM4D-mCherry）を注入して、LDTg→vlPAGまたはLDTg→CeA投影を独立して操作しました。 CeAおよびvlPAG内のLDTgおよび赤色線維のmCherry陽性ニューロンを観察したため、免疫組織蛍光によってこのアプローチを検証しました（それぞれ図S2a、b）。 LDTg→vlPAGまたはLDTg→CeA投影をサイレンシングしても、生理食塩水またはCNOのいずれかを投与されたマウスと同様のすくみ反応は変化しませんでした（それぞれ図S2a、b）。 次に、嫌悪処理における VTA への関心の高まり [38、39]、および LDTg から生じる密な投影 [40、41、42、43] を考慮して、この経路がすくみ行動に関与している可能性があると仮説を立てました。 実際、LDTg→VTA投影のサイレンシングは、凍結応答の大幅な下方シフトを引き起こし（図1e）、完全なLDTgサイレンシングで得られた結果（図1a）に似ていました。 この結果を考慮して、この経路の活性化により、軽度の嫌悪チャレンジに対する恐怖反応が悪化する可能性があると仮説を立てました。 したがって、マウスを2回の足にショックを与えただけでLDTg→VTA投影を刺激するために、興奮性DREADD（AAV-hSyn-DIO-hM3D-mCherry）を使用しました。 CNOを注射したマウスは強いすくみ反応を示し、軽度のストレス負荷がLDTg→VTA投影を刺激したことを示しました（図1f）。 これらの結果は、感電を嫌う処理に対するディスクリート LDTg 回路の特異性を示しています。

どの LDTg 細胞タイプがすくみ応答の制御に関与しているかを評価するために、各ニューロン集団を個別に沈黙させました。 したがって、Cre依存性AAV-hSyn-DIO-hM4-mCherryをvGlut2-Cre、ChAT-Cre、またはvGAT-Creトランスジェニックマウス系統に注入し、それぞれグルタミン酸、コリン作動性、またはGABA作動性ニューロンの選択的操作を可能にしました。 CNO処理したLDTgGluT-hM4マウスおよびLDTgChAT-hM4マウスの電気ショックによって誘発された恐怖反応は、生理食塩水処理した対照のそれに匹敵しました（それぞれ図2a、b）。 驚くべき対照的に、CNOを注射したLDTgGABA-hM4マウスではすくみが著しく減少し（図2c右パネル）、これは電気ショック誘発すくみ反応におけるLDTg GABA作動性伝達の重要な役割を正確に示している。

a グルタミン酸作動性 LDTg ニューロンをサイレンシングしても、フリーズは変化しません。 vGluT2-cre マウスは、LDTg 中の AAV-hsyn-DIO-hM4-mCherry を注射され、その後凍結パラダイムを受けました。 顕微鏡画像は、注射部位での mCherry 発現を示しています。 各間隔でマウスがすくむのに費やした時間の割合（図 1 と同じ）（相互作用処理 × ショック F (3, 78) = 0.4895; 反復測定二元配置分散分析とそれに続く Sidak の比較検定、P = 0.6906）。 b コリン作動性 LDTg ニューロンをサイレンシングしても、フリーズは変化しません。 マウスがChAT-creであること以外は上記と同じ（相互作用処理×ショックF(3,87)=0.4895；反復測定二元配置分散分析とそれに続くSidakの比較検定、P=0.6117）。 c GABA作動性LDTgニューロンをサイレンシングすると、すくみが軽減されます。 マウスがvGAT-creであったこと以外は上記と同じ（相互作用処理×ショックF(3,114)＝5.646；反復測定二元配置分散分析とそれに続くSidakの比較検定、**P<0.01；***P<0.001）。

