脳

Nature Communications volume 13、記事番号: 3417 (2022) この記事を引用

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210 オルトメトリック

メトリクスの詳細

脳の配線図を理解することが基本的に重要であるにもかかわらず、外傷性脳損傷によってニューロンの接続がどのように再配線されるかについての知識は依然として著しく不完全です。 今回我々は、細胞分解能の全脳イメージングを用いて、外傷性脳損傷のマウスモデルにおいて抑制性ニューロンへの入力の脳全体のマップを生成した。 私たちは、ソマトスタチン介在ニューロンが、直接損傷を受けていない領域であっても、ローカルネットワーク接続が充実しているものの、長距離入力が減少している、複数の脳領域でハイパーコネクトされたハブに変換されていることを発見しました。 長距離入力の損失は、離れた脳領域での細胞の損失とは相関しません。 損傷部位に移植された介在ニューロンは、同所性の局所的かつ長距離の入力を受け取り、遠隔接続を確立するための機構が重度の損傷後でも無傷のままであることを示唆しています。 私たちの結果は、脳全体の抑制性ニューロンへの直接入力の空間的再構成を伴う、外傷性脳損傷後の抑制を維持し最適化する潜在的な戦略を明らかにしました。

脳の機能は、ローカルネットワークの入力と出力を制御する非常に多様な抑制性介在ニューロンのグループに依存しています1、2、3。 大脳皮質では、介在ニューロンの最大集団の 1 つが神経ペプチドであるソマトスタチン (SST) を発現しています 4,5,6。 これらの細胞は樹状突起を阻害し、それによって局所の主要なニューロンへのグルタミン酸作動性入力の統合を調節します。 これにより、シナプス可塑性、学習、記憶の形成において独自の役割が与えられます7、8、9、10、11、12、13、14。 しかし、SST 介在ニューロンは脳損傷後の細胞死に対して最も脆弱なものの 1 つであり、その喪失はてんかん、外傷性脳損傷 (TBI)、およびアルツハイマー病の実験モデルで十分に実証されています 15、16、17、18、19。人間の場合20,21。 海馬では、生き残ったSST介在ニューロンはさらに興奮性の駆動を受け、グルタミン酸作動性ニューロン上に新しい抑制性シナプスを形成し、通常は占有しない領域にまで成長します22、23、24、25。 この局所回路再配線のパターンは、脳の損傷によって介在ニューロンの接続がより大規模に再編成されるかどうかという疑問を引き起こします。

この可能性に公平な方法で対処するために、我々は逆行性単シナプス狂犬病ウイルスシステムを利用し、全脳組織除去技術を強化して、局所性外傷性脳損傷のマウスモデルにおけるSST介在ニューロンへの直接入力の脳全体のマップを作成した。 われわれは、損傷部位における海馬SST介在ニューロンへの局所的入力と長距離入力の両方に劇的な量的差異があることを発見した。 ただし、遠方の入力領域自体内ではニューロンの損失はなく、スターター ニューロンをターゲットとするニューロン サブタイプの割合は安定していました。 驚いたことに、我々は、海馬と双方向に相互作用する前頭前皮質（PFC）の損傷から遠く離れた場所で、同様の回路再構成のパターンを発見した26が、最初の損傷によって直接損傷を受けなかった。 損傷した海馬に移植された介在ニューロン前駆細胞は、適切な長距離接続を確立することに成功した。 ただし、移植片由来の介在ニューロンは、外傷性脳損傷後に見られる強化された局所入力を保持していました。 したがって、我々の実験は、脳損傷後の大規模な回路リモデリングに関する新たな洞察を提供し、脳損傷は、たとえ局所的に制限されている場合でも、これまで認識されていたよりも脳全体の神経回路機能にはるかに広範な影響を与えることを示唆しています。

局所ネットワーク活動と記憶の形成におけるそれらの重要な役割にもかかわらず、歯状回における SST 介在ニューロンへの脳全体への正確な入力は体系的に定義されていません。 我々はまず、ほぼすべての SST 介在ニューロンを GFP27 で標識するレポーター マウスを使用して、外傷性脳損傷後の慢性期の SST+ ニューロン密度を定量しました。 P60で若年成体マウスに片側制御皮質衝撃（CCI）損傷（衝撃深さ1.0 mm、衝撃深さ3.5 m s-1、持続時間500 ms）を与え、8週間後に動物を免疫染色のために処理した。 この期間は、長期的な神経病理学と行動表現型が十分に確立されている時期に相当します。 すべての脳損傷マウスにおいて、損傷は新皮質の厚さを貫通する空洞で構成され、海馬の主要な細胞層の大幅な歪みと薄化が含まれていました（図1a）。 我々は、以前の研究で報告されたSST介在ニューロンの短期間の損失と一致して、門部のGFP +細胞の約65％の減少を観察しました（図1b;補足データ1）。

外傷性脳損傷から 8 週間後の冠状切片は、SST-GFP (緑色) と DAPI (マゼンタ) でラベル付けされています。 h、肺門。 gcl、顆粒細胞層。 ml、分子層。 n = 5 TBI マウスからの代表的な動物 b 損傷を受けていない対照動物および脳損傷動物における SST-GFP 介在ニューロンの定量化。 ***P = 1.62E-06、同側の無傷対照対同側外傷性脳損傷、***P = 1.31E-05、対側性外傷性脳損傷対同側性外傷性脳損傷。 Tukey の事後検定による二元配置分散分析、n = 6 匹の無傷マウスと 5 匹の TBI マウス。 c. 2 つのウイルスの実験的逆行性追跡戦略を示す概略図。 d、e 無傷の対照（d）およびCCI損傷動物（e）の歯状回は、DAPI（青）、AAVヘルパーウイルス（緑）、およびRVΔG-mCherry（マゼンタ）で標識されています。 n = 4 匹の無傷マウスと 2 匹の TBI マウスからの代表的な動物。 f. AAV ヘルパー ウイルス (緑色) とソマトスタチン (マゼンタ) がラベル付けされた歯状回の冠状断面。 n = 3 匹の無傷のマウスからの代表的な動物。 g AAVヘルパーウイルスで標識されたニューロンにおけるSST発現の定量。 n = 3 匹のマウス。 h 海馬における二重色標識スターター細胞の分布。 4 匹の無傷対照からの n = 73 細胞、外傷性脳損傷 2 匹の動物からの n = 23 細胞。 エラーバー、標準誤差。 スケールバー、1 mm (a、左)、100 μm (a、右、d および e)、および 50 μm (f)。 補足図も参照してください。 1、2、および補足データ 1. ソース データは、ソース データ ファイルとして提供されます。

慢性的に損傷した脳のSST介在ニューロンへの単シナプス入力をラベルするために、遺伝的に制限された2ウイルスアプローチを使用して、それらの推定入力を解剖学的に明らかにしました（図1c〜e）。 まず、外傷性脳損傷の 4 週間後に、成体 SST-Cre マウスの歯状回に Cre 依存性ヘルパー ウイルス (AAV8-hSyn-FLEX-TVA-P2A-eGFP-2A-oG) を注射しました。 このヘルパー ウイルスは、EnvA でコーティングされた狂犬病ウイルスが Cre 陽性ニューロンのみに侵入できるようにする受容体と、狂犬病ウイルスが単シナプス入力ニューロンに逆行的に移動するための糖タンパク質を提供します。 3週間後、mCherryをコードするG欠失およびEnvA偽型狂犬病ウイルスを同じ場所に注射しました（RVΔG-mCherry）。 歯状回の SST+ 介在ニューロンは門部のみに存在するため、ウイルス注入の対象はこの領域でした。 7日後、注射部位（スターター細胞）で両方の蛍光レポーターに陽性であるニューロンを特定し、狂犬病ウイルスに感染したニューロンはmCherry（シナプス前入力ニューロン）でタグ付けされました。 さまざまな脳領域のかなりの数のニューロンが狂犬病ウイルスによって標識されました（補足図1）。

ウイルス標識の特異性を確認するために、注射部位で SST に対する免疫染色を実行しました。 GFP標識ニューロンの97％がSST +であることがわかりました（156個の細胞のうち152個、n = 3マウス）（図1f、g）。 ウイルスの潜在的な漏出発現を評価するために、一連の対照実験を実施しました。 Cre 組換えの依存性を確認するために、AAV8-hSyn-FLEX-TVA-P2A-eGFP-2A-oG ヘルパーおよび RVΔG-mCherry ウイルスを Cre-同腹子に注入​​しました。 脳内のどこにもニューロンは標識されていません（補足図2a）。 Cre + 動物では、GFP + ニューロンは注射部位でのみ標識され、注射部位の外側には GFP + ニューロンは見つかりませんでした（補足図 2）。 対照動物と脳損傷動物の両方で、スターター細胞はほぼ排他的に門に限定されていました（図1h、補足データ1）。 隣接する CA3 領域ではスターター細胞がたまに見つかるだけでした。 CA1、CA2、新皮質、またはその他の脳領域には GFP+ 細胞は見つかりませんでした。

