de novo神経伝達物質合成によるシナプス形成の誘導 | 吉林省パッチケーブルグループ

Nature Communications volume 13、記事番号: 3060 (2022) この記事を引用

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211 オルトメトリック

メトリクスの詳細

神経科学における重要な問題は、ニューロンがどのようにしてシナプス後構造をシナプス前放出部位と整列させるかということです。シナプス接着タンパク質がこのプロセスに関与していることが知られていますが、神経伝達物質の役割は不明のままです。今回我々は、非標準的伝達物質の新たな生合成と小胞放出が、それに対応するポストシナプスの構築を促進できるかどうかを調べる。我々は、幹細胞由来のヒトニューロンと純粋にグルタミン酸作動性のin vivoマウスニューロンの両方において、GABA合成酵素と小胞トランスポーターの異所性発現が周囲のグルタミン酸からGABAを生成し、それをシナプス前末端から伝達するのに十分であることを実証する。これにより、シナプス後 GABAA 受容体の効率的な蓄積と一貫した活性化が可能になり、グルタミン酸作動性の対応物とは独立して並行して動作する、完全に機能する GABA 作動性シナプスが生成されます。これらの発見は、神経伝達物質のシナプス前放出自体が、関連するシナプス後装置の組織化に信号を送り、これを直接改変してニューロンのシナプスアイデンティティを再プログラムできる可能性があることを示唆している。

ニューロンは、シナプスと呼ばれる特殊な構造を介して相互に通信します。シナプスがどのようにアイデンティティを確立し維持するのかは、ほとんど不明のままです。一説によれば、シナプス細胞接着分子（SAM）は、シナプス前成分とシナプス後成分の間のトランスシナプス相互作用を促進することによってシナプス形成を引き起こします1、2、3。この仮説を裏付けるように、SAM の異所性発現は、ニューロンと非ニューロン細胞の両方でそれぞれシナプス形成を増強または誘導する可能性があります 4、5、6、7。さらに、一部の SAM の個々の遺伝子欠失も、シナプス集合を完全に排除するわけではないものの、さまざまな程度でシナプス数を減少させることも報告されています 8,9,10。

興味深いことに、これらの少数の例にもかかわらず、大多数の SAM の構成的または条件的ノックアウト (KO) モデルは、シナプス形成における大規模な障害を示さず、その機能的成熟にのみ影響を及ぼします。時間の経過に伴うシナプス11、12、13、14、15。さらに、いくつかのシナプス後SAMはグルタミン酸作動性またはγ-アミノ酪酸（GABA）作動性の主要シナプスに特異的に局在しており、同様に共通のシナプス前結合パートナーと相互作用することが多いため、SAM依存性のメカニズムはさまざまな種類のシナプスの生成をまだ説明できていない。両方のシナプスタイプに分布しています16、17、18。したがって、シナプス形成および相補的シナプス装置の信頼できる整列には、SAM以外の代替細胞シグナルが主にまたは同時に必要とされる可能性がある。

シナプス形成の 2 番目のモデルは、神経伝達物質の放出がこのプロセスを直接調節できることを示唆しています。シナプス前終末で生成されるさまざまな伝達物質に応答して、シナプス後コンパートメントは、シナプスに機能的特性を与える異なるクラスの受容体を動員します。この理論は、GABAA 受容体 (GABAAR) の欠失により、GABA 作動性シナプスのサブセットの形態と標的特異性の両方が損なわれる可能性があることを示す研究によってさらに強化されます 19,20。伝達物質依存性のシナプス後配置に関する追加の証拠は、単一のニューロン内で合成された異なる共伝達物質が、異なるシナプス後細胞集団と接触する独立したシナプス前末端にしばしば分離される可能性があるという最近の観察から得られている21、22、23。さらに、一部のニューロンは活動に依存して伝達物質の種類を切り替えることさえでき、これによりシナプス後部の対応する受容体レベルと組成が変化します 24,25。

おそらく、伝達物質誘導性シナプス形成について最も説得力のあるケースは、樹状枝近くの「ケージド」グルタミン酸と GABA の急速な光分解がシナプス後受容体と足場タンパク質の局所的蓄積を引き起こし、最終的には未熟なシナプス形成を引き起こし、最終的にはシナプス形成に統合される可能性があることを実証した 2 つの独創的な研究から明らかです。既存の神経回路26,27。この現象は、幅広い年齢範囲の動物のさまざまな脳領域に存在するさまざまな神経サブタイプでも再現されることに成功しました 28、29、30。しかし、(i) 生理学的に関連するシナプス前神経伝達物質の放出中にそのようなメカニズムが機能するかどうか、(ii) これらの伝達物質によって誘導された初期シナプスがさらに形態学的および/または機能的成熟を起こすかどうか、(iii) ニューロン自体の伝達物質の正体が不明であるかどうかは依然として不明である。 (iv) 放出される神経伝達物質の変化が異なる種類のシナプスの生成に直接つながる可能性があるかどうか、(v) これらの伝達物質誘導性シナプスが生体内、特に生きた動物でも発達する可能性があるかどうか。これらの疑問に取り組むことで、シナプスがどのように形成され、そのアイデンティティを獲得するかの基本原理を理解できるかもしれません。

この現在の研究では、外因性シナプス前酵素と小胞輸送体の異所性発現が、系統決定ニューロンにおける代替伝達物質の生合成とシナプス放出の両方を促進し、異なるニューロンの機能的なシナプス後形成を開始できるかどうかを判断することに着手しました。親切。我々は、vGAT、GAD65、GAD67の3つのタンパク質を組み合わせて過剰発現させると、グルタミン酸作動性ニューロンのみからでもGABAを適切に合成して伝達でき、これが形態学的および機能的に成熟したGABA作動性出力シナプスの効率的な産生を誘発することを、in vitroおよびin vivoの両方で発見した。。