以前の結果は、GABA作動性LDTgニューロンまたはLDTg→VTA投影のいずれかの独立したサイレンシングが、誘発されたすくみ反応を弱めるのに十分であることを示した。 VTAに投射するLDTg GABAニューロンがこのプロセスの鍵であるかどうかをテストするために、次に、二重交差戦略を使用して神経伝達物質および投射に特異的な方法でLDTgを操作しました。 まず、vGAT-CreマウスのVTAに、Cre依存的にフリッパーゼ（flp）の発現を可能にする逆行性AAV-DIO-flpを注射しました（つまり、GABA作動性LDTg→VTAニューロン）。 次に、フリッパーゼ依存性阻害性 DREADD (AAV-hSyn-FRT-hM4-mCherry) を LDTg に注入しました。 生理食塩水で処理したLDTgGABA→VTA-hM4マウスは正常なすくみ反応を示しましたが、CNOで処理したマウスはすくみ曲線の有意な下方シフトを示しました（図3a）。 これは、恐怖反応に対するこの GABA 作動性投影の重要な規制的役割の強力な証拠を提供します。

a VTA への GABAergic LDTg 投影をサイレンシングすると、フリーズが軽減されます。 左パネル：vGAT-cre マウスに LDTg 中の AAV-hsyn-FRT-hM4-mCherry と VTA 中の逆行性 DIO-flp を注射し、その後図 1 と同じプロトコールに従いました。顕微鏡画像は mCherry 発現細胞体（注射部位）を示しています。 VTA のファイバー。 中央のパネル: テスト中のマウスの活動を示す代表的な痕跡。 右パネル: 各間隔でマウスがフリーズするのに費やした時間の割合。 相互作用処理 × ショック F (3, 90) = 3.088; 二元配置分散分析とそれに続く Sidak の比較検定を繰り返し測定、**P < 0.01)。 b VTA への GABA 作動性 LDTg 投射は、急性ストレスによって感作されます。 左パネル: vGAT-cre マウスに VTA 中の逆行性 AAV-FLEX-tdTomato を注射し、その後 3 回のショック (ストレスあり) またはショックなし (ナイーブ) のいずれかを与えました。 中段左パネル：透過光（上）または赤色蛍光（下）によりLDTg内のVTAに投影しているGABA作動性細胞の顕微鏡画像。 中右のパネル: 各条件における 40 pA の電流注入に対する応答の代表的な電圧トレース。 右パネル：対照マウスまたはストレスを受けたマウスにおけるVTAに投射するLDTg GABA作動性ニューロンの興奮性プロファイル。 プロットは、電流注入ステップを増加させた後の活動電位周波数を示しています。 相互作用処理 × 現在の F (4, 144) = 1.866); 治療係数 F (1, 36) = 5.082; 二元配置分散分析とそれに続く Sidak の比較検定を繰り返し測定、*P < 0.05)。

嫌悪感のある足へのショックにさらされると、恐怖反応を促進するために、LDTg→VTA GABA作動性ニューロンの細胞特性が変化する可能性がありますか? ウイルスタグ付きLDTg→VTA GABA作動性ニューロンにおいて、ex vivo全細胞パッチクランプ記録を実施しました。 このために、vGAT-Cre マウスの VTA に逆行性 AAV-FLEX-tdTomato を注射しました (図 3b)。 行動試験で説明したように、マウスに 3 回連続して足への電気ショックを与え、その直後に記録しました。 対照マウスは足へのショックを受けずにチャンバーに曝露された。 足へのショックへの曝露は、ショックを受けていないマウスと比較した場合、脱分極電流注入に対するより高い放電頻度によって証明される、GABA作動性LDTg→VTAニューロンの興奮性の増加を引き起こした（図3b、右パネル）。 重要なことに、この適応は、膜抵抗、膜容量、静止膜電位などの細胞の受動膜特性に対する有意な影響を伴っていませんでした（図S3a、b、c）。 電気ショックが他のLDTg細胞タイプの活性を変えることができるかどうかをテストするために、同じ手順をChAT-CreおよびvGluT2-Creマウスに​​適用し、コリン作動性およびグルタミン酸作動性のLDTg→VTAニューロンを記録しました。 LDTg GABAニューロンの投射について観察したものとは対照的に、電気ショックはVTAに投射するコリン作動性およびグルタミン酸作動性ニューロンの興奮性プロファイルを変更できませんでした（補足図5a）。 ただし、GABA作動性LDTgニューロンの投影はVTAだけを標的とするわけではありません。 したがって、我々は最後に、電気ショックが標的の脳領域とは無関係にGABA作動性ニューロンの機能を変化させることができるかどうかをテストした。 このために、vGATCre マウスの vILPAG に逆行性 AAV-FLEX-tdTomato を注射しました。 GABA作動性LDTg→VTAニューロンの感受性が向上していることがわかりましたが、GABA作動性LDTg→vlPAGニューロンの興奮性プロファイルは変化しませんでした（補足図5b）。 したがって、足へのショックは、別個の GABA 作動性 LDTg 経路の活性に影響を与えます。