次に、iDISCO+脳クリアリングと全脳ライトシートイメージングを使用して、単シナプス入力をSST介在ニューロンに送信するニューロンの全脳マップを生成しました（図2a）。 これらの技術に対する大きな課題の 1 つは、組織の深部にある入力ニューロンにアクセスすることです 28。 したがって、既存の iDISCO+ プロトコルと透過化化学の最近の進歩 29,30 に基づいて、外傷性損傷を受けた脳の深部組織の免疫標識を達成するためにクリアリング条件を変更しました。 iDISCO+ サンプル前処理とイメージング手順で 3 つの重要な改善を行いました (補足図 3)。 まず、光を吸収する未灌流の残りの血液を脱色するために、N-メチル ジエタノールアミン (MDEA) を使用した初期洗浄を組み込みました 31。 次に、免疫標識する前に、濃塩酸グアニジン溶液を使用して細胞外マトリックスを変性しました。 第三に、組織への抗体のより深い浸透を高めるために、追加の界面活性剤（3-[(3-コールアミドプロピル)ジメチルアンモニオ]-1-プロパンスルホネート、CHAPS）を抗体希釈剤に組み込みました。 これらの最適化により、一般的に行われているように脳を 2 つの別々の半球に分ける必要がなく、全脳の免疫標識が可能になりました。 イメージングから取得した生データは Allen Common Cooperative Framework (CCF) に登録され、BrainGlobe スイートのツールを使用して細胞位置に注釈が付けられ、分析されました 32,33 (補足図 4)。 予想通り、脳損傷動物ではスターターニューロンの数が減少し（対照：48.0±3.7細胞、TBI：9.4±0.9細胞、P=9.45E-06、両側t検定）、これは脳損傷動物の喪失と一致していた。 SST 介在ニューロン。 スターター細胞はほぼ排他的に肺門に限定されていた（コントロール：歯状回のスターター細胞 92.8 ± 0.96%、TBI：歯状回のスターター細胞 89.8 ± 3.2%、P = 0.3、フィッシャーの直接確率検定）。 標識されたニューロンの数は動物ごとに異なりましたが、入力ニューロンの数とスターター細胞の間には相関関係がありました（図2b）。

a 強化された iDISCO+ 脳クリアリングと全脳ライトシート イメージングのための実験デザイン。 b 全脳におけるスターター細胞とシナプス前入力ニューロンの数に関する線形回帰分析（n = 4 の無傷対照、5 匹の TBI マウス; R2 = 0.98）。 c 無傷の対照（青）および脳損傷動物（赤）の標準化アトラス空間に登録された個々の狂犬病標識細胞を示す概略冠状切片（250μm）。 1 つのドットは 1 つのニューロンを表します。 n = 4 匹の無傷対照動物と 5 匹の外傷性脳損傷動物。 略語のリストは補足データ 2 に示されています。 d 入力ニューロンから最も近いスターター ニューロン重心までのプールされたユークリッド距離を示すガウス カーネル セル密度プロット。 e. 同側海馬の外側に見られる入力ニューロンの割合 (DG、CA3、CA2、CA1)。 無傷: 39.6 ± 5.2%、n = 4 マウス。 外傷性脳損傷: 11.8 ± 2.7 %、n = 5 マウス。 **P = 1.5E-3; 両側 t 検定。 f 対側半球で見つかった入力ニューロンの割合。 無傷: 8.4 ± 0.7%、n = 4 マウス。 TBI: 3.0 ± 0.8 %、n = 5 マウス。 **P = 2.0E-3; 両側 t 検定。 g 前後軸に沿った入力ニューロンの全脳分布のガウス カーネル セル密度プロット。 灰色の陰影はプールされた集団を表し、個々の線は各動物を表します。 定量化は補足データ 3 に示されています。 h 各個別の脳領域で見つかった入力ニューロンの割合。 ***P < 1.0E-15、無傷対外傷性脳損傷 (CA1)、***P = 2.25E-04、無傷対外傷性脳損傷 (ENTm)、**P = 4.69E-03、無傷対外傷性脳損傷 (NDB); ボンフェローニの事後検定による二元配置反復測定分散分析。 n = 4 匹の無傷マウスと 5 匹の TBI マウス。 定量化は補足データ 4 に示されています。エラーバー、標準誤差。 スケールバー、1 mm (100 μm の深い免疫標識を除く)。 補足図も参照してください。 ソース データは、ソース データ ファイルとして提供されます。

狂犬病標識ニューロンの全脳マッピングにより、15の異なる脳領域からの入力が明らかになりました（図2c、補足図5、6）。 入力の大部分は、予想通り 24、34、35 、歯状回と CA3 から来ており、続いて内側嗅内皮質 (ENTm)、対角帯核 (NDB)、外側嗅内皮質 (ENTl) でした。 注目すべきことに、この入力パターンは、ENTlよりもENTmからのかなり弱い投射と乳頭核からの顕著な入力を受ける歯状顆粒細胞36,37や、非常に少ない入力を受けるCA1のSST介在ニューロンにおける以前の逆行性トレース結果とは異なります。嗅内皮質から38。 外傷性脳損傷後、狂犬病標識ニューロンのスターター細胞重心までのユークリッド距離に変化があり（図2d、補足図5）、脳損傷後に入力ニューロンがスターター細胞に実質的に近づいたことを示唆しています。

SST 介在ニューロンへの入力をより詳細に分析すると、ローカル接続のより高い割合が確認されました。 対照動物では、入力ニューロンの約 40% が海馬の外側で検出され、入力ニューロンの 8% が​​対側半球に位置していました。 これらの長距離入力の割合は、外傷性脳損傷動物では大幅に減少しました（図2e、f）。 さらに、0 mm（嗅球）から13 mm（小脳）までの前後（AP）軸全体に沿った200μmビン内の入力ニューロンの確率を分析しました（図2g）。 これにより、海馬レベルで 6.8 mm から 7.4 mm の間の入力ニューロンの割合が大幅に増加していることが明らかになりました (6.8 ～ 7 mm、無傷: 6.79 ± 0.79%、TBI: 18.12 ± 5.03%、P = 1.42E-11; 7- 7.2 mm、無損傷: 7.15 ± 0.83%、TBI: 18.31 ± 4.01%、P = 3.02E-11; 7.2 ～ 7.4 mm、無損傷: 8.67 ± 1.70%、TBI: 16.72 ± 4.55%、P = 7.64E-06;ボンフェローニの事後検定による二元配置反復測定分散分析; 補足データ 3)、10 mm で ENTm レベルで 10.2 mm に減少します (コントロール: 7.48 ± 2.04%、TBI: 1.90 ± 1.03%、P = 1.33E) -02;ボンフェローニの事後検定による二元配置反復測定分散分析;補足データ 3)。 外傷性脳損傷後、同側海馬内で大規模な入力標識が検出され、CA1領域からの入力の割合が著しく高かった（図2h;補足データ4）。 ただし、ENTmやNDBなど、対照のSST介在ニューロンへの入力の大部分を提供する遠隔脳領域では、外傷性脳損傷後に入力が大幅に減少することがわかりました（図2h;補足データ4）。 入力の比率ではなく入力ニューロンの数の変化を直接比較するために、各動物の収束指数を計算しました。これは、mCherry 標識された入力ニューロンの数を GFP および mCherry 標識されたスターター細胞の数で割ったものとして定義されます。 この分析では、CA1入力の大幅な増加と、ENTmおよびNDBからの長距離入力の減少も明らかになりました（補足図7;補足データ5）。 したがって、外傷性脳損傷後の海馬 SST 介在ニューロンへの局所入力と長距離入力の数と相対比率の両方に劇的な変化が見られます。

外傷性脳損傷後の長距離入力の喪失は、離れた部位でのニューロンの喪失または解剖学的接続の喪失によって生じる可能性があります。 これをテストし、肺門SST介在ニューロンへの入力の神経化学的正体を特徴付けるために、ライトシートイメージングに使用したのと同じ脳を再水和し、従来の二重免疫蛍光免疫染色用に処理する方法を開発しました（図3a〜c）。 門部 SST 介在ニューロンへの長距離入力は主に前脳基底部と ENTm から到着するため、これらの領域のニューロン集団を定量化しました。

a 逆脳浄化および免疫標識の実験プロトコルを示す概略図。 b 無傷の対照脳の NDB の矢状光学切片で特定された 2 つの狂犬病標識入力ニューロン (赤)。 n = 3 の無傷の対照からの代表的な動物。 全脳ライトシートイメージングによって得られた50μmの最大強度投影。 c 従来の免疫染色および共焦点イメージングの処理後に CHAT (緑) としてラベル付けされた同じ入力ニューロン (マゼンタ) を含む矢状断面。 n = 3 の無傷の対照からの代表的な動物。 矢印は、同時標識されたセルを示します。 d CHAT（緑色）のラベルが付けられた、無傷の対照（左）および脳損傷動物（右）のNDB。 n = 3 匹の無傷マウスと 4 匹の TBI マウスからの代表的な動物。 e CHATを発現したmCherry+狂犬病標識入力ニューロンの割合。 f 損傷を受けていない対照および脳損傷動物における同側および対側のNDBにおけるCHAT+ニューロン密度の定量化。 n = 3 匹の無傷動物と 5 匹の外傷性脳損傷動物。 g 損傷を受けていない対照動物（左）および脳損傷動物（右）の歯状回の矢状断面で、CHAT（緑色）およびDAPI（青色）が標識されています。 n = 3 匹の無傷マウスと 4 匹の TBI マウスからの代表的な動物。 h、肺門。 gcl、顆粒細胞層。 ml、分子層。 h. 損傷を受けていない対照動物および脳損傷動物における同側および対側の歯状回における CHAT+ 軸索密度の定量化。 n = 3 匹の無傷動物と 4 匹の外傷性脳損傷動物。 i リーリン (緑色) と mCherry (マゼンタ) でラベル付けされた、損傷を受けていない対照 (左) と脳損傷動物 (右) の ENTm。 n = 3 匹の無傷動物と 5 匹の外傷性脳損傷動物からの代表的な動物。 j リーリンを発現した mCherry+ 狂犬病標識入力ニューロンの割合。 k 同側および対側の ENTm におけるリーリン + 細胞密度の定量化。 n = 3 匹の無傷動物と 5 匹の外傷性脳損傷動物。 エラーバー、標準誤差。 スケールバー、100μm。 補足図 8 および補足データ 1 も参照してください。ソース データは、ソース データ ファイルとして提供されます。