我々はまず、グルタミン酸作動性ニューロンがどのようにしてシナプス出力における伝達物質のアイデンティティを保護し、他の仕様、例えばGABA作動性プログラムを阻止するかを理解することを目的とした。この目的を達成するために、我々は、単一の転写因子ニューロゲニン-2（すなわち、Ngn2、図1a）の強制発現によってヒト胚性幹（ES、例えばH1系）細胞から純粋なグルタミン酸作動性ニューロンを迅速に生成する、以前に確立されたモデルシステムを採用した31。。誘導後約56〜60日目の電圧クランプ記録（保持電位、Vhold = -70 mV）により、ネットワーク活動が繰り返される強力な自発シナプス後電流（sPSC）が検出されました（補足図S2a）。これらのシナプス現象は、AMPA 受容体 (AMPAR) アンタゴニストであるシアンキキサリン (CNQX) の急性適用によって容易に無効化できるが、GABAAR アンタゴニストであるピクロトキシン (PTX) によっては無効にできないため、主に興奮性 sPSC (つまり sEPSC) で構成されており、Ngn2-ニューロンには、シナプス後GABAAR、シナプス前GABA放出、またはその両方が欠如しています（補足図S1a）。ただし、同じ実験条件下での外因性アゴニストのパフ灌流により、AMPARに加えて完全に機能的でPTX感受性のGABAARの存在が明らかになり、これらのニューロンはグルタミン酸のみを伝達し、シナプス前終末からGABAは伝達しない可能性が高いことを示しました（補足図S1b）。。

a vGAT、GAD65、および/または GAD67 をコードする追加ウイルスを同時感染させたレンチウイルス Ngn2 発現によって、H1-ES 細胞で神経新生が誘導されました。ニューロンをマウスのグリアと共培養し、56 ～ 60 日目に分析しました。 b V57因子を同時導入し、MAP2、シナプシンについて免疫標識し、核DAPIについて染色したNgn2誘導ヒトニューロン(シアン色の矢頭)の画像例(白色の矢頭)。 MAP2 陰性および DAPI 染色された集団は、共培養されたマウスグリア細胞を示します。挿入図、右側の点線ボックスの拡大図。 c、d 示された条件cから記録されたsPSCのサンプルトレース、および速いイベントと遅いイベント（青と赤の矢印）のτ崩壊の正規化された累積頻度d。 dの挿入図は、コントロール（上）とV57（下）の、スケーリングされ重ねられた10個のsPSC（明るい影）と対応する平均値（暗い影）の波形例です。 e、f 発現するヒトニューロンから記録された、速い（e、τ減衰<10ミリ秒）対遅い（f、τ減衰>10ミリ秒）減衰速度のsPSCイベントの平均周波数（左）と振幅（右）。示された因子の組み合わせ。 g、h PTXおよび/またはCNQXによる急性治療前（Ctrl）および後（注釈付き）、V57因子を共発現するNgn2ニューロンから記録されたsPSCの代表的なトレースgおよびτ崩壊hの累積ヒストグラムh。わかりました。阻害剤、PTX、CNQX、またはその両方の非存在下 (Ctrl) または存在下で測定した、sPSC 半幅 (i)、振幅 (j)、およびイベント頻度 (k) の累積確率 (左) と平均値 (右) PTX + CNQX。すべてのデータは、パッチされた細胞数/独立したバッチの平均値 ± SEM として表示されます。個々のデータポイントは、色が一致した白丸として提供されます。パネル e、f については、ボンフェローニ補正を使用した事後ノンパラメトリックマンホイットニー U 検定と組み合わせたクラスカルウォリス検定によって統計的有意性を評価しました (ソースデータを参照)。 i、j、k について、統計的有意性は対応のない両側スチューデント t 検定によって重み付けされ、***P < 0.005 であったため、歪度および尖度の値 (-2 >≈ および ≈ < 2) は正規分布を示唆しました。 **P < 0.01; *P < 0.05; ns = 有意ではない、P > 0.05。パネル k の複数のグループは、事後 Tukey-Kramer 検定と組み合わせた分散分析 (一元配置 ANOVA) によっても比較され、対応する P 値が報告されました。

GABA作動性神経伝達に必須であるが、Ngn2のみの細胞では欠落している可能性があるシナプス前部またはシナプス後部の機械を同定するために、次に、我々が以前に得たRNA配列結果を検査した32。さまざまなGABAARサブユニット、および主要な抑制性シナプス後足場分子（ゲフィリンやコリービスチンなど）の存在に気づきましたが、グルタミン酸デカルボキシラーゼ（つまり、GAD65およびGAD67）または小胞性GABAトランスポーター（vGAT）の発現は最小限のみでした（補足図S1c）。）。ただし、これらの細胞は、グルタミン酸生合成と小胞負荷の両方に関連する酵素（つまり、グルタミナーゼとvGLUT1 / 2）の実質的な発現を示し、それらのグルタミン酸作動性の同一性を再度確認しました（補足図S1c）。したがって、シナプス後細胞集団には機能的な GABAAR 構築に必要な成分が含まれている可能性がありますが、Ngn2 ニューロンには GABA 合成と小胞伝達のためのシナプス前酵素がほとんど欠如しています。

次に、グルタミン酸作動性 Ngn2 細胞における GAD65、GAD67、および/または vGAT の強制発現が、周囲のグルタミン酸から GABA を合成し、その後の放出のためにそれをシナプス小胞にパッケージングできるかどうかを調べました。ヒトシナプシン-1プロモーターの下でGAD65、GAD67、およびvGATをコードするヒトcDNAをクローニングし、その構築物からレンチウイルス粒子を作成し、それらをNgn2ニューロンに同時感染させました（図1a）。誘導後56〜60日目に、樹状MAP2およびシナプスマーカーシナプシンの免疫染色により、実質的なシナプス形成が明らかになりました（図1b）。興味深いことに、GAD65 + vGAT または GAD67 + vGAT を共発現するニューロンからの電気生理学的記録では、どちらの因子も単独ではありませんが、振幅に影響を与えることなく、速いτ減衰を伴う sPSC の頻度が大幅に減少し、同時に sPSC の頻度と振幅の両方が増加しました。 Ngn2 のみのニューロンにはほとんど存在しなかった遅いτ減衰（図 1c–f）。したがって、GABA合成酵素とGABA小胞輸送体を共発現させると、典型的なEPSCとは異なる性質を持つ可能性が高いsPSCイベントが生成された。観察された最大の効果は、vGAT + GAD65 + GAD67の組み合わせ（以下、V57と呼ばれます、補足図S2b）でした。

速いτ減衰と遅いτ減衰を伴う sPSC イベントの同一性を決定するために、次に、V57 因子を共発現する Ngn2 細胞に受容体遮断薬を適用しました。 CNQX対PTXの急性治療は、より小さい半値幅とより大きい半値幅を持つ高速sPSCと低速sPSCをそれぞれ選択的かつ予防し、それらが対応して興奮性対抑制性のシナプス電流を表すことを示唆しています（つまり、EPSC対IPSC;図1g–i））。自発的IPSCはかなり異なる平均振幅を示し、EPSCとは独立して阻害でき、PTX + CNQXの両方の適用のみであり、どちらの薬剤単独でもすべてのsPSCイベントを排除することはできませんでした（図1j、k）。これらの結果は、V57 因子がヒトのグルタミン酸作動性ニューロンにおける機能的な GABA 作動性出力の形成を首尾よく促進できることを示しています。