これまでに収集されたデータは、電気ショックが LDTg GABA 作動性 LDTg→VTA ニューロンをプライミングすることによってフリーズを引き起こすことを示しています。 嫌悪体験なしにすくみを誘発できるかどうかをテストするために、自由に行動するマウスに選択的な光遺伝学的刺激を採用しました。 我々は、vGAT-Cre マウスの LDTg に Cre 依存性 AAV-hsyn-DIO-hChR2-YFP を注入し、VTA 上の両側に光ファイバーを移植しました。 VTAのLDTg GABA作動性末端に発現したChR2の光刺激は、嫌悪刺激がない場合に顕著なすくみを誘発するのに十分でした（図4a）。 刺激をオフにすると、マウスはすくむのを止めました。これは、動的な細胞プロセスを示しています。 重要なことに、光刺激の非存在下で24時間後にマウスを同じ状況に再曝露したとき、条件付きすくみは観察されませんでした（補足図S6a）。 さらに、定義された状況での光刺激のペアリングが条件付けされた場所嫌悪を引き起こすかどうかを評価しました。 毎日 3 回のペアリングを行い、光刺激の非存在下でマウスをテストしました。 注目すべきことに、ペアになっていないチャンバー内でのChR2マウスの移動距離は、光刺激によって不動が誘発されたペアリングされたチャンバーよりも予想どおり長かった（補足図6b）。 それにもかかわらず、コントロールマウスとChR2マウスは両方とも、プレテストセッションとテストセッション中にペアのチャンバー内で同様の時間を過ごしました（図4b）。 これは、VTA の LDTg GABA 作動性ターミナルの活性化が嫌悪記憶を生成しないことを示しています。

a VTA 内の GABA 作動性 LDTg 末端の光遺伝学的 in vivo 活性化は、自発的凍結を誘発します。 左パネル：vGAT-cre マウスに、LDTg 中の AAV-hsyn-DIO-hChR2-YFP (ChR2) または AAV-hsyn-DIO-YFP (コントロール) を注射し、VTA の上に光ファイバーを移植しました。 顕微鏡画像は、注射部位での緑色蛍光と注射部位での YFP 発現、および VTA の移植部位での光ファイバーの痕跡を伴う YFP 発現ファイバーを示しています。 中央のパネル: 実験のタイムライン。 右パネル: マウスがすくむのに費やした時間の割合を、以下の間隔で平均 ± SEM として示します (相互作用グループ × 光 F (2, 30) = 4.166; 反復測定二元配置分散分析とそれに続く Sidak の比較検定、***P < 0.001 ）。 b 対照マウスと ChR2 マウスは、対になったコンパートメントで光刺激を受けましたが、対になっていない側では光刺激を受けませんでした。 それぞれの側で 3 組のペアにした後、マウスにコンディショニング装置を自由に探索させました。 GABA作動性LDTg末端の光遺伝学的in vivo活性化は、場所嫌悪を誘発できなかった（t31 = 0.1606、P = 0.8735）。 c 麻酔をかけたマウスの心拍数の遠隔測定モニタリングを使用して、ChR2 マウスの光刺激は、レーザーをオンにしたときに対照動物では観察されなかった徐脈を誘発しました（t7 = 1.128、 P = 0.2966 対照; t12 = 5.191、 P < 0.001 ChR2）。