前脳基底部には、コリン作動性ニューロン、グルタミン酸作動性ニューロン、GABA作動性ニューロンなど、線毛/脳弓経路を介して海馬まで長距離を投射する複数の細胞型が含まれています39。 対照動物と損傷動物の両方において、肺門部 SST 介在ニューロンへの NDB 入力ニューロンの絶対大多数がコリン アセチルトランスフェラーゼ (CHAT) を発現しました (対照: 67.1 ± 6.8%、n = 3 マウス、TBI: 79.2 ± 12.5%、n = 4 マウス、P = 0.99、フィッシャーの直接確率検定;図 3d、e)。 これは、主に前脳基底部から GABA 作動性入力を受ける CA1 の抑制性介在ニューロンとは異なります。 対照動物と脳損傷動物の間でNDBのCHAT +ニューロンの密度に違いは見つかりませんでした（図3f）。これは、局所性外傷性脳損傷後にCHAT +ニューロンが前脳基底部で減少していないことを示唆しています。

NDB および ENTm のニューロンは海馬に直接投影されるため、それらの軸索は外傷性脳損傷によってほぼ確実に損傷されます。 したがって、次に、海馬のコリン作動性投射の密度が外傷性脳損傷によって影響を受けるかどうかを調べました。 対照動物と損傷動物の両方において、損傷震源地であっても、海馬の各層を神経支配するCHAT+軸索突起の密集した神経叢が存在した(図3g、h)。 グループ間の CHAT 発現の差異は検出されませんでした (コントロール、同側: 20.8 ± 1.9%、コントロール、対側: 20.8 ± 1.7%、n = 3 マウス、TBI、同側: 22.9 ± 0.6%、TBI、対側: 22.0 ± 1.2%、n = 4 マウス、P = 0.96、二元配置分散分析)。 これらの結果は、CHAT+ 入力ニューロンの減少が、外傷性脳損傷後の海馬における CHAT+ 求心性神経の全体的な喪失を伴わないことを示しています。

CHAT 免疫反応性ニューロンの喪失がびまん性損傷モデルの前脳基底部で報告されているため、この結果は予想外でした 40,41。 細胞の定量化が狂犬病回路マッピングまたは脳浄化手順によって影響を受けた可能性を排除するために、これらの手順を受けなかった対照動物および脳損傷動物の第二の独立したコホートを調べました（n = 6 対照、n = 4 TBI 動物）。 。 この複製実験では、年齢が一致したコントロールマウスとTBIマウスのNDBでも同様の数のCHAT +ニューロンが見つかりました（補足図8）。

対照動物と脳損傷動物の両方で、ENTmの入力ニューロンはほぼ独占的に層IIで見つかりました（図3i）。 これらの細胞の約 90% がリーリンを共発現し、大きな多極星状細胞の形態を持っていました (コントロール: 86.8 ± 0.34%、n = 3 マウス; TBI: 95.2 ± 4.8%、n = 3 マウス; P = 0.99、フィッシャーの直接確率検定;図3j)。 これらの結果は、ENTm のリーリン発現星細胞が、海馬の歯状回、CA3 および CA2 領域に突き出る穿孔経路として知られる主要な関連グルタミン酸作動性経路を生じさせることを示した先行研究と一致しています。 前脳基底部での結果と同様に、対照動物と脳損傷動物の間でENTmのリーリン+ニューロンの密度に違いは見つかりませんでした（図3k）。 まとめると、我々の結果は、局所性外傷性脳損傷後の歯状回を神経支配する主要な遠隔脳領域の両方から肺門部 SST 介在ニューロンへの入力量が減少しているが、これらの遠隔領域は構造的に無傷のままであることを示しています。

CA1 からの入力は外傷性脳損傷後に 10 倍以上増加しました。 どの CA1 ニューロン タイプが肺門 SST 介在ニューロンに入力を提供するかを特定するために、同じ逆除去組織内の CA1 入力ニューロンの層流位置を評価しました (図 4)。 対照では、CA1 入力ニューロンの約 65% が錐体細胞層に位置していました。 これらのニューロンは錐体ニューロンの形態学的特徴を有しており、CA1錐体ニューロンのマーカーであるWFS1を発現していました（図4a）。 CA1 入力ニューロンのより小さな部分は錐体層の外側で見つかり、WFS1 を発現していませんでした。 これらは推定上の介在ニューロンです。 脳損傷動物では、錐体細胞層に位置する入力ニューロンの割合が大幅に増加しました (コントロール: 64.5 ± 14.0%、n = 3 マウス、TBI: 92.1 ± 5.1%、n = 4 マウス、P = 1.29) E-07、カイ二乗検定、図 4b)。 これらのニューロンからの強力な投射が歯状回に進入しているのがはっきりと見られました（図4a）。 したがって、外傷性脳損傷後に肺門 SST 介在ニューロンへの局所 CA1 入力が増加し、CA1 錐体ニューロンがこの新しい入力の主な供給源となります。

狂犬病（青）とWFS1（赤）でラベル付けされた、無傷対照（上）および脳損傷動物（下）のCA1。 n = 3 匹の無傷マウスと 4 匹の TBI マウスからの代表的な動物。 それで、地層オリエンス。 sp、ピラミッド層。 sr、放射状層。 ml、分子層。 gcl、顆粒細胞層。 b CA1 の各層で見つかった入力ニューロンの割合。 ***P = 1.29E-07、無傷対外傷性脳損傷、両側カイ二乗検定。 n = 3 匹の無傷対照からの 45 細胞、4 匹の TBI マウスからの 183 細胞。 スケールバー、100μm。 補足データ 1 も参照してください。ソース データは、ソース データ ファイルとして提供されます。

海馬のSST介在ニューロン回路の脳全体の劇的な再構成を観察したので、我々は次に、SSTニューロンへの入力も損傷から遠く離れたところで再配線されるかどうかを尋ねた。 PFC は、記憶の検索と意思決定の中心となる重要な高次辺縁系部位であり、海馬からの直接入力を含む、脳全体にわたる非常に多様な入力パターンを受け取ります。 損傷の24時間後、フルオロジェイドC染色により、損傷震源地の海馬と新皮質の変性ニューロンが明らかになりましたが、PFC、嗅内皮質、前脳基底部、視床などの離れた部位では標識細胞は検出されませんでした（補足図9） ）。 この結果は、このモデルの以前のレポートとほぼ同じです46。 また、外傷性脳損傷の8週間後のPFCにおけるSST +ニューロン密度の違いも見つかりませんでした（補足図10;補足データ1）。 これらの結果は、高度に限局性の挫傷性脳損傷を引き起こすことと一致しています。

PFCにおけるSST介在ニューロンへの入力の全脳マップを生成するために、同じ2ウイルス狂犬病ベースのアプローチを使用して、SST-Creマウスのデュアルカラースターター細胞とmCherry標識入力ニューロンを標識しました（図5a、b） ）。 これらの研究では、PFC は文献から得られたコンセンサスに基づいて次のサブ領域を含むものとして定義されました: 二次運動野 (MO)、前帯状野の背側および腹側 (ACAd および ACAv)、辺縁前野 (PL)、辺縁下野 ( ILA）、眼窩皮質内側、外側、および腹外側（ORBm、ORBl、およびORBvl）。 注射は同側半球（つまり、脳の損傷側）に行われました。 AAV8-hSyn-FLEX-TVA-P2A-eGFP-2A-oG ヘルパーと RVΔG-mCherry ウイルスを Cre 動物に注射した後、GFP 標識ニューロンの 96.5% が SST+ であり、脳のどこにもニューロンが標識されていないことがわかりました (補足図11)。 対照動物と脳損傷動物の両方で、スターター細胞はほぼ独占的に PFC 内に位置していました (図 5c-f)。 スターター細胞の地域分布は、PFC47について以前に発表されたものと同様であり、スターターニューロンの背腹側の位置（図5d;補足データ6）または層分布（図5e）においてグループ間で差異は検出されませんでした。 ）、スターターセルの位置に大きな偏りがないことを示しています。 予想通り、入力ニューロンの数とスターター ニューロンの数の間には相関関係がありましたが、海馬とは異なり、脳損傷動物ではスターター ニューロンの数は減少しませんでした (コントロール: n = 283.6 ± 69.5 細胞、TBI: n = 178.8 ± 18.2 細胞、P = 0.2、両側 t 検定、グループあたり n = 5 匹の動物;図 5g)。

a 左: iDISCO+ を使用して全脳をクリアし、PFC SST 介在ニューロンに入力を提供するニューロンをラベル付けしました (白)。 右: 注射部位の狂犬病標識入力ニューロンを示す、同じ脳の 100 μm 矢状光学切片。 b (a) に示されているボックス領域は、スターター セル (青) および入力ニューロン (赤) としてラベル付けされています。 c. 損傷を受けていない対照動物および脳損傷動物の標準化されたアトラス空間に登録された個々のスターター細胞を示す概略冠状断面 (100 μm)。 それぞれの色は異なる動物に対応しています。 1 つのドットは 1 つのニューロンを表します。 n = 1 グループあたり 5 匹の動物。 d 背腹軸に沿ったスターターニューロンの全脳分布のガウスカーネル細胞密度プロット。 灰色の陰影はプールされた集団を表し、個々の線は各動物を表します。 e 損傷を受けていない対照動物および脳損傷動物におけるスターター細胞の局所的分布。 f PFC内で特定されたスターターセルの割合（PL、ACAd、ACAv、MO、ORBm、ORBvl、ILA）。 g スターター細胞とシナプス前入力ニューロンの数の線形回帰分析 (グループあたり n = 5 マウス; R2 = 0.95)。 スケールバー、1 mm (a および c)、500 μm (b)。 略語のリストは補足データ 2 に示されています。補足図 9 ～ 12 も参照してください。ソース データはソース データ ファイルとして提供されます。