sPSC は、活動電位 (AP) に依存しないミニチュアシナプス後電流 (mPSC) と AP に依存するネットワーク活動の両方の混合物である可能性があるため、V57 誘発 GABA 放出におけるそれらの相対的な寄与をさらに特徴付けることを試みました。電流クランプモードでは、V57を共発現するNgn2ニューロン（NV57と呼ぶ）は反復的なベースラインAPを示し、これはテトロドトキシン（TTX）によって容易に消失し、APに依存しない本物の小型シナプス後電位（すなわち、mPSP）を示す閾値下の脱分極を明らかにした。 .2a、b)。したがって、電圧クランプ記録では、急性TTX適用により高速sPSCと低速sPSCの両方の振幅と周波数が効果的に減少しましたが、すべてのイベントが完全に排除されたわけではありません（図2c〜e）。連続したCNQX治療により、AMPAR媒介性の高速興奮性mEPSCが廃止され、より遅いτ減衰とより広い半値幅を備えたTTX非感受性のGABAAR駆動抑制性mIPSCが共存することが示され、結果的にPTX治療によって沈黙させることができました（図2f） –h)。したがって、V57 誘導シナプス前終末は、AP 依存性と AP 非依存性の両方の様式で自発的な GABA 放出を示し、シナプス後 GABAAR を活性化することに成功しました。

a TTX の非存在下 (Ctrl、左) または TTX の存在下 (右) における自発 AP の電流クランプ記録。挿入図は、AP (黒のアスタリスク) または閾値下の脱分極 (紫のアスタリスク) を含むボックス領域の拡大領域です。 b TTX なし (Ctrl) または TTX ありの自発的 AP (左) または完全な脱分極 (右) の平均頻度。 c. Ctrl条件対TTXの急性治療からの電圧クランプモードで記録されたsPSCの代表的なトレース（以下で拡大された四角で囲まれた領域）。矢印は速い（青）対遅い（赤）τ減衰のイベントを指しています。 d、e sEPSC d または sIPSC e のイベント振幅 (左) と周波数 (右) の確率プロットと平均。 f TTX のみの存在下 (Ctrl)、または CNQX、PTX、または両方の併用後 (CNQX + PTX) に記録された mPSC の代表的なトレース。矢印は、高速 EPSC (青) と低速 IPSC (赤) イベントを示します。 g、h ミニチュア PSC イベント g の正規化されたτ減衰周波数。挿入図 = 10 個の重ね合わせたサンプルトレース (明るい色合い) と、それらの対応する平均を重ね合わせたもの (暗い色合い)。イベント半幅の累積確率プロットと概要グラフ h、PTX 耐性 mEPSC (青) 対 CNQX 耐性 mIPSC (赤)。 i 示された条件から記録された、3 回以上の連続シナプス前パルスによって誘発された PSC の代表的な波形 (左、矢印で置き換えられた刺激アーティファクト)、平均振幅 (中央)、および CV (右) を重ね合わせたもの。 j パルス列（矢印）によって誘発されたEPSCおよびIPSCのトレースの例（左）。挿入図は、Δt = 50 ms のシナプス前入力の連続したペア刺激であり、平均トレース (暗い色合い) を伴う重ね合わせ試行 (6 つの連続したペアパルス、明るい色合い) として表示されます。すべての PSC 振幅は、対応する最初のパルスに正規化されています (右)。 EPSC と IPSC は両方とも重大なシナプス抑制を示しましたが、おそらくシナプス後 AMPAR と GABAAR の脱感作および/または飽和の程度が異なるため、程度が異なり、したがって、シナプス前放出確率の代用として直接比較することはできませんでした。すべての数値データは平均値 ± SEM であり、記録/実験バッチのニューロンの総数、および白丸としてプロットされたデータポイントを伴います。統計的有意性は、対応のない両側スチューデント t 検定 (歪度と尖度値 −2 > ≈ および ≈ < 2)、または両側ノンパラメトリックマンホイットニー U 検定のいずれかによって ***P < について評価されました。 0.005; *P < 0.05; ns = 有意ではない、P > 0.05。複数のグループを一元配置分散分析 (i、P 値付き) によって比較しました。

GABAが大規模なシナプス前活動によって放出されるかどうかを調べるために、電場電極でニューロンを刺激し、誘発されたPSCを測定しました。もう一度、急性CNQX適用により、誘発EPSCの変動係数（CV）と同等の変動係数（CV）を有する顕著な誘発IPSC成分の存在が検出されましたが、これはその後PTX処理によって廃止することができました（図2i）。さらに、一連の高周波刺激または反復的なパルスペアによって活性化されると、これらの誘発されたIPSCは、誘発されたEPSCでも観察されたように、強いシナプス抑制を伴う古典的な短期可塑性を特徴としました（図2j）。したがって、V57 誘発の非標準的な GABA 作動性シナプス前部は、Ngn2 ニューロンによって通常生成されるグルタミン酸作動性シナプス前部に匹敵する放出特性を獲得しました。これは、おそらく共通の放出機構の共有によるものと考えられます。

我々は、V57因子がNgn2細胞における新しいシナプス構造の形成を可能にするのか、それとも潜在的なグルタミン酸作動性シナプスをGABA作動性運命に改造するのかを調べた。それをテストするために、特定のシナプス前抗体で細胞を免疫染色しました（補足図S3a、b）。細胞密度または全体的な神経突起伸長の欠陥は検出されませんでした（補足図S4a-c）。 V57形質導入は、シナプシン抗体によって標識された総シナプスの数や形態を変化させず、密度を変えることなく、vGLUT陽性興奮性シナプス前サイズのわずかな増加のみを引き起こしました（図3a、b）。ただし、過剰発現したvGATおよびGAD65 / 67因子は主にクラスターパターンで組織され、樹状突起に沿った精巧な分布によって証明されるように、GABA作動性シナプス前部のサイズと数が大幅に増加しましたが、これはNgn2のみのニューロンには事実上存在しませんでした（図3c、d）。

a 汎シナプスマーカー Synapsin で免疫染色した Ngn2 のみニューロンと NV57 ニューロンのサンプル画像 (左)。樹状突起 MAP2 領域および涙点サイズによって正規化されたシナプシン涙点密度の平均値 (右)。 b – d グルタミン酸作動性シナプス前マーカー vGLUT b、および GABA 作動性シナプス前マーカー GAD65/GAD67 c、または vGAT を除く、a と同様の免疫染色。 e CtrlからのEGFP標識樹状枝（Ngn2のみ、上の行）とvGLUTおよびvGATで同時標識されたV57ニューロン（下の行）の代表的な画像（それぞれ黄色とシアンの矢印）。最大強度の Z 投影は、特に V57 条件における両方のシナプスタイプの複雑な分布を強調します。 f V57 条件の単一光学切片の超解像度画像 (左) は、vGLUT 信号と vGAT 信号の間の最小限の共局在を示しています。灰色の矢印は、x/z 軸または y/z 軸で分解された部分的に重なっている信号 (シアンの十字線) を指します。強度プロファイルは、関心領域 (黄色の点線) からの信号間のピーク分離を示します。 vGLUT と vGAT 間の共局在化のマンダー係数 (右) がプロットされました。 g、h a と同じですが、グルタミン酸作動性 (Homer、g) または GABA 作動性 (Gephyrin、h) シナプス後マーカーの場合。 i 特に V57 条件において、精巧なホーマーとゲフィリンプンクタが共存することを除いて、e と同じ。 j f と同じですが、シナプス後部のホーマーとゲフィリンの点については、同様に最小の共局在を示しています。棒グラフの平均値は、分析された/独立したバッチの視野数の平均 ± SEM を表します。個々のデータポイントは、色分けされた白丸として表示されます。統計的有意性は、対応のない両側スチューデント t 検定 (歪度および尖度値 -2 >≈ および ≈ < 2)、または両側ノンパラメトリックマンホイットニー U 検定 (ソースデータ) によって重み付けされ、* が付けられました。 **P < 0.005; **P < 0.01; *P < 0.05; ns = 有意ではない、P > 0.05。