光遺伝学的刺激が無条件のすくみを引き起こしたのか、それとも純粋に運動停止を引き起こしたのかを区別するために、心拍数の遠隔測定を実行しました。 これは、心臓機能と身体活動の混乱を避けるために、麻酔をかけたマウスで行われました。 ChR2マウスにおける光刺激は、対照マウスでは観察されなかった有意な心拍数の低下（すなわち、徐脈）をもたらした（図4c）。 全体として、この光遺伝学実験は、無条件すくみの 2 つの特徴、つまり不動と徐脈を模倣しています。 それにもかかわらず、この介入は恐怖記憶を引き起こさず、すくみは運動活動の停止を含むさまざまな生理学的反応の合計であるため、この人工回路の動員は脅威的な刺激に対する感情的反応を完全には再現していない可能性があると推測しています。

いくつかの研究では、条件付きすくみ反応の形成に VTA が関与しているとされていますが [44、45]、脅威に対する無条件の即時すくみにおける VTA の役割やその出力ターゲットは不明です。 LDTg GABAの凍結反応を媒介する回路を理解するために、以前と同様にVTA上のLDTg GABA線維の光遺伝学的刺激を使用し、光刺激の90分後にマウスを屠殺し、cFos発現の脳マッピングを実施しました（図5a）。 私たちは、すくみに主要な役割を果たすことが知られている 2 つの脳構造、扁桃体 [11] と外側中隔 [46] に分析を絞り込みました。 VTA の主要なターゲットとして、また運動反応における VTA の役割を考慮して、側坐核 (NAc) の反応性も分析しました。 VTA内のLDTg GABA末端の活性化は、扁桃体と外側中隔の両方で顕著な活性化を誘発しましたが、NAcでは誘発しませんでした（それぞれ図5b、cおよび補足図7a、b）。

a 実験タイムライン（左パネル）に示すように、対照およびvGAT-Cre ChR2マウスを光刺激の90分後に屠殺した。 cFos陽性ニューロンを、(b)側底扁桃体および中央扁桃体(それぞれBLAおよびCeA)、(c)外側中隔の背側部分および腹側部分(それぞれLSDおよびLSV)で計数した。 d WT マウスでは、BLA への VTA 投影の化学遺伝学的サイレンシング (相互作用治療 × ショック F (3, 51) = 3.604; 反復測定二元配置分散分析とそれに続く Sidak の比較検定、** P < 0.01) により、すくみが軽減されます。 e LSへのVTA投影の化学遺伝学的サイレンシングは、すくみ行動を変更しません（相互作用処理×ショックF（3、66）= 0.3606;反復測定二元配置分散分析とそれに続くSidakの比較検定、P = 0.7817）。 *P < 0.05; **P < 0.01。

これらの結果を考慮して、次に、VTA→BLAまたはVTA→LS投影の調節が凍結反応に影響を与えるかどうかをテストしました。 交差ウイルス戦略を使用して、VTA→BLA（図5d）またはVTA→LS（図5e）ニューロンで抑制性DREADDを発現し、マウスを電気足ショックに曝露しました。 すくみの有意な減少は、VTA→BLA投影をサイレンシングした場合にのみ観察され、VTA→LS経路では観察されませんでした（それぞれ図5d、e）。 これらの結果は、すくみ反応における個別の VTA ターゲットの特異性を示しています。

LDTg GABA作動性ニューロンはVTA→BLA投射ニューロンを直接調節するのでしょうか、それともVTA微小回路に侵入するのでしょうか？ この仮説を検証するために、「方法」で説明したように、この LDTg 阻害入力と 3 つの VTA 細胞型 (つまり、GABA、DA、および Glu ニューロン) および VTA 投射ニューロンの間の機能的接続を調べました。 LDTg末端の光刺激後、細胞の24％（7/29）がVTA→BLA投影ニューロンと接続していることがわかりました（補足図8a）。 顕著な対照的に、VTA GABA細胞の91％（20/22）はLDTgからGABA入力を受け取りました（補足図8b）。 これらの外向き電流はピクロトキシンによってブロックされ、この応答がGABA-A受容体を介したものであることを示しています（補足図8f）。 また、GABA作動性LDTgニューロンは、推定上のVTA DAニューロンの95%(19/20)と機能的接触を行った。 代わりに、VTA Gluニューロンの33％（7/21）のみがLDTgからGABA入力を受け取りました（補足図6d）。 接続された細胞の中で、光抑制性シナプス後電流（oIPSC）の振幅は、VTA Glu細胞またはVTA→BLA投影ニューロンと比較した場合、VTA GABAおよびDAニューロンで大きかった（補足図6e）。 この最初のデータセットは、突出するマイクロ回路よりも VTA マイクロ回路との機能的接続がより顕著であり、DA および GABA VTA ニューロンが優先されることを示しています。