次に、PFC における SST 介在ニューロンへの入力を定量化しました。 全脳逆行追跡により、178の異なる脳領域からの入力が明らかになった（図6a、補足図12、13）。 入力の大部分は等皮質内、特に同側半球で検出され、視床、海馬、淡蒼球がそれに続きます。 これらの結果は、対照動物における以前の逆行性追跡結果に匹敵します47,48。 等皮質内では、PFC サブ領域が最も顕著な入力を提供しました。 無顆粒島領域と海馬領域 CA1 も顕著な入力を提供しました。 AP 軸に沿った入力確率の分析では、脳損傷動物の PFC レベルで 3.2 ～ 3.4 mm の間の入力ニューロンの割合が大幅に増加していることが示されました (無損傷: 9.14 ± 1.14%、TBI: 12.06 ± 1.41%、P = 4.82E-03; ボンフェローニの事後検定による二元配置反復測定分散分析; 補足データ 7)。 内側-外側（ML）軸に沿って、同側半球の正中線から外側0.2〜0.5 mm（5.9〜6.0 mm、無傷：8.37 ± 1.38%、TBI：11.38 ± 1.69%、 P = 9.09E-07; 6.0 ～ 6.1 mm、無傷: 10.20 ± 1.12%、TBI: 13.35 ± 0.81%、P = 2.08E-07; 6.1 ～ 6.2 mm、無傷: 8.94 ± 0.61%、TBI: 11.90 ± 1.24 %、P = 1.68E-06; ボンフェローニの事後検定による二元配置反復測定分散分析; 補足データ 7)、入力ニューロンの割合が著しく低いことが、対側半球の正中線外側 0.4 ～ 0.5 mm の間で見つかりました。 （5.2〜5.3 mm、無傷：3.22±0.34％、TBI：1.35±0.32％、P = 3.51E-02、ボンフェローニの事後検定による二元配置反復測定分散分析、図6b、補足データ7）。 外傷性脳損傷後の SST 介在ニューロンへの対側入力の全体的な割合は大幅に減少しました (図 6c)。これは海馬で観察されたものと同様です。 ただし、スターターセルの重心までの入力ニューロンの平均距離（図6d）または同側PFCの外側に位置する入力ニューロンの全体の割合（図6e）には差は検出されませんでした。

a 損傷を受けていない対照（青）および脳損傷動物（赤）の標準化されたアトラス空間に登録された個々の入力ニューロンを示す概略冠状断面（100μm）。 1 つのドットは 1 つのニューロンを表します。 n = 1 グループあたり 5 匹の動物。 b 前方-後方 (AP) および内側-外側 (ML) 軸に沿った入力ニューロンの全脳分布のガウス カーネル セル密度プロット。 灰色の陰影はプールされた集団を表し、個々の線は各動物を表します。 ブレグマ、5.3 mm。 正中線、5.7mm。 c 対側半球に見られる入力ニューロンの割合。 無傷: 14.00 ± 1.02%; 外傷性脳損傷: 8.22 ± 0.98 %; n = 1 グループあたり 5 匹のマウス。 **P = 3.41E-03; 両側 t 検定。 d スターターセルの重心と入力ニューロンの位置の間の平均ユークリッド距離の定量化。 n = 1 グループあたり 5 匹の動物。 e 同側 PFC の外側で見つかった入力ニューロンの割合。 n = 1 グループあたり 5 匹の動物。 f 脳の高次領域から生じる総入力の割合。 ***P = 2.84E-06、無傷対外傷性脳損傷 (IsoCTX、対側)、***P = 4.46E-10、無傷対外傷性脳損傷 (IsoCTX、同側)、***P = 4.12E-05、無傷対外傷性脳損傷外傷性脳損傷（TH、同側）; n = 1 グループあたり 5 匹のマウス。 ボンフェローニの事後検定による二元配置反復測定分散分析。 g 視床領域から生じる総シナプス前入力の割合。 ***P = 1.16E-11、無傷対外傷性脳損傷（ATN、同側）、*P = 4.46E-02、無傷対外傷性脳損傷（VENT、同側）。 n = 1 グループあたり 5 匹のマウス。 ボンフェローニの事後検定による二元配置反復測定分散分析。 h PFC を支配するすべての個別の脳領域で特定された入力ニューロンの割合を示すヒートマップ。 ***P = 1.00E-15、無傷対外傷性脳損傷（ACAd、同側）、***P = 1.00E-15、無傷対外傷性脳損傷（ILA、同側）、***P = 1.00E-15、無傷対外傷性脳損傷外傷性脳損傷（ORBm、同側）、*P = 1.25E-02、無傷対外傷性脳損傷（ORBvl、同側）、***P = 1.00E-15、無傷対外傷性脳損傷（PL、同側）、***P = 1.18E -04、無傷対外傷性脳損傷（PL、対側）、***P = 1.07E-05、無傷対外傷性脳損傷（AM、同側）。 n = 1 グループあたり 5 匹のマウス。 ボンフェローニの事後検定による二元配置反復測定分散分析。 エラーバー、標準誤差。 スケールバー、1 mm。 略語のリストは補足データ 2 に記載されています。補足図も参照してください。 ソース データは、ソース データ ファイルとして提供されます。

入力ニューロンは、最初に大きな機能区分、すなわち等皮質、嗅覚野、海馬形成、皮質下板、線条体、淡蒼球、視床、視床下部、中脳および後脳に従ってグループ化された。 脳損傷動物では、PFCのSST介在ニューロンが、対照と比較して同側の等皮質からの総入力のかなり大きな割合を受け取ったが、対側の等皮質と同側の視床における入力ニューロンの割合は両方とも減少したことがわかりました（図6f;補足）データ8)。 視床では、前視床核（ATN）および背側視床の腹側グループ（VENT）は、外傷性脳損傷後の入力ニューロンの割合が著しく低いことを示しました（図6g）。 すべての個別の脳領域における入力ニューロンの全脳分析により、外傷性脳損傷後に入力が変化した7つの領域のうち6つが等皮質にあることが明らかになりました（図6h）。 注目すべきことに、同側半球のすべての PFC 領域で入力ニューロンの割合が著しく高いわけではありません。 外傷性脳損傷後、ACAd と ORBvl からの入力は両方とも大幅に減少しました。 外傷性脳損傷後、対側の PL からのインプットの割合も減少しました。 同様の結果が、各動物の収束指数を分析することによって得られました（補足図14;補足データ9）。 この局所的な接続性の強化と長距離入力の減少のパターンは、脳損傷を受けた海馬で観察されたものと類似しており、損傷部位から非常に離れた脳領域であっても、脳の焦点が損傷した後に抑制性ニューロンの地形的組織が劇的に再配線されることを示唆しています。けが。

胚由来の介在ニューロン前駆細胞の移植は、抑制の強力な回復を可能にし、てんかん 49、アルツハイマー病 50 および外傷性脳損傷 51 を含む広範囲の後天性脳障害の治療に役立ちます。 ただし、この再生の回路基盤は不明です。 したがって、我々は、介在ニューロン前駆細胞が損傷した脳内で適切な局所的および長距離の接続を確立できるかどうかをテストしました。 この目的のために、ほぼすべての SST 発現皮質介在ニューロンの発生起源である内側神経節隆起 (MGE) から GABA 前駆細胞を採取しました 6。 次に、外傷性脳損傷の 7 日後、3 × 104 個の MGE 細胞を C57BL/6 J マウスの損傷震源部の同側海馬に移植しました。 これは、TBI52 後の最大求心路遮断の期間に対応します。 まず、移植後の視覚化を可能にするために、Ai6レポーターと交配したE13.5 SST-Creドナーマウスから採取したSST介在ニューロンの移植片を検査しました。 移植後35日（DAT）で、移植された介在ニューロンが海馬サブフィールド全体で見つかりました（n = 3動物）（図7a、b、補足図15）。 Ai6標識細胞の大部分はSSTを発現し（83±2.1％、図7c）、移植されたMGE細胞のSST集団における選択的Cre発現が確認された。

a 左: 移植後 5 週間後の海馬背側の冠状切片。Ai6 発現移植介在ニューロン (黄色) および DAPI (青色) が標識されています。 n = 3 匹のマウスからの代表的な動物。 スケールバー、1 mm。 右: ソマトスタチン (マゼンタ) で同時標識された Ai6 発現ニューロン (黄色)。 スケールバー、100μm。 b 移植された SST 介在ニューロン 35 DAT の分布、n = 3 マウス。 c ソマトスタチンを発現した Ai6 発現細胞の割合、n = 3 マウス。 エラーバー、sem 補足図 15 も参照してください。ソース データはソース データ ファイルとして提供されます。