特にV57細胞では、vGLUTおよびvGAT抗体との同時標識により、両方の涙点の複雑な共存が実証され、厚いz投影画像では時々重なって見えることがありました（図3e）。異なるアイデンティティのシナプスが同じシナプス前領域内に形成できるかどうかを調べるために、私たちは超解像度顕微鏡を利用しました。ほとんどの共陽性点には、主に異なる焦点面から発生したvGLUT信号とvGAT信号が含まれており、x / zまたはy / z次元でさらに分解できることがわかりました（補足図S5a）。より薄い単一の光学セクションをさらに分析すると、V57状態のシナプス涙点の大部分がvGLUTまたはvGAT信号のいずれかで構成されており、両方ではないことが示唆されました（図3f）。したがって、グルタミン酸作動性シナプス前シナプスと GABA 作動性シナプス前シナプスは、空間的に分離された放出部位をほとんど生成しました。

シナプス後組織への影響をさらに評価するために、グルタミン酸作動性およびGABA作動性シナプス後マーカー、たとえばホーマーおよびゲフィリンの分布を監視しました（補足図S3a、b）。我々は、V57共形質導入が、樹状突起セグメントとNgn2細胞の周囲領域の両方において、サイズに影響を与えることなく、ホーマー陽性涙点とゲフィリン陽性涙点の数をそれぞれ減少させ、増加させたことに気づきました（図3g、h、および図3g、h、および図3g、h、および図3g、h、および図3g、h、および補足図S6a)。 NV57ニューロンはまた、シナプス後ゲフィリンと、シナプス前vGATおよびGAD65 / 67涙点を備えた細胞表面GABAARクラスターとの間に実質的な並置を示した（補足図S6b–d）。 GABA作動性特徴の大幅な上昇を伴うシナプス仕様のこれらの再配置にもかかわらず（図3i）、V57条件は、ホーマークラスターとゲフィリンクラスターの間の限られた共局在を示し続け、異なる形状を特徴とし、異なる物理的位置を占めました（図3j、および補足）図S5b)。これらの結果は、V57 によって誘導されるシナプス前終末からの GABA 放出が、Ngn2 のみのニューロンですでに発現しているゲフィリンと GABAAR のシナプス後蓄積を増強する可能性があることを示唆しています。それにもかかわらず、これらの GABA 作動性シナプスは、グルタミン酸作動性シナプスとは別個に集合します。つまり、物理的に分離されます。

これらの誘導されたシナプスがどの程度早く形態学的同一性を獲得し、機能的特性を発達させるかを評価するために、さまざまな発生時点でNV57ニューロンを分析しました（図4a）。誘導後15〜60日目の間に、シナプシン免疫標識によって視覚化されたように、細胞は膜容量（Cm）の着実な増加、入力抵抗（Rm）の減少、および全体的なシナプス形成の増加とともに徐々に成熟しました（図4b、c）。。次に、グルタミン酸作動性シナプスと GABA 作動性シナプスの相対的な成熟動態を監視するために、パッチクランプ記録を行いました。 AMPAR媒介sEPSCとGABAAR媒介sIPSCの両方の頻度と振幅が、この期間中に周期的に増加したことに気づきました（図4d、e）。同様の成熟動態は、誘発された EPSC と IPSC の両方でも、強度と成功率の点で観察されました (図 4f、g)。一致して、vGLUT および vGAT 抗体による免疫染色でも、グルタミン酸作動性シナプスと GABA 作動性シナプスの両方が 15 日目には形成され始め、30 日目には増加し続けることが明らかになりました。これは、その密度とサイズが 45 ～ 60 日目頃に飽和する傾向があるためです (図 4h、図 4h、私）。さらに、60日目では、vGLUT対vGATクラスター、およびHomer対Gephyrinクラスターの両方が個別に総シナプシンシグナルの一部のみを占めており、これもまた、異なるアイデンティティのシナプスがほとんど分離されているという概念を裏付けています（図4j、k）。総合すると、これらの発見は、V57 誘導性 GABA 作動性シナプスがグルタミン酸作動性シナプスと同時に成熟するが、互いに独立して安定化することを示唆しています。

b – k の実験プロトコル。 Ngn2 誘導ヒトニューロンに、V57 因子を発現するウイルスをさらに感染させ、誘導後 15 日目から 60 日目まで 15 日ごとに分析しました。 b さまざまな時点での Cm (左) と Rm (右) 値の概要グラフニューロンの成熟。 c in vitro発達のさまざまな段階でNV57ニューロンから測定した、Tuj1陽性神経突起上に構成されたシナプシン点状の画像例（左）と平均密度またはサイズ（右）（注釈付きを参照）。 d、e 15〜60日目に、それぞれPTXおよびCNQXの存在下で記録されたAMPAR媒介sEPSC dおよびGABAAR sIPSC eのサンプルトレース（左）および平均パラメータ（右、イベント頻度または振幅）。 f、g 指定された時点で記録された刺激誘発EPSC（f、PTXあり）およびIPSC（g、CNQXあり）。トレースの例 (左)、平均振幅 (中央)、および検出可能な応答を持つ細胞の割合 (右)。 h、i MAP2 陽性樹状枝上に形成される vGLUT (h) または vGAT (i) 点を除いて、c と同じ。 j. シナプシン涙点と vGLUT または vGAT 信号間の共局在の代表的な画像 (左) とマンダー係数 (右)。可溶性EGFPの共発現により神経突起を可視化した。 vGLUT シグナルと vGAT シグナルの両方は、それぞれ、60 日目のシナプシン陽性の全シナプスの一部のみを占めます。 k 60 日目におけるシナプシンとホーマーまたはゲフィリンのいずれかとの間の共局在を除き、j と同じです。すべてのデータは平均 ± SEM を表します。概要グラフは、分析された視野 (免疫染色用) またはパッチされたニューロン (電気生理学用)/独立したバッチの総数、および個々のデータポイント (白丸) も示します。パネル j および k の正規分布データ (-2 ～ 2 の歪度と尖度の値) の統計的有意性は、対応のない両側スチューデント t 検定によって計算されました (***P < 0.005)。 **P < 0.01。すべてのグループごとの比較 (時間経過、b – i) については、一元配置分散分析が実行され、P 値が記載されました。