接続性分析の結果は、GABA作動性LDTg→VTAニューロンのサイレンシングがVTA GABA作動性またはDAニューロンの活性を優先的に調節するはずであることを示唆しています。 この可能性をテストし、VTA機能に対するLDTg制御のより包括的な見解を得るために、GABA作動性LDTg→VTA投影をサイレンシングしながら、麻酔をかけた動物でin vivo記録を実行しました（図6a）。 生理食塩水で処理したマウスでは、推定上のGABA作動性VTAニューロンは、以前の報告[34、35、36]と同様の古典的な活動の発火パターンを示した(図6b)。 対照的に、CNO処理マウスは、推定上のVTA GABAニューロンの発火率分布の強い左方向のシフトを示し、活性の顕著な低下を反映しました（図6b）。 GABA作動性LDTg→VTA経路のサイレンシングがVTAホメオスタシスに広範な影響を与えるかどうかを判断するために、VTA DAニューロンの活動をさらにin vivoで記録しました。 VTA DA ニューロンの発火率分布（図 6c）、バースト活動および発火パターンの 4 つの主要モード [47] は、生理食塩水処理グループと CNO 処理グループの間で差異がありませんでした（補足図 9）。

a 麻酔をかけた LDTgGABA→VTA-hM4 マウスの VTA で in vivo 記録を実行し、生理食塩水または CNO の全身投与時に推定 VTA GABA または DA ニューロンの活性を分析しました。 推定上の VTA GABA (b) および VTA DA ニューロン (c) の発火率の累積確率分布と発火頻度 (挿入図) が示されています。 各実験条件の代表的なトレースが表示されます。 VTA への LDTg GABA 作動性入力のサイレンシングは、VTA DA 発火を変えることなく、VTA GABA ニューロンの活動を選択的に低下させます。 **P < 0.01 マン・ホイットニー検定。 d vGATCre マウスには、VTA に AAV-hSyn-FRT-hM4-mCherry を、BLA にレトロ AAV-DIO-Flp を注射し、その後凍結パラダイムを実施しました。 顕微鏡画像は、VTA 注射部位における mCherry 発現を示しています。 GABA作動性VTA→BLAニューロンの選択的サイレンシングは、すくみ反応を減少させた（相互作用治療×ショックF（3、45）= 4.947;反復測定二元配置分散分析とそれに続くSidakの比較検定、**P < 0.01。

VTA GABA ニューロンは長距離ニューロンであることも、局所的な接続を介して VTA 機能を調節することもできます [34、35、48、49、50]。 この問題を解決するために、私たちは、扁桃体に凍結関連情報を伝える神経伝達物質の性質を特定しようと努めました。 そこで我々は、マウスに電気足ショックを与えてすくみを誘発しながら、投射特異的および神経伝達物質特異的な方法でDA、Glu、GABA VTA→BLAニューロンを沈黙させた。 GABA作動性VTA→BLAのサイレンシングのみが、DAまたはGluニューロンのすくみを減少させなかった（それぞれ図6d、補足図10a、b）。

全体として、このデータセットは、LDTgからVTA GABA機能への抑制入力を結び付け、嫌悪処理中のLDTg-VTA-扁桃体マクロ回路の協調反応の証拠を提供します（補足図11）。

すくみ反応をサポートする脳領域の多くが特定されていますが、調節部位がこの配線された足場に与える役割は不明です。 私たちの結果は、嫌悪体験がどのように細胞の急速な変化を引き起こし、最終的に防御行動につながるかを理解するための新しい枠組みを提供します。 今回我々は、差し迫った危険に反応してすくみ行動を発現させるためには、VTAへのLDTg GABA作動性入力の活性が必要であることを示す。 この突起の光遺伝学的刺激は、脅威のない状態での凍結と扁桃体基質の補充を促進するのに十分です。 私たちの研究は、脅威に対する適応防御行動におけるこの経路の未発見の役割を実証し、ストレス対処回路に関する新たな洞察を提供します。