次に、全脳マッピングを実行して、損傷した脳に移植された SST 介在ニューロンへの局所的および長距離入力を特定しました。 これらの実験では、Ai6 レポーターを含まない SST-Cre+ 胚からドナー細胞を取得しました。 外傷性脳損傷の 7 日後に移植を実施し、損傷後 8 週間 (AAV8-hSyn-FLEX-TVA-P2A-eGFP-2A-oG) および 11 週間 (RVΔG-mCherry) で海馬にウイルス注射を行い、動物を処理しました。最後のウイルス注射の7日後に脳の浄化と分析を行います。 この期間は、MGE 移植が脳損傷動物の記憶と発作に対して強力な治療効果を示す時期に相当します 51。 私たちは、狂犬病ウイルスによって標識された脳全体のかなりの数の入力ニューロンを発見しました（図8a〜c）。 特に、入力ニューロンは、海馬、ENTm、ENTl、内側中隔およびNDBのすべての領域を含む14の異なる脳領域で同定された（図8c〜f、補足図16）。 入力の大部分は海馬から来ており、CA3 および CA1 領域からの強力な入力も含まれています。 この局所入力のパターンは、対照ではなく移植を受けなかった脳損傷動物で観察されたものと類似していました（補足図17）。 地域入力が共変動するかどうかを判断するために、入力地域のペアごとにピアソンの相関係数を計算しました。 これは、CA1、CA2、大細胞核 (MA)、前肋骨 (ProS)、海馬台 (SUB)、および鼻周囲皮質 (PERI) を含むいくつかの入力領域間に有意な正の相関関係を示し、移植されたニューロンが 1 つの領域から入力を受け取ると、一般に、他の相関領域から入力を受け取ります（図8g）。 したがって、移植された SST 介在ニューロンは同所性入力パターンを受けましたが、移植された細胞は外傷性脳損傷後に見られる局所入力の増強を示しました。

a 移植細胞 (青) と入力ニューロン (オレンジ) がラベル付けされた歯状回の 100 μm 矢状光学切片。 白い矢印、スターターセル。 h、肺門。 gcl、顆粒細胞層。 ml、分子層。 b 左: (a) に示されている同じ動物の同側半球全体の全脳レンダリング。入力ニューロン (白) のラベルが付けられています。 点線の円は、海馬 (HIP) を覆う損傷境界の輪郭を示します。 右: 上中心縫線核 (CS)、内側中隔 (MS)、および対角帯核 (NDB) の入力ニューロンを示す全脳レンダリング。 n = 5 匹のマウスからの代表的な動物。 c 標準化されたアトラス空間に登録された個々のスターター細胞（赤）と入力ニューロン（青）を示す概略冠状断面（250μm）。 1 つのドットは 1 つのニューロンを表します。 n = 5 匹の動物。 d 無傷の損傷脳に移植された SST 介在ニューロンに入力を提供するニューロンの最大強度投影 (100 μm)。 n = 5 匹のマウスからの代表的な動物。 e 上: 海馬の各層に見られる移植されたスターター細胞の割合。 下：狂犬病標識された入力ニューロンを含む脳領域のバブルプロット。 f 前後軸に沿った入力ニューロンの全脳分布のガウスカーネルセル密度プロット。 灰色の陰影はプールされた集団を表し、個々の線は各動物を表します。 g 移植された SST 介在ニューロンへの入力の相関行列。 サイズと色、相関係数。 *P < 0.05、正確な P 値はソース データ ファイルで提供されます。 両面ピアソン相関。 スケールバー、100 μm (a、g)、1 mm (b、c)。 略語のリストは補足データ 2 に記載されています。補足図 16 および 17、ソース データおよび補足ムービー 5 も参照してください。ソース データはソース データ ファイルとして提供されます。

限局性外傷性脳損傷のマウスモデルを使用して、損傷した脳における大規模な回路再構成の体系的な評価を報告します。 私たちは、脳損傷後、および脳損傷動物への移植後の、損傷を受けていない対照において、治療関連性の高い単一細胞型であるSST介在ニューロンに脳全体の入力をマッピングしました。 私たちのデータは、生き残ったSST介在ニューロンは外傷性脳損傷後に新たな局所入力を獲得しますが、それらは主に離れた脳領域から切り離されていることを示しています。 これは、空間的には異なるが相互作用する 2 つの脳領域、つまり海馬の損傷部位と、外傷性脳損傷によって直接損傷を受けていない PFC の損傷部位から遠く離れた場所で発生しました。 PFC は外傷性脳損傷によって直接損傷を受けておらず、銀染色実験の結果は半球間の投影が変性しないことを示唆しているため、損傷から遠く離れた回路再構成に関する我々の観察は予想外でした 46。 したがって、外傷後の回路の再配線は損傷領域のみに限定されるものではなく、局所損傷に反応して脳全体に広く起こります。 さらに、長距離接続の減少は、離れた脳領域での細胞喪失や、損傷した海馬に突き出ている軸索側副葉の一般的な減少によって生じたものではないことを示した。 移植されたSST介在ニューロンは、脳損傷を負った海馬に堅牢に統合され、天然生まれの介在ニューロンの接続に似た局所的および長距離の宿主入力を受け取りました。 これは、宿主の脳から移植された介在ニューロンに対する強力な興奮性駆動を記録した以前の生体外機能研究と一致していますが、これらの入力の供給源は以前は不明でした。

外傷性脳損傷は、時間の経過とともに進行する進行性の脳損傷と二次的な神経可塑性反応に起因して、神経回路に大きな構造的および機能的変化を引き起こします53,54。 最近まで、外傷性脳損傷が脳の配線図にどのような損傷を与えるかについての私たちの理解は、標準的な神経解剖学とスライス電気生理学的なアプローチに限定されていました。 これらの研究は、おそらく入力ニューロンの喪失により、主要なニューロンが外傷性脳損傷後に最初の求心路遮断を受けることを示しています53、54、55、56。 これに続いて、シナプス接触の数が徐々に増加し、脳の損傷領域内で新しい興奮回路が形成されます54,57,58,59,60,61,62。 通常、局所の主ニューロンからまばらな入力を受ける海馬 SST 介在ニューロンへの興奮性駆動も、脳損傷後に増加します 24。 ただし、スライス記録は、長距離の求心性入力から外科的に分離されているため、局所回路内のいくつかのニューロンの機能的接続を解決することに限定されます。 細胞解像度で脳全体の入力を SST 介在ニューロンに包括的にマッピングすることにより、以前のスライス電気生理学研究と一致して、外傷性脳損傷後の肺門 SST 介在ニューロンへの局所入力ニューロンの大幅な増強を発見しました。 我々はさらに、外傷性脳損傷後に増強されるCA1から門部SST介在ニューロンへの逆投影経路など、対照におけるこれまで知られていなかった入力源を同定した。 特に、CA1介在ニューロンは、側頭葉てんかんモデルにおいて歯状回に投影することもできます25が、これらの細胞は主に顆粒細胞を神経支配します。

これまでの機能的接続性の研究では、外傷性脳損傷が脳を、離散的な脳領域を接続するまばらな長距離入力によってリンクされた高密度に接続されたローカルネットワークとして定義されるスモールワールドアーキテクチャから遠ざけると仮定しています63。 この概念に沿って、半球間の静止状態の fMRI 接続性は TBI 後に低下し 64、これはおそらくびまん性軸索損傷の結果 63 であり、一般に時間の経過とともに弱まるローカルネットワークの過剰な接続性が一時的に増加します 65。 これらの方法は脳の接続性に関する一般的な仮説には役立ちますが、外傷性脳損傷における回路機能不全の正確な構造的根拠を特定することはできず、興奮性ニューロンの影響を過度に受ける可能性があります。 私たちの回路マッピング データは、セル タイプ レベルでこの考えと完全に一致しているわけではありません。 海馬とPFCの両方において、対側半球からの入力を含むSST介在ニューロンへの長距離入力の最も顕著なソースが局所性外傷性脳損傷後に減少するが、局所的な接続は慢性的に増加することが判明した。 したがって、TBI は、ローカル ネットワーク接続を増やし、長距離入力をよりまばらにすることによって、抑制性回路の小さな世界性を永続的に強化する可能性があります。 この考えは人間の機能的接続性の研究から支持されています66。