GABA作動性シナプスの生成はその機能的成熟と並行して進行するため、我々は、GABAARまたはGABABRのいずれかのGABA依存性活性化が、これらの誘導されたシナプスの形成および/または長期安定性を促進できるかどうかを調べた。それを調べるために、GABAARアンタゴニストPTXまたはGABABRアンタゴニストCGP55845のいずれかによる慢性治療を実行し、4日目から5日目まで一日おきに薬物で培地を半分交換し、56日目から60日目に細胞を分析しました（図5a）。。 CGPではなくPTXを適用すると、サイズに影響を与えることなくvGATとGephyrin点の両方の数が大幅に減少することがわかりました（図5b、c）。慢性的なPTX治療は、ニューロンの生存や樹状突起の分枝化を損なうことはありませんでしたが、vGAT信号とGephyrin信号の間の並置を減少させました（補足図S7a〜c）。これは、GABA作動性シナプス形態の特定の欠陥を示しています。

a パネル b ～ f の実験戦略。 NV57ニューロンを、誘導後4〜5日目から56〜60日目まで一日おきに半交換培地でシナプス阻害剤とともにインキュベートし、その後、示されているように分析しました（矢印）。 b、c DMSOのみ（コントロール）、100μM PTX、または10μM CGP55845で処理した場合に、MAP2陽性樹状突起上に形成されたvGAT bおよびGephyrin cクラスターのサンプル画像（左）および正規化された密度またはサイズ（右）。 d 代表的な mIPSC 波形 (上) とイベントの頻度または振幅 (下) は、コントロールと PTX 処理 (長期) ニューロンの累積分布 (左) と要約グラフ (右) としてプロットされています。電気生理学的記録の前に、培養液をバス溶液で徹底的に洗浄しました。 CNQX は EPSC を停止するために使用されました。 e 1 mM GABA パフによって生成された GABAAR 電流のトレース例 (上) と総電荷移動 (下)。 f 表面 GABAAR および樹状 MAP2 の細胞外エピトープについて免疫染色した、対照対 PTX 処理ニューロン (矢印) のサンプル画像 (左)。ボックス領域は拡大されており（切り取られた挿入図、右上）、ＧＡＢＡＡＲクラスターの正規化された密度およびサイズが、対照対ＰＴＸ処理についてプロットされている（右下）。すべての要約データは平均±SEMであり、記録された細胞の総数（電気生理学）または分析された視野（画像化）/独立したバッチを含み、個々のデータポイントは白丸として含まれていました。ほとんどのデータセットについて、歪度または尖度の値 (-2 >≈ および ≈ < 2) に基づいて、ほぼ正規分布が予測されました。したがって、統計的有意性は主に両側の対応のないスチューデントの t 検定によって評価され、***P < 0.005 でした。 *P < 0.05; ns = 有意ではない、P > 0.05。複数のグループ (b および c) を、事後ノンパラメトリックマン-ホイットニー U 検定と組み合わせたクラスカル-ウォリス検定によって比較し、対応する P 値を報告しました。

GABA作動性シナプスの機能的特性に対する影響をさらに評価するために、GABAARの表面およびシナプス局在を調べました。 PTXを洗い流し、薬物を含まないメディアで電圧固定記録を実行しました。 GABA作動性シナプス数の減少と一致して、PTX処理ニューロンは、振幅、イベント動態、または固有の細胞膜特性を変えることなく、mIPSC周波数の重大な欠損を示しました（図5d、および補足図S7d、e）。この表現型が GABAAR の低表面輸送によって引き起こされたかどうかを評価するために、圧力灌流によって外因性 GABA をパフ適用しましたが、GABAAR 電荷移動に対する実質的な影響には気付かず、細胞表面の受容体レベルが同様であることを示唆しています (図.5e)。ただし、長期のPTX処理は、サイズに影響を与えることなく、樹状GABAARクラスターの密度を減少させました（図5f）。したがって、GABAAR ではなく GABAAR の持続的な活性化が、V57 誘導性 GABA 作動性シナプスの発生特性および/または維持を制御します。

次に、ヒトニューロンがH1-ES細胞以外の幹細胞から分化した場合に、V57媒介GABA作動性表現型が再現できるかどうかを調べた。このアイデアをテストするために、我々は、ドキシサイクリン誘導時に Ngn2 導入遺伝子を安定的に発現し、本質的にグルタミン酸作動性であり、内因性 vGAT および GAD65/67 発現も欠如している、高い効率でヒトニューロンを生成する同質遺伝子型人工多能性幹 (iPS) 細胞株を利用しました 33。。神経誘導の直後に、それらをV57ウイルスに感染させ、グリアと共培養し、広範な形態に達した35〜42日目にそれらを特徴付けました（図6a、および補足図S8a）。この集団は、かなりの量のvGAT、GAD65、およびGAD67 mRNA形質導入、および精巧な樹状突起に沿ったタンパク質の局在を示しました（図6b、c、および補足図S8b-d）。これらのvGATが豊富なシナプス構造は、主要なGABA作動性シナプス後SAM、たとえばニューロリジン-2も動員しました（補足図S8e）12、34、35。

a iPS 細胞 (WTC-11 株、左) と分化したヒトニューロン (42 日目、右) の位相差画像。 b、c iPS細胞由来ニューロンのvGATまたはGAD65/67導入遺伝子に対する定量的RT-PCR（qRT-PCR、b）および免疫染色c。樹状MAP2、核DAPI、およびヒト核抗原HuNuを同時標識。 d 単一の共焦点面からのサンプル超解像度画像 (左) とマンダー係数値 (面積%、右) は、vGLUT と vGAT の点 (それぞれ黄色とシアンの矢印) の間の最小の共局在を確認します。 e iPS 細胞上の 1 mM GABA パフ (矢印) によって誘発された IPSC のトレース例 (左) と電流-電圧関係 (IV 曲線、Vhold = -80 ～ +20 mV、10 mV 段階的に増加、右) のピーク振幅。コントロール条件および V57 条件における派生ニューロン。平均データは直線を使用して近似されます (式: y = a + bx)。コントロールニューロンの場合は a = 32.5 ± 10 pA、b = 22.33 ± 1.22 pA、V57 条件の場合は a = 29.64 ± 18 pA、b = 27.89 ± 2.7 pA。 f、g 示されているように、PTXまたはCNQX + CPPの存在下、対照（上）対V57（下）条件で、Vhold = -70 mVまたは+10 mVで記録されたsPSCの代表的なトレースfおよびイベント頻度g。トレース間の分割マークは、同じニューロンからの連続記録を連結します。 sEPSC (青い矢印) または sIPSC (赤い矢印)。 h V57 因子で形質導入された iPS 細胞由来ニューロンから、CNQX + CPP の存在下、Vhold = -70 mV または +10 mV で記録された TTX 非感受性 mIPSC のトレース例 (左) と平均振幅 (右)。私。 V57 条件での反復高周波刺激によって生成された誘発 IPSC。刺激トレイン（一連の矢印）が終了した後の、信頼性の高い同期放出と顕著な遅延放出成分（挿入図、点線ボックスを拡大した矢印）を示す重ね合わせたトレース（左）。注釈付きの、さまざまな Vhold での IPSC 振幅の平均と短期低下 (右)。平均値は、記録された細胞の総数（電気生理学）または分析された視野（イメージング）/独立したバッチ、またはバッチ数のみ（b）の平均±SEMとして提供されます。実験的に結合されたすべてのデータポイントは、接続された線を持つ色が一致した白丸として提供されます。データ分布は、歪度および尖度の値が -2 >≈ および ≈ < 2 で、ほぼ正規でした (ソースデータ)。統計的有意性は、両側対応スチューデント t 検定によって評価され、***P < 0.005 でした。 *P < 0.05; ND = イベントが検出されません。