脳の防御ネットワークには、防御反応をタイムリーに駆動するための脅威の検出と処理に不可欠な、相互接続されたいくつかの皮質および皮質下の領域が含まれています[37、51、52]。 ヒトにおける機能画像研究とげっ歯類における広範な分子、細胞および回路の解剖により、扁桃体、水道周囲灰白質および前頭前皮質が、すくみを含む恐怖反応を制御する中核的なアクチュエーターであることが判明した。 膨大な量の証拠が、条件付きすくみ反応を支配するマクロ回路および局所回路の確固たる根拠を提供している[11]が、無条件すくみ行動を誘発する細胞機構と一連のイベントの詳細な理解はまだ不足している。 脅威関連障害の症状と病因は学習された恐怖反応と生得的な恐怖反応の両方に依存しているため、これは非常に関連性があります[10、53]。 私たちの研究では、電気足ショックが VTA への抑制性 LDTg 投射ニューロンの興奮性の即時増加を引き起こすことを実証します。 この特定の投射のサイレンシングは、VTA DA 細胞の発火を変えることなく、VTA GABA 作動性ニューロンの機能に選択的な影響を与えます。 さらに、我々はVTAの出力を分析し、扁桃体へのVTA GABA作動性投射のサイレンシングが足の衝撃に対する無条件のすくみ反応を弱めることを観察した。 最近の研究では、扁桃体の VTA DA 末端の選択的な光遺伝学的阻害は嫌悪記憶の獲得を妨げたが、足へのショックに対する無条件のすくみには影響を与えなかった [54]。 これは、扁桃体神経伝達物質集団に対する異なる VTA が、無条件および条件付きのすくみに寄与していることを示唆しています。

防御反応における VTA の役割を裏付ける 2 つの最近の報告では、VTA GABA とグルタミン酸作動性ニューロンが生得的な防御行動と関連付けられています [48、55]。 実際、捕食者の臭気や迫り来る刺激への曝露は、逃避行動に関連する VTA グルタミン酸ニューロンの一過性の活性化を誘発しました [55]。 また、迫り来る誘発性逃避行動の開始は、VTA GABA ニューロンにおける Ca2+ 過渡現象と相関していた [48]。 私たちの研究によれば、著者らは、この世界的なニューロン集団への直接的な光遺伝学的刺激により、すくみの後に巣への飛行行動が引き起こされたと報告した。 これは、逃走防御行動における VTA の新たな役割を明らかに示しています。 しかし、VTA ニューロンは足への衝撃に反応することが示されている [34] が、急速な恐怖反応の誘発に VTA ニューロンが関与していることは明らかになっていない。 今回我々は、橋領域からのGABA入力のみを調節することによってすくみが誘発されることを示し、防御反応におけるVTAの役割を広げた。 正および負の価数における VTA の役割を扱う研究は、これまで VTA DA ニューロンの役割に焦点を当ててきました。 ここで、私たちが行った実験では、このニューロン集団を関与させることはできませんでしたが、長距離 VTA GABA 作動性ニューロンの役割を特定しました。 これは、VTA DA ニューロンと同様に、GABA 作動性長距離ニューロンは、モルヒネの調節に至るまでの行動反応のさまざまな側面を駆動するために、少なくとも部分的に、異なる環境刺激と内部要求を計算する分離されたニューロン集団として現れる可能性が高いことを示唆しています。報酬特性、連想学習と無条件フリーズ（現在の研究）[49、56、57]。

全体として、我々が明らかにした脳防御行動のマクロおよびマイクロ回路において、1つの推定モデルは、電気ショックがGABA作動性LDTgニューロンを活性化し、局所VTAニューロン、推定GABAの調節を介してVTA→BLAニューロンの脱抑制を引き起こすというものである[50]。 。