CCI46 後には明らかな軸索損傷があり、これが海馬への長距離入力に影響を及ぼしている可能性があります。 外傷性脳損傷後に観察された構造再構成の一部が白質路の損傷の影響を受けている可能性を排除することはできません。 しかし、軸索損傷だけでは、脳に損傷を負った動物で観察された長距離回路の変化を完全に説明することはできません。 海馬では、遠方の脳領域または海馬内のその投影（例、CHAT + 求心性神経）における細胞喪失を伴わない、SST 介在ニューロンへの長距離入力が約 4 分の 1 に減少することがわかりました。 これは、入力領域が入力ニューロンの一般的な喪失や軸索切断によって SST 介在ニューロンから切り離されていないことを示唆しています。 むしろ、入力はセルタイプ固有の方法で追加または削除できます。 長距離の求心性神経は CCI によって選択的に損傷を受けるが、それ以外は無傷のままである可​​能性があります。 たとえば、外傷性脳損傷が軸索輸送機構を混乱させることはよく知られており 67、これは狂犬病の長距離シナプス前入力ニューロンへの逆行性輸送に不釣り合いな影響を与える可能性があります。 しかし、移植された介在ニューロンが長距離接続を確立できるという我々の発見は、これらの減少した入力を再成長させる可能性がすべての脳損傷動物で保持されていることを示唆している。 PFC における SST 介在ニューロンへの局所入力の同様の増加と長距離入力の減少を発見しました。 海馬とは異なり、これらの突起は直接損傷を受けることはなく、CCI46 後に変性することもありません。 特に興味深いのは前内側視床であり、これは外傷性脳損傷後に入力ニューロンが変化した唯一の視床領域であった。 前視床（ATN、前内側、前腹側、および前背側の下位区分で構成される）は、外傷性脳損傷の齧歯類モデルにおいて深く影響を受ける、記憶および空間ナビゲーション68をサポートする皮質下回路を提供します。 損傷した海馬の過剰な活動が、PFCの下流の変化を引き起こす可能性があります（たとえば、海馬-ATN-PFC回路を介して）。 あるいは、この損傷モデルでは発作が十分に記録されており、脳全体にわたる回路の再編成につながる可能性があります。 それにもかかわらず、我々の結果は、直接的な損傷や細胞喪失があったかどうかに関係なく、局所性外傷性脳損傷が脳全体のSST介在ニューロンへの入力の広範な再マッピングにつながることを示唆しています。

損傷した海馬には抑制性ニューロンがはるかに少ないため、外傷性脳損傷は生き残った介在ニューロンに並外れた要求を課します。 SST 介在ニューロンには 3 つの生理学的特徴があり、長距離入力の喪失が損傷に対する代償反応を反映している可能性がある理由を説明できる可能性があります。 まず、SST 介在ニューロンは、強力に促進する興奮性シナプス入力を受け取り、これらの細胞が 1 つのシナプス前ニューロンからの高周波バーストによって活性化されることを可能にする他の膜特性を持っています 69,70。 海馬では、局所主ニューロンから入力を獲得し、ENTm 入力を失うことが、TBI71 後の局所ネットワーク活動の安定化に役立つ可能性があります。 第二に、ムスカリン媒介脱分極は、SST 介在ニューロンに長期にわたるスパイクを引き起こす可能性があります 72。 外傷性脳損傷後の局所的な神経支配が豊富であることを考えると、前脳基底部からの CHAT 入力の喪失は、損傷した脳におけるこの重要な細胞型への興奮性駆動のバランスをとる戦略を反映している可能性があります。 第三に、単一の樹状突起を標的とする介在ニューロンであっても、皮質主ニューロンにおけるスパイクの生成を制御することができる7。 したがって、フィードフォワードから樹状突起へのフィードバック阻害への移行は、長距離入力の喪失と局所逆投影の強化を通じて、入力統合を制御し、記憶を可能にする歯状顆粒細胞のまばらな活性化を維持するための潜在的な戦略を反映している可能性があります。発作を防ぎます73,74。 あるいは、局所入力の増加は、SST 介在ニューロンを同期させたり、病理学的活動のパターンをサポートしたり、別々の脳領域間の調整を妨げたりする可能性があります。 これらの可能性を明らかにするには、生体内神経生理学と海馬細胞型の選択的操作を組み合わせたさらなる研究が必要となるだろう。

損傷した脳全体の抑制回路が劇的に再編成されたことを考えると、移植されたSST介在ニューロンが損傷した海馬に構造的に組み込まれる能力は驚くべきものでした。 宿主とドナーの細胞の接続性は広く文書化されていますが 75,76 、個々のニューロンタイプへの正確な解剖学的入力はまだ文書化されていません。 細胞型の特異性は、特に疾患の回路基盤を理解する上で重要な考慮事項です。 損傷した脳における大規模な反応性可塑性にもかかわらず、移植された介在ニューロンは、領域特異的ではなく細胞型特異的な高度に同所性の入力を受け取ることがわかりました。 私たちは、さまざまな前臨床疾患モデルで見られる介在ニューロン移植の有益な効果は、宿主の脳回路への介在ニューロン前駆体の正確な統合によってもたらされると提案します。 この見解は、移植された介在ニューロンの一般的な構造と機能がネイティブ生まれの対応物とよく似ていることを報告する多数の証拠によって裏付けられています49,51,52,77,78,79。また、最近の DREADD 不活性化と VGAT の機能喪失も報告されています。治療効果が移植された介在ニューロンの電気生理学的統合に関連していることを実証する研究 51,80。 別の見方では、介在ニューロン前駆体は宿主の脳と弱い接触のみを形成し 81、宿主の脳回路を改変する若返り因子を放出することで間接的に作用すると示唆されています 82。 しかし、詳細な電気生理学的研究は一貫して強力なシナプス接続を報告しており、回路活性化因子の直接的な証拠はまだ特定されていない。 今回の研究では、逆行性輸送を介して狂犬病を受けたAAV標識SSTニューロンとスターター細胞を区別することができなかったため、移植された介在ニューロン間のシナプス結合を直接テストすることはできなかった。 しかし、局所入力ニューロンの大部分は、（形態および層流位置に基づく）抑制性ニューロンではなく、推定上の主ニューロンであった。 これは、ほとんどのシナプス接続が宿主脳の主要な細胞とのものであることを実証する、EM 超微細構造解析、神経解剖学、およびパッチクランプ電気生理学を用いた MGE 移植に関する堅牢な文献と一致しています 51,52,77,81,82,83,84,85。

外傷性脳損傷後のシナプス回路再配線のパターンは複雑です。 私たちの結果は、局所的な脳損傷が世界規模で抑制回路を再編成することを示唆しています。 私たちは、この実験的アプローチが、外傷性脳損傷および関連する脳障害におけるネットワーク機能不全の全脳分析を検討するための有用な枠組みとして役立つことを期待しています。

すべての動物手順は、カリフォルニア大学アーバイン校の大学実験動物資源局による施設内動物管理使用委員会 (IACUC) の承認の下で行われ、実験動物の管理と使用に関する国立衛生研究所のガイドラインに準拠しました。 実験は、餌と水を自由に与え、12時間の明暗サイクルの標準的な飼育条件で維持された雌雄の成体マウスで行われました。 SST 細胞の定量化には、FVB バックグラウンドで維持された GIN マウス (Jax Stock No: 003718) を使用しました。 狂犬病回路追跡には、C57BL/6 J バックグラウンドで維持された Sst-IRES-Cre マウス (Jax Stock No: 018973) を使用しました。 フルオロジェイド C 実験には C57BL/6 J マウス (Jax Stock No: 000664) を使用しました。 細胞移植の場合、胚ドナー組織は、Sst-IRES-Cre J マウスと C57BL/6 J マウス (Jax ストック番号: 000664) または Ai6-ZsGreen レポーター マウス (Jax ストック番号: 007906) を交配することによって作製されました。 宿主マウスは、C57BL/6 J マウス (Jax Stock No: 000664) でした。

実験は、P55 から P139 までの雄と雌の同腹子に対して行われました。 離乳時に動物をコード化し、無傷（ナイーブ対照）、外傷性脳損傷（TBI）、またはMGEを注射した治療群にランダムに割り当てた。 脳損傷マウスと年齢を一致させた対照を、温度 (21 ～ 22 °C)、湿度 (40 ～ 51%)、光 (12 時間の明暗サイクル) の環境で一緒に飼育しました (1 ケージあたり 2 ～ 5 匹)。 ）管理されたビバリウム。 損傷、ウイルス注入、細胞移植の順序もランダム化された。 外傷性脳損傷治療グループでは損傷があったため、盲検化は不可能でした。 CHAT免疫染色実験は、対照動物と脳損傷動物の別個の独立したコホートを使用して再現されました。 他の再現研究は行われませんでした。

CCI損傷は、P5518で成体雄および雌マウスに対して実施された。 簡単に説明すると、マウスを 2% イソフルラン吸入によって麻酔し、特注の定位固定フレームに配置しました。 正中線切開によって頭蓋骨を露出させ、矢状縫合線の約 1 mm 外側、ブレグマとラムダの間の中心に 4 ～ 5 mm の開頭術を施しました。 頭蓋骨は、下にある硬膜を損傷することなく除去されました。 挫傷装置は、直径 3 mm の面取りされたステンレス鋼の先端が取り付けられたコンピュータ制御の空気圧駆動インパクターで構成されていました (Precision Systems and Instrumentation; TBI-0310)。 脳損傷は、この装置を使用して、3.5 m s-1 の速度および 500 ms の継続時間で皮質を 1.0 mm の深さまで圧縮するために送達されました。 頭蓋骨を交換せずに切開部を縫合し、動物を加熱パッド上で回復させた。 定性的な術後の健康評価は、外傷性脳損傷後 7 日間は毎日、その後は定期的に実施されました。 手術を受けたすべての動物は、手術時および24時間後に塩酸ブプレノルフィン(Buprenex; 0.05 mg/kg、腹腔内投与)で治療された。 脳に損傷を負ったマウスはすべて生存し、実験当日まで健康を維持した。