H1-ES 細胞由来ニューロンと同様に、これらの iPS 細胞由来ニューロンにおける vGLUT 対 vGAT、またはホーマー対ゲフィリンの共免疫染色でも、2 つの異なるシナプスタイプ間の共局在がほとんど認められず、ここでもグルタミン酸作動性と GABA 作動性が示唆されています。仕様は、相互に排他的なシナプス前ゾーンとシナプス後ゾーンを占有します（図6d、および補足図S8f、g）。外因性GABAパフは、Vhold≈-70mVでかなりの内向きIPSCを示し、ほぼ0mVで反転し、V57共発現の有無にかかわらずiPS細胞由来ニューロンにも表面GABAARの存在が再度確認されました（図6e）。対照条件の同じニューロンからの連続記録では、CNQXとNMDA受容体（NMDAR）ブロッカーである3-カルボキシピペラジン-プロピルホスホン酸（CPP）による治療により、Vholdに関係なくシナプス電流の大部分が沈黙し、それらの純粋なグルタミン酸作動性の同一性が裏付けられました（図） .6f、g）。 V57細胞では、PTXおよびCNQX + CPPの連続適用によりそれぞれsIPSCおよびsEPSCが阻害され、グルタミン酸作動性シナプスとGABA作動性シナプスの両方が共存していることが証明されました（図6f、g）。さらに、V57 ニューロンを +10 mV ではなく -70 mV に保持すると (つまり、接合電位を考慮せずに全細胞構成でほぼ推定された Cl 反転電位、ECl ≈ +14 mV)、本物の mIPSC さえも描写されました。 TTXの存在下では、強力な遅延放出と顕著な短期可塑性を備えた信頼性の高い誘発IPSCが誘発されました（図6h、i）。したがって、私たちのアプローチは、再プログラムされた幹細胞株に関係なく、完全に機能するヒトGABA作動性シナプスをin vitroで生成する際に高い再現性がありました。

次に、V57 因子が生きた動物でも機能的な GABA 作動性シナプスを生成できるかどうかを調査することを目的としました。この原理証明実験では、2 つの選択基準に基づいてモデルのグルタミン酸作動性シナプスを使用することを意図しました: (i) ウイルス注入部位 (つまり、シナプス前ニューロンの細胞体) は記録部位 (つまり、シナプス前ニューロンの細胞体) から物理的に離れています。シナプス後ニューロンの細胞体）、および（ii）シナプス後ニューロンは他のソースから無視できる程度の GABA 作動性入力を受け取ります。これらの制約は、シナプス後細胞への局所的な GABA 作動性入力を間接的に増強することなく、V57 因子のウイルス形質導入が主に目的のグルタミン酸作動性シナプス前ニューロンを標的とすることを保証するために必要でした。

この目的を達成するために、マウスのらせん神経節にウイルス粒子を注入しました。これにより、純粋にグルタミン酸作動性の出力（「ヘルドの端球」としても知られています）を主にふさふさした細胞（BC）の細胞体に投射する聴神経（AN）線維が生じます。）、蝸牛核の遠くに位置します（図7a）36、37。生後2〜4日目（P2〜4）にV57因子のレンチウイルス注射を実行し、脳スライスを準備してP18〜32、つまりRFPをコードするコントロールウイルスが注射部位で実質的な形質導入を示したときにそれらを分析しました（補足図S9a）。、b）。 BCは明確に定義されたGABA作動性入力を欠いており、主に約4〜5本のAN線維からカルレチニン陽性グルタミン酸作動性末端球、または局所介在ニューロンからvGAT陽性グリシン作動性末端のいずれかを受け取り、互いに物理的に分離したシナプスを形成します（図7b）38。、39、40、41。しかし、V57因子で形質導入された動物は、カルレチニンとvGATシグナル間の共局在の顕著な増加を示し、ANファイバー末端内で導入遺伝子の誘導が成功したことを示しました（図7b、c）。注目すべきことに、レンチウイルスのインビボ形質導入効率は、我々のインビトロアプローチと比較して比較的まばらであり(図3c、dを参照)、エンドバルブサイズを有意に変化させなかった(図7b、c)。

模式図は、エンドバルブシナプスの送信機の正体を操作するための実験戦略を示しています。 b 対照動物（左）とV57を注射した動物（右）における、カルレチニンおよびvGAT陽性シナプス前末端に囲まれたBC細胞体（シアン色の円）の代表的な画像。 vGAT シグナルは、V57 条件 (黄色の矢印) ではカルレチニン陽性の末端球末端と重なることがよくありましたが、対照条件 (白色の矢印) では最小限でした。 c カルレチニンシグナル（左）、vGATシグナルが共占する端球面積（中央）、およびおそらくV57因子によって誘導されるvGATを共発現する端球の割合（右）を使用して測定したAN末端の平均サイズ。 d、e コントロール（左）対V57（右）条件から記録されたsEPSC（青い矢印とヒストグラム）およびsIPSC（赤い矢印とヒストグラム）のサンプルトレースdとτ減衰の頻度分布e。 eの挿入図は、イベント動態を比較するためにスケーリングおよび重ね合わせたサンプルsEPSCおよびsIPSCトレースです。すべての記録は、局所的なグリシン作動性入力からの sIPSC を抑制するために 1 μM ストリキニーネの存在下で実行されました。 f、g AMPAR媒介sEPSC fまたはGABAAR媒介sIPSC gの累積確率プロットおよび事象頻度（左）および振幅（右）の平均棒グラフ。 h 誘発された PSC のトレースの例（灰色の矢印で置き換えられた刺激アーチファクト）。1 μM ストリキニーネの急性処理後（青色のトレース）、または 10 μM NBQX + の添加後に、コントロール（左）対 V57（右）条件から記録されました。 5 μM CPP (赤色のトレース)、および 20 μM ビククリン (黒色のトレース)。矢印、EPSC (青) または IPSC (赤)。 i 円グラフは、示された PSC タイプ (EPSC のみ、IPSC のみ、または両方) を持つ細胞の割合を表します。 j 反応が成功したニューロンから平均化された、誘発された EPSC (左) と IPSC (右) の振幅。平均値は、分析された視野の総数 (イメージングの場合) またはパッチされたニューロンの総数 (パッチクランプ記録の場合) / 注射された動物の数、および個々のデータポイント (色分けされた白丸) で、平均 ± SEM を示します。統計的有意性は、対応のない両側スチューデント t 検定 (正規分布に近い結果)、または両側ノンパラメトリックマンホイットニー U 検定によって検定され、***P < 0.005 でした。 **P < 0.01; *P < 0.05; ns = 有意ではない、P > 0.05。