複雑で急速に進化する環境をナビゲートするには、哺乳類は有害な状況を回避しながら重要な資源にアクセスできるように行動を適応させなければなりません。 これらの行動反応は、やりがいのある課題や嫌悪感のある課題に直面したとき、迅速かつ永続的な細胞適応によって微調整されます[58]。 この恒常性バランスの調節不全は、不適切な選択につながり、精神疾患を発症するリスクを高めます[59]。 歴史的に、LDTg-VTA 軸は報酬の処理と強化と深く結びついています [60、61]。 LDTg は、VTA ドーパミン発火活性、ひいては前脳ドーパミン放出の重要なモジュレーターです [20、62、63]。 薬理学的および病変の研究は、報酬価値を刺激に帰属させ、コカインやニコチンなどの依存性物質に対するいくつかの細胞および行動の適応を媒介するという重要な役割を強調している[64]。 投影特異的操作により、食欲を動機付け、報酬を与える行動へのその寄与が明らかになり[16、43]、これらのプロセスに対するコリン作動性およびグルタミン酸作動性のLDTg投影の明確な寄与が明らかになった[42]。 実際、LDTg グルタミン酸作動性またはコリン作動性終末の VTA における選択的光遺伝学的刺激は、費やした時間と刺激対のチャンバーへの侵入の数に反映され、やりがいがあります [42]。 最近の証拠は、コカイン探索行動の復活における VTA への GABA 作動性入力の部分的な関与を指摘しています [65]。 LDTg-VTA 軸が肯定的な刺激の処理に関与していることのこれらの確かな証拠にもかかわらず、我々の現在の研究はこの受け入れられている見解に疑問を投げかけ、当面の嫌悪課題の処理における VTA への LDTg 抑制入力の因果関係を実証しています。 我々の結果は、局所LDTg介在ニューロンの光遺伝学的操作が、嗅覚の合図によって誘発される生得的な恐怖に影響を与えることを示す証拠によって裏付けられている[21]。 これは、LDTg 出力に影響を与え、ここで特定された LDTg-VTA 軸を含む下流ターゲットのアクティビティを調整する可能性があります。 また、私たちの以前の研究では、社会的攻撃に続く VTA ドーパミン ニューロンへの LDTg コリン作動性入力の過剰活性化がうつ病のような症状の出現を引き起こすことを実証しました [20]。 より最近では、ニューロン由来の栄養分子であるニューレグリン-1が、慢性的な社会的敗北ストレス後にLDTgで増加し、VTA DAニューロンの活動に影響を与えることによってうつ病様の行動を促進することが示されています[66]。 最後に、子宮内でストレスホルモンであるグルココルチコイドに曝露すると、意欲の欠如が誘発されますが、これはLDTg-VTAの投影を調節することで対処できます[67]。 まとめると、これは、報酬または嫌悪のいずれかにかかわらず、顕著な環境刺激が LDTg ニューロンの独立した集団をリクルートするであろうこと、および肯定的ネットワークと否定的ネットワークの初期の分極化は過度の単純化であったことを示唆しています [68]。 したがって、コリン作動性/グルタミン酸作動性およびGABA作動性のLDTgニューロンは、VTAへの投影を介して、それぞれアプローチまたは防御を促進する、相補的な動機付け状態をコードしている可能性があります。 アプローチと防御反応には、運動中枢の調整された関与が必要です。 特に、脳幹の密接に関連した中枢である脚橋核 (PPN) は、ほとんどの大脳基底核核、特に黒質 (SN) に上行投射を送り、運動反応を制御します [23]。 たとえば、SN 内の PPN コリン作動性終末の光遺伝学的活性化により、運動量が増加します [17]。 最近の bioRxiv の報告では、GABA 作動性 PPN ニューロンが SN DA ニューロンにシナプスを形成し、その活性化により探索的移動が損なわれ、運動の開始が停止されるが、すくみ反応は生じなかったことが示されている [69]。 全体として、LDTg と PPN からそれぞれ VTA と SN への明確な GABA 作動性投射は、恐怖と運動反応を引き起こす相補的な信号を伝達する可能性があります。 足の衝撃などの嫌悪刺激に応答するPPN→SN GABA作動性経路の潜在的な役割と、これらの平行な脳幹投射間の推定上のクロストークを理解するには、今後の研究が必要である。