1.2 × 1013 ゲノム コピー/mL の力価の AAV8-hSyn-FLEX-TVA-P2A-GFP-2A-oG をソーク研究所の GT3 Core Facility から入手し、力価 2.4 × 1011 ゲノム コピー/mL に希釈しました。トレース性能の低下を防ぐために、使用前に滅菌 0.9% NaCl を注入してください86。 RVΔG-mCherry は前述のとおり 87、5 × 109 感染単位/mL の力価で生成されました。 ウイルスを面取りガラスマイクロピペット (先端直径 40 μm、Wiretol 5 μl、Drummond Scientific) にフロントローディングし、無傷の対照マウスと脳損傷マウスの成体に 15 nL/min の速度で注射し、針は所定の位置に残しました。撤回前に 5 分間。 標的座標は、理想的な標的位置（例えば肺門）と、近くの領域に漏れることなく肺門またはPFCに送達できるウイルスの力価と体積を決定するために、対照マウスおよび脳損傷マウスへの一連の予備注射研究で最初に検証された。 ＡＡＶ注射（２００ｎＬ）を、以下の定位座標で歯状回の門に行った：前部−後部（ＡＰ）−２．０ｍｍ、内側−外側（ＭＬ）１．３０ｍｍ、背側−腹側（ＤＶ）−１．９ｍｍ。 動物の別のコホートでは、注射を辺縁前皮質に行った:AP 1.8 mm、ML 0.35 mmおよびDV -1.4 mm。 RVΔG-mCherry (100nL) を 3 週間後に同じ場所に注射しました。

マウスに、１μＬ／ｍＬの１０ｍｇ／ｍＬヘパリンナトリウム（Ｓｅｒｖａカタログ番号２４５９０．０１）を含有する０．１Ｍ ＰＢＳ、続いて０．１Ｍ ＰＢＳ中の４％ＰＦＡを経心的に灌流した。 サンプルを 0.1 M PBS 中の 4% PFA 中で一晩後固定しました。 その後のステップは、各溶液に 0.01% アジ化ナトリウムを加えた 5 mL 遠心分離管 (Eppendorf カタログ番号 0030119401) で実行されました。 まず、サンプルを 10% 3-[(3-コールアミドプロピル)ジメチルアンモニオ]-1-プロパンスルホネート (CHAPS、Anatrace カタログ番号 C316S) および 25% N-メチル ジエタノールアミン (MDEA、Alfa-Aesar カタログ番号 L15712) で脱色しました。 ）0.1 M PBS中で37℃で48時間、章動を伴います。 次に、サンプルを 0.1 M PBS で 24 時間洗浄し、メタノール/水の勾配 (20%、40%、60%、80%、100%、100%) でそれぞれ 1 時間脱水し、2:1 DCM で脱脂しました。 MeOHを一晩。 翌日、サンプルを 100% MeOH で 4 時間 2 回洗浄して DCM:MeOH を除去し、振盪せずに 80% MeOH 中の 5% H2O2 中で 4 °C で一晩漂白しました。 次にサンプルを 60% MeOH、40% MeOH、20% MeOH、0.1 M PBS および PTx.2 で 1 時間再水和し、4 M 塩酸グアニジン (Alfa-Aesar カタログ番号 A13543-30) および 1% CHAPS 中でインキュベートしました。 ０．１Ｍ ＰＢＳ中で２４時間洗浄し、溶液を３回交換しながら０．１Ｍ ＰＢＳ中で一晩洗浄した。 次に、サンプルを 0.1 M PBS 中の 10% CHAPS/25% MDEA 中で章動を伴って 37 °C で一晩透過処理し、PTx.2 中の 3% NDS/10% DMSO 中で章動を伴って 37 °C で一晩インキュベートしました。 一次抗体のインキュベーションは、0.25% CHAPS、3% NDS、ウサギ抗 DsRed (1:1000) およびニワトリ抗 GFP 抗体 (1:1000) を含む 0.2% Tween-20 (PTwH) を含むヘパリン添加 0.1 M PBS 中で 7 分間実施しました。 37℃で章動ありの日。 次に、サンプルを PTwH 中でオービタルシェーカー (115 RPM) 上で室温で 5 回溶液を交換しながら一晩洗浄しました。 二次抗体希釈液は、0.25% CHAPS、ロバ抗ウサギ 546 (1:1000)、およびヤギ抗ニワトリ 647 (1:1000) を含む PTwH で調製し、0.2 μm でシリンジろ過し、洗浄前に章動させながら 37 °C で 7 日間インキュベートしました。 PTwH中で一晩溶液を5回交換し、室温で振盪した。 翌日、サンプルをメタノール/水の勾配を増加させて（20%、40%、60%、80%、100%、各 1 時間）脱水し、100% MeOH 中で 4 °C で一晩放置しました。 次にサンプルを 2:1 DCM/MeOH で 3 時間洗浄し、続いて 100% DCM で各 15 分間 2 回洗浄し、ジベンジルエーテル (DBE) で 4 °C で一晩洗浄しました。 屈折率を一致させるために、イメージングの前に DBE をさらに 4 回変更しました。 全脳免疫染色の段階的なプロトコルは、https://github.com/roberthuntlab/clearedbrainanalysis でご覧いただけます。

透明なサンプルを、屈折率マッチングに使用したのと同じロットの DBE ソリューションを含む特注のイメージング チャンバー内の 3D プリントされたサンプル ホルダーにマウントし、Zeiss Zen ソフトウェアを備えた Zeiss Z1 ライトシート顕微鏡を使用してイメージングしました。 サンプルは、x5/0.1照明対物レンズとx5/0.16検出対物レンズを使用し、4.97μmステップサイズで0.91μm/ピクセル解像度で片面照明で矢状方向に画像化されました。 mCherry 標識入力ニューロンは、575 ～ 625 nm BP フィルターに接続された 561 nm レーザーを使用して画像化されました。 GFP および自己蛍光チャネルは、505 ～ 545 nm BP および 660 nm LP フィルターに結合された 488 nm および 638 nm レーザーラインで同時に取得されました。 レーザー出力は、200 ms 露光ですべてのレーザー ラインの強度 40% に設定されました。 タイルのオーバーラップは 8% に設定されました。

生データ (.czi) は、Imaris File Converter 9.1 (Bitplane) を使用して階層形式 (.ims) に変換されました。 561 nm チャネル データは、各次元で 2 の係数でダウンサンプリングされ、カスタム Python スクリプトを使用して numpy 配列 (.npy) としてエクスポートされました。 個々のタイルは、WoblyStitcher88 を使用して非剛体的にステッチされました。 ステッチされたアレイは、動物ごとに決定されたバックグラウンド減算値を含む .tif シリーズとしてエクスポートされました。 個々のセルの位置は、cellfinder33 を使用して手動で注釈が付けられました。 画像スタックは解像度 10 μm までダウンサンプリングされ、aMAP90 の Python ポートである Brainreg を使用して Allen Reference Atlas89 に登録されました。 アトラスの境界は、イメージ J の元の高解像度イメージにアップサンプリングされ、セルを含むイメージ プレーンの精度が検査されました。 全脳の位置合わせエラーを修正するために、アトラスの境界が解剖学的ランドマークから分岐する箇所に対応点のペアを手動でマークしました。 平均ベクトル長が計算され、注釈付きセル位置が対応点ベクトル長に基づいて線形変換されました。 スターター細胞と入力ニューロンの解剖学的位置の概略図は、brainrender32 を使用してプロットされました。 冠状アトラスプレートは、前軸/後軸に沿った選択された位置でレンダリングされ、個々の細胞の位置は選択されたアトラスプレートに対して±125μm(海馬トレース)または±50μm(PFCトレース)でした。

各動物の登録された細胞の位置は、cellfinder33 を使用して要約されました。 細胞数は、積層皮質構造について結合されました。 同側および対側の細胞数を別個の領域として分析した。 1 つの無傷の対照 (海馬注射) では、少数の狂犬病標識細胞が、上層の新皮質の注射管の近くで見つかりました。 これらの細胞は、ウイルスの経シナプス拡散ではなく、針注射によって標識されたため、分析から除外されました。 定量化に使用される個々の脳領域と、Allen CCF アトラス内のその略語は、補足データ 2 に提供されています。ユークリッド距離の計算では、登録された各スターター セルのアトラス座標を平均し、結果を最も近い値に四捨五入することによってスターター セルの重心が計算されました。整数。 次の式を使用して、スターター セルの中心と各シナプス前入力ニューロンの位置の間の 3 次元ユークリッド距離を計算しました。

ここで、(x2,y2,z2) はスターターセル中心の AP、ML、DV を表し、(x1,y1,z1) は登録された各シナプス前セル位置の AP、ML、DV を表し、d は計算された距離の長さを表します。ベクター。 AP および DV 距離の分析では、細胞数を 200 μm 間隔でビン化し、各動物の総細胞数に正規化しました。 ML 距離の分析では、細胞数を 100 μm でビン分けして、各半球に偶数のビンを作成しました。 ガウス カーネル密度の推定値は Seaborn Python スクリプトを使用して計算され、帯域幅は 0.5 に設定されました。

透明なサンプルを DBE から取り出し、DCM で 15 分間 2 回洗浄し、その後 2:1 DCM/MeOH で一晩インキュベートしました。 次いで、サンプルを、室温でオービタルシェーカー（115 RPM）上で、100%、80%、60%、40%、20% MeOH/水および 0.1 M PBS でそれぞれ 1 時間再水和しました。 自由浮遊ビブラトーム切片 (50 μm) を、0.05% Triton-X を含む 0.1 M PBS 中で室温でビブラトームを使用して切断しました。 リバースクリアの段階的なプロトコルは、https://github.com/roberthuntlab/clearedbrainanalysis でご覧いただけます。