グルタミン酸作動性末端球における V57 の異所性発現が機能的な GABA 作動性シナプスの形成を引き起こすかどうかを調べるために、GABAAR よりもグリシン受容体 (GlyR) を優先的に阻害するストリキニーネの存在下でシナプス後 BC から電位固定記録を実施しました。対照条件では、BCは主に速いτ減衰を持つsEPSCを示しましたが、V57誘導はより遅いτ減衰を持つsIPSCの大幅な増加を引き起こしました（図7d、e）。 V57因子のレンチウイルス媒介モザイク形質導入は、sEPSCの振幅も頻度も変化させなかったが、sIPSC振幅に影響を与えることなくsIPSC頻度を実質的に上昇させた（図7f、g）。

最後に、シナプス前 AN 刺激によって誘発された BC の PSC を検査しました。対照動物では、ストリキニーネ非感受性誘発PSCは急速な減衰動態を示し、AMPARアンタゴニストNBQXの急性治療によって大部分がブロックされました（図7h、i）。しかし、V57因子によって形質導入された動物は、GABAARブロッカーであるビククリンによってのみ阻害され得る、より遅いIPSC成分の共存をしばしば示した(図7h、i)。 V57条件のいくつかのBCも、検出可能なEPSCを含まずに主に誘発されたIPSCを示しましたが、この現象は対照条件では決して観察されませんでした（図7i）。測定可能な反応を伴うBCのみから平均すると、V57誘導はEPSCを変化させることなく、誘発されたIPSCの振幅を有意に上昇させた（図7j）。したがって、V57 因子は、生体内システムでも機能的な GABA 作動性シナプスの形成を首尾よく誘発することができます。

哺乳類の中枢神経系には、さまざまな神経伝達物質を放出および感知するさまざまな種類のシナプスが含まれています。これらの異なる化学物質を合成して伝達する能力には、多くの場合、相互に排他的な酵素のセットと、特定の神経系統で内因的に発現される小胞輸送体が必要です。発生初期にニューロンの運命が確立された後、シナプス前ニューロンによって生成される伝達物質の種類は安定しており、不可逆的であると考えられています。伝達物質の同一性は特定の神経サブタイプの固有の特徴であるため、特定のニューロンのペア間に形成されるすべてのシナプス接続は一般に同型、たとえばグルタミン酸作動性または GABA 作動性であり、通常は時間の経過とともに変化しません 42,43。

我々はここで、vGAT + GAD65 + GAD67 の異所性発現により、もっぱらグルタミン酸作動性のヒトおよびマウスのニューロンに強力な GABA 作動性アイデンティティを割り当てることができることを示しました。このGABAのシナプス前放出はシナプス後GABAARを活性化することができ、顕著な短期可塑性を備えた真正の小型のAP依存性IPSCを発現する完全に機能するGABA作動性シナプスを生成した（図1および2）。これらの GABA 作動性表現型は、in vitro および in vivo 系の両方で、複数の細胞株で高度に再現性がありました (図 6 および 7)。伝達物質の種類を直接再プログラミングしても、シナプスの総数は変化しませんでしたが、シナプス前/後構造の再配置が引き起こされました (図 3)。誘導されたGABA作動性シナプスは、隣接するグルタミン酸作動性シナプスとは独立して形成されましたが、同様の成熟動態を示し、部分的にGABAAR活性に依存していました（図4および5）。要約すると、私たちのアプローチは、de novo送信機合成によって機能的シナプスを誘導する簡単な手段を確立しました（補足図S10a）。

我々の発見は、異なるニューロンサブタイプによるグルタミン酸対GABAの放出能力は、主に伝達物質特異的酵素および小胞輸送体の異なる発現に依存する可能性があることを示す以前の報告と完全に一致している44。異なる伝達物質を含む小胞が生成されると、異なるシナプスタイプに特有の特殊な放出機構が必ずしも必要になるわけではありません。この理論に沿って、初期の研究では、同じニューロンから、場合によっては空間的に分離されているが形態学的に類似した放出部位を持つ同じシナプス前終末からの異なる化学物質の同時伝達についても説明されている21,23,45,46,47,48,49。。

興味深いことに、V57 発現ニューロンはグルタミン酸と GABA の両方を合成しましたが、異なる動態で相互に排他的な mEPSC および mIPSC イベントを生成しました。これらは、他の種類のイベントの頻度を減衰させることなく、選択的受容体遮断薬によって個別に阻害できる可能性があります (図 1、2、6、および 7)。これらの結果は、グルタミン酸と GABA は同時に伝達されるが、対応する受容体を同時に活性化するために同時に放出されることはない可能性があることを示唆しています。さらに、グルタミン酸作動性シナプスと GABA 作動性シナプスを標識するシナプス前マーカーとシナプス後マーカーの両方も、限られた共局在を明らかにし（図 3 および 6、および補足図 S5、S8f、g）、それらが物理的に分離されていることを示しています（補足図 S10b）。。同様の現象が生体内で異なる共伝達物質でも見られ、それらは別個のシナプス小胞に分布し、独立して放出されることがよく見られます45、47、50。

シナプス前のGABA放出はどのようにして機能的なシナプスの形成を促進するのでしょうか? GABAAR サブユニットの遺伝的欠失または特定のアンタゴニストによる薬理学的阻害が GABA 作動性シナプス形成を損なうことが示されているため、最近の発見は、GABAAR の活性化がこの経路において重要な役割を果たす可能性があることを示唆しています 20,27。この概念と一致しますが、長期の PTX 曝露も V57 誘発 GABA 作動性シナプスの密度を減少させましたが、完全に除去することはできませんでした (図 5)。さらに、V57 因子は GABA 作動性シナプス後密度を上昇させましたが、シナプス前 GABA 放出が欠如している Ngn2 のみのニューロンにも、ゲフィリンと GABAAR クラスターの両方がかなりのレベルですでに存在していました。したがって、追加の細胞機構も GABA 作動性シナプスの発達に寄与している可能性があります。例えば、GABAAR はシナプス前ニューレキシンと直接相互作用し、また、シナプス後ニューロリジン、ゲフィリン、および/またはコリービスチンと分子複合体を形成して、GABA 放出の有無にかかわらず、シナプス前およびシナプス後アラインメントを確立する可能性もあります 34,51,52。あるいは、GABA 分子はまだ知られていないトランスシナプス要素に結合して、抑制的なシナプス形成を可能にする可能性があります。注目すべきことに、GABA作動性シナプスと同様に、グリシン受容体（GlyR）の活性化も脊髄ニューロンにおけるシナプスクラスター形成を促進する可能性があり、これは受容体活性化の下流にある共通の細胞シグナル伝達経路を介して媒介される可能性があります53。

これまで、シナプス前放出機構の破壊は、シナプス形成、樹状突起スパインの形成とその維持にわずかな影響を与えるか、まったく影響を及ぼさないことが示されていました54、55、56、57。これらのエレガントな遺伝的アプローチによりシナプス活動の大部分が除去されたものの、最小限のレベルの基礎伝達物質シグナル、例えば残存自発的放出がシナプス同一性を確立するには十分であるということは依然としてもっともらしいことであることを認識する価値がある。神経細胞の放出がない場合でも、局所アストログリア細胞からの拡散伝達物質分泌もシナプス受容体の活性化を引き起こす可能性があります58。あるいは、さまざまな神経伝達物質自体の酵素的生成および/または小胞パッケージングに関連するシナプス前タンパク質は、能動的な伝達物質放出がない場合でも、他のシナプス分子と直接的または間接的に相互作用し、シナプス形成プロセスに関与する可能性があります。グルタミン酸作動性シナプス形成におけるシナプス受容体活性化の寄与についても、依然として議論の余地がある。イオンチャネル性グルタミン酸受容体の持続的な活性化はスパインの伸長を促進することが示されていますが 59,60,61、すべての AMPAR および NMDAR サブユニットの除去はシナプス前小胞の分布やシナプス後形態に影響を与えることはできませんでした 62。したがって、複数の並行経路がグルタミン酸作動性シナプスの発達を調節する可能性があり、これらのメカニズムはGABA作動性シナプス形成とは大きく異なる可能性があります。これらのさまざまな可能性を調査するには、今後の研究が必要です。

グルタミン酸と GABA のアンケージングを使用した初期の研究では、急性神経伝達物質の放出自体が、空間的に区切られた形で初期のシナプス形成を促進できることが報告されています 26,27。今回我々は、シナプス前小胞放出という生理学的に適切な状況下で、そのような伝達物質誘導性シナプスが、より優れた形態学的および機能的成熟を達成できることを実証した。光刺激法と比較して、V57 誘発 GABA 作動性シナプス構造は、密度とサイズが大幅に成長し、再現性の高い信頼性の高い IPSC を示したので、シナプスアイデンティティの安定的、効率的かつ広範な修飾に適しています。私たちのプロトコルは、人間の神経培養の in vitro モデルと in vivo のマウス脳の両方で成功したため、依存症や精神障害の影響を受ける回路を操作するために採用される可能性があります。

小分子媒介細胞分化および転写因子スクリーニングを使用して、我々および他の研究者は、これまでにES細胞からGABA作動性ニューロンを直接誘導してきた63、64、65、66、67。これらの分化または再プログラムされたニューロンは、さまざまなマーカーを発現し、人間の脳に固有の GABA 作動性ニューロンサブタイプを模倣する AP 特性を示します。我々の現在のアプローチは特定の神経系譜を生成しませんが、V57因子によって生成されるGABA作動性シナプスも同様に、同等の振幅と周波数を備えた堅牢な小型の誘発IPSCを発現させ、時間の経過とともに成熟し、in vitroアッセイに利用できます。 GABA作動性酵素のウイルス形質導入は、特に生体内での応用において、転写因子誘導性GABA作動性ニューロンに比べて特定の利点も提供します。脳に移植されると、再プログラムされたニューロンは、長期生存、機能成熟の欠如、遊走の制限、および既存の神経回路へのシナプス統合の制限に悩まされることがあります63、64、65。 V57因子のウイルス送達は、すでに利用可能なニューロン集団に新しいGABA作動性シナプスを形成することにより、これらの技術的問題の一部を回避する可能性がある。

すべての細胞培養法およびレンチウイルス生産手順は、コロラド州立大学の施設内バイオセーフティ委員会 (IRB プロトコール # 19-059B) によって承認されました。マウス（雄および雌、JAX 系統 CBA/CaJ を含む）を用いたすべての実験は、バッファロー大学の施設内動物管理使用委員会 (IACUC プロトコール # 201800101) によって承認され、倫理ガイドラインに従って実施されました。

ヒト ES 細胞 (H1 株、カタログ番号 WA01) は、材料譲渡契約 (MTA # 19-W0439) に基づいて WiCell Research Institute から購入しました。ヒト iPS 細胞株 (WTC-11) は、国立神経障害・脳卒中研究所 (NINDS) の Michael E. Ward 博士から寛大に寄贈されました。ウイルス産生用のヒト胎児腎臓（ＨＥＫ）２９３Ｔ細胞は、タカラバイオＵＳＡから市販されていた（カタログ番号６３２１８０）。

ヒト ES 細胞のニューロンの再プログラミングに使用されるレンチウイルス構築物には、Ngn2-t2A-PuromycinResistance (Tet-on プロモーター) および rtTA (ユビキチンプロモーター) が含まれており、形態学的分析用に EGFP (Tet-on プロモーター) をコードするウイルスもオプションで含まれています 31。ヒト vGAT、GAD65、および GAD67 (V57 因子) をコードする cDNA を、ヒトシナプシン-1 プロモーターによって駆動されるレンチウイルスベクターにクローニングし (補足図 S8b を参照)、続いてウッドチャック制御エレメント (WRE) を配置し、5' および3'長のターミナルリピート（LTR）。

3 つのヘルパープラスミド (pRSV-REV、pMDLg/pRRE、VSV-G、各 7 ～ 8 μg) と対応する発現ベクター (15 ～ 20 μg) をポリエチレンイミン (PEI) で 70 ～ 80% コンフルエントになるまで同時トランスフェクトしました。 HEK 293T (ウイルス産生を促進するための SV40 T 抗原を含む) 細胞を 10 cm ディッシュにプレーティングしました。トランスフェクション後 8 ～ 10 時間で培地を完全に交換し、36 時間および 60 時間後にレンチウイルス粒子を含む上清を収集しました。