ここで説明したような調節領域を明らかにすることは、脅威の刺激に対する自然な反応を理解するために最も重要です。 重要なのは、ここで特定された経路は無条件のすくみの誘発に限定されており、嫌悪性の記憶形成を引き起こさなかったということである。 さらに、これらの回路におけるシナプスおよび細胞の適応を理解することは、病的状態の症状に寄与する根本的なメカニズムを理解するのに役立つ可能性があります。 今後の研究では、これらの回路を古典的な薬理学的薬物で標的とするために、これらの回路（異常）適応を引き起こす分子アクチュエーターを特定する必要があるだろう。 あるいは、脳調節技術を含む将来の治療アプローチは、現在の発見を活用できるかもしれません。

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CAV-2-Cre を提供してくださった EJ Kremer と Plateforme de Vectorologie de Montpellier に感謝します。 いくつかのフリッパーゼ依存性ウイルスを提供してくださった Jean-Charles Paterna 氏と Melanie Rauch 氏、およびチューリッヒ ベクター コア施設に感謝します。 vGAT-Cre マウスを提供してくださった Massimo Mantegazza 博士に感謝します。 技術的なサポートをしていただいた動物施設のスタッフの皆様に感謝いたします。

この研究は、国立科学研究センター（CNRS）、コートダジュール大学、ラベックス・シグナライフ、セルヴォー研究連盟、ロータリー・エスポワール・アン・テテ、医学研究財団（FRM）の支援を受けた。 DEQ20180339159) および国立研究機関 (ANR-20-CE37-0017) を JB に送信します。 LB は博士号を取得しています。 ＦＲＭからのフェローシップと博士課程４年生。 FRM からのフェローシップ (FDT201904007874)。 TC は博士号を取得した 4 年生です。 FRM からのフェローシップ (FDT202106012968)。 LR は博士号を取得しています。 ＦＲＭからのフェローシップ。

Loïc Broussot、Thomas Contesse などの著者も同様に貢献しました。

この作品は、Sebastian P. Fernandez、Jacques Barik の著者が共同で監修しました。

コートダジュール大学、ニース、フランス

ロイック・ブルソ、トーマ・コンテス、ルナン・コスタ＝カンポス、リア・ロヨン、ウーゴ・フォフォ、セバスチャン・P・フェルナンデス、ジャック・バリック

CNRS UMR7275、分子細胞薬理学研究所、ヴァルボンヌ、フランス

ロイック・ブルソ、トーマ・コンテス、ルナン・コスタ＝カンポス、リア・ロヨン、ウーゴ・フォフォ、トーマス・ロリヴェル、セバスチャン・P・フェルナンデス、ジャック・バリック

CNRS、IMN、UMR 5293、ボルドー大学、ボルドー、フランス

クリステル・グランジェタス & フランソワ・ジョルジュ

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LB、TC、LR は行動実験を行いました。 LB、TC、HF は顕微鏡検査を実施しました。 SPF と RCC は ex vivo 記録を実行しました。 CG と FG は生体内電気生理学的記録を実施しました。 TL は行動分析の技術サポートを提供しました。 LB、SPF、JB がプロジェクトを設計し、論文を書きました。 著者全員が論文執筆に関してフィードバックを提供してくれました。

Sebastian P. Fernandez または Jacques Barik との通信。

著者らは競合する利害関係を宣言していません。

発行者注記 Springer Nature は、発行された地図および所属機関の管轄権の主張に関して中立を保っています。

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転載と許可

Broussot, L.、Contesse, T.、Costa-Campos, R. 他 VTA への非標準的な GABA 作動性経路は、無条件の凍結を促進します。 モル精神医学 27、4905–4917 (2022)。 https://doi.org/10.1038/s41380-022-01765-7

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受信日: 2021 年 5 月 31 日

改訂日: 2022 年 8 月 9 日

受理日: 2022 年 8 月 22 日

公開日: 2022 年 9 月 20 日

発行日：2022年12月

DOI: https://doi.org/10.1038/s41380-022-01765-7

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