マウスに 4% パラホルムアルデヒド (v/v) を経心臓的に灌流し、標準的な免疫染色​​手順を使用して自由浮遊ビブラトーム切片 (50 μm) を処理しました 51。 一次抗体は次のとおりです: ニワトリ抗緑色蛍光タンパク質 (GFP; 1:1000; Aves、カタログ番号 GFP1020)、ニワトリ抗 mCherry (1:1000; Abcam、カタログ番号 ab205402)、ヤギ抗コリン アセチルトランスフェラーゼ ( CHAT; 1:500; Millipore、カタログ番号 AB144P)、マウス抗リーリン (1:500; Millipore、カタログ番号 MAB5364、クローン G10)、ウサギ抗 DsRed (1:1000; Clontech、カタログ番号 632496) 、ウサギ抗ソマトスタチン（SST; 1:200; Santa Cruz、カタログ番号 SC-7819）およびウサギ抗 WFS1（1:1000; Protein Tech、カタログ番号 11558-1-AP）。 すべての抗体は、脳の免疫染色分析に以前に使用されています。 二次抗体 (1:1000、Life Technologies) には、ニワトリ IgG に対する Alexa 488 結合ヤギ抗体 (カタログ番号 A11039)、マウス IgG に対するヤギ抗体 (カタログ番号 A11029)、ヤギ IgG に対するロバ抗体 (カタログ番号 A11029) を使用しました。カタログ番号 A11055); Alexa 546 結合ウサギ IgG に対するヤギ抗体 (カタログ番号 A11035)、ウサギ IgG に対するロバ抗体 (カタログ番号 A10040)、Alexa 594 – ヤギ IgG に対するロバ抗体 (カタログ番号 A11058)、および Alexa 647 – 結合ニワトリ IgG に対するヤギ抗体 (カタログ番号 A32933)。 次いで、切片を、ＤＡＰＩを含むＦｌｕｏｒｏｍｏｕｎｔ－Ｇを用いて荷電スライド（Ｓｕｐｅｒｆｒｏｓｔ ｐｌｕｓ、Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）上にマウントした。 共焦点画像は、Olympus FV3000 レーザー走査型顕微鏡を使用して取得しました。 落射蛍光画像は、Leica LAS X ソフトウェアを備えた Leica DM6 顕微鏡を使用して取得しました。 必要に応じて、Image J を使用して明るさとコントラストを手動で調整しました。

蛍光標識切片 (50 μm) は、10 倍または 20 倍の対物レンズを備えた Leica DM6 顕微鏡、または 20 倍または 40 倍の対物レンズを備えたオリンパス FV3000 共焦点顕微鏡を使用して画像化され、FIJI (ImageJ)51 を使用して計数されました。 蛍光マーカーを発現したすべての細胞を、脳全体の 6 切片ごと (つまり、300 μm 間隔) で計数しました。 標識細胞を含むすべての切片を動物ごとに分析し、値を平均して平均細胞密度 (細胞/mm2) を求めました。

マウスに 4% パラホルムアルデヒド (v/v) を経心臓的に灌流し、製造者の指示に従って、浮遊ビブラトーム切片 (50 μm) をフルオロジェイド C 染色のために処理しました 91。 簡単に説明すると、脳切片をゼラチンでコーティングしたスライド上で 50 °C で 30 分間乾燥させました。 スライドを、80% エタノール中の 1% NaOH に 5 分間、70% エタノールに 2 分間、dH2O に 2 分間、0.06% 過マンガン酸カリウムに 10 分間、dH2O に 2 分間、0.00015% フルオロジェイド C (Histo-Chem Ｉｎｃ．、カタログ番号１ＦＪＣ）および０．１％酢酸中の０．０００１％ＤＡＰＩで１０分間洗浄し、続いてｄＨ２Ｏでそれぞれ１分間３回洗浄した。 次いで、スライドを５０℃で５分間乾燥させ、キシレンで透明にしてから、Ｅｕｋｉｔｔ封入剤（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号０３９８９）でカバースリップをかけた。

MGE の心室層と心室下層を E13.5 の胚から採取しました。 精子プラグが検出された時点をE0.5とみなした。 胚性 MGE 外植片を Leibovitz L-15 培地中で解剖し、L-15 培地中でピペッティングを繰り返すことによって機械的に解離させ、遠心分離 (600 × g で 3 分間) によって濃縮しました。 濃縮された細胞懸濁液を、面取りガラスマイクロピペット（先端直径50μm、Wiretol 5μl、Drummond Scientific）にフロントロードし、CCI損傷の7日後に成体脳損傷マウスの海馬に注入しました（注入あたり3×104細胞）。 細胞注入は、次の定位座標:AP -2.0 mm、ML 2.45 mm、DV -1.8 mmでCA3サブフィールドの放射状層に行われました。

すべての統計テストは、Graphpad Prism 9、R、および Microsoft Excel を使用して実行されました。 サンプルサイズは以前の出版物に基づいています38、47、92。 全脳定量分析の場合、各異なる脳領域の入力ニューロンの数は、全脳で検出された入力ニューロンの総数 (% 入力) またはスターター細胞の総数 (収束指数) に対して正規化されました。 データは、両側スチューデント t 検定、一元配置分散分析の後に多重比較のためのテューキーの事後検定、二元配置分散分析の後に多重比較のためのテューキーの事後検定、二元配置の反復測定分散分析によって比較されました。ボンフェローニの事後検定、カイ二乗分析、またはフィッシャーの直接確率検定による。 UMAP分析およびピアソン相関はRで計算した。データは、特に指定しない限り、平均±SEM、n =動物として表し、有意性はP < 0.05に設定した。 統計テストと結果の完全なリストについては、補足データ 1 ～ 9 およびソース データを参照してください。

研究デザインの詳細については、この記事にリンクされている Nature Research レポートの概要をご覧ください。

この研究で生成されたすべてのデータは、補足情報およびソース データ ファイルで提供されます。 ソースデータはこのペーパーに付属しています。

カスタム Python スクリプトは、https://github.com/roberthuntlab/cleardbrainanalysis から入手できます。

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この研究は、国立衛生研究所の助成金 R01–NS096012 (RFH)、F31–NS106806 (JCF)、および R01–EY024890 (DCL)、UCI Summer Undergraduate Research Program (SURP) (SP および QC) からのフェローシップによって支援されました。 ）および発生生物学センターの光学生物学コア施設へのアクセスによって部分的に可能になりました。この施設は、がんセンター支援助成金（CA-62203）および複雑生物システムセンター支援助成金（GM-076516）によってサポートされる共有リソースです。カリフォルニア大学アーバイン校。 この研究は、NIH-NCI CCSG: P30-014195、NINDS R24 Core Grant、および NEI からの資金提供により、ソーク研究所の GT3 Core Facility によっても支援されました。 この原稿の以前のバージョンについて有益な議論とコメントをくれた Charles Ribak 博士とハント研究室のメンバーに感謝します。

Jan C. Frankowski、Alexa Tierno などの著者も同様に貢献しました。

カリフォルニア大学解剖学および神経生物学部、アーバイン、カリフォルニア州、92697、米国

ヤン・C・フランコウスキー、アレクサ・テンダー、シュレヤ・パヴァーニ、クインシー・カオ、デヴィッド・C・ライアン、ロバート・F・ハント

カリフォルニア大学てんかん研究センター、アーバイン、カリフォルニア州、92697、米国

ロバート・F・ハント

スーおよびビル グロス幹細胞研究センター、カリフォルニア大学、アーバイン、カリフォルニア州、92697、米国

ロバート・F・ハント

学習と記憶の神経生物学センター、カリフォルニア大学アーバイン、アーバイン、カリフォルニア州、92697、米国

ロバート・F・ハント

神経回路マッピングセンター、カリフォルニア大学アーバイン、アーバイン、カリフォルニア州、92697、米国

ロバート・F・ハント

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JCF と AT は同等の貢献をしており、これらの著者はアルファベット順にリストされています。 JCF は免疫染色、iDISCO+ 脳浄化、共焦点およびライトシートイメージングを実施しました。 Python コードを書きました。 細胞数の定量化と初期データ分析を実行しました。 フェローシップ資金を寄付し、手法の一部と初期数値の草稿を書きました。 AT は免疫染色、共焦点およびライトシートイメージングを実行しました。 編集された Python コード。 細胞数の定量化と最終データ分析を実行しました。 ソースデータ、最終的な図を組み立て、原稿を編集しました。 SP は組織学、データ分析を実行し、原稿を編集しました。 QCはデータ分析と原稿編集を行いました。 DCLは資金提供、狂犬病ウイルス対策、原稿編集を行った。 RFH は、すべての実験のコンセプト、設計、実行、分析に貢献し、資金を提供し、原稿を執筆しました。

Alexa Tender または Robert F. Hunt への通信。

著者らは競合する利害関係を宣言していません。

Nature Communications は、この研究の査読に貢献してくれた MacKenzie Howard、Chris Dulla、およびその他の匿名の査読者に感謝します。

発行者注記 Springer Nature は、発行された地図および所属機関の管轄権の主張に関して中立を保っています。

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転載と許可

フランコウスキー、JC、テンダー、A、パヴァーニ、S 他外傷性脳損傷後の脳全体の抑制回路の再構築。 Nat Commun 13、3417 (2022)。 https://doi.org/10.1038/s41467-022-31072-2

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受信日: 2021 年 11 月 11 日

受理日: 2022 年 5 月 31 日

公開日: 2022 年 6 月 14 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-022-31072-2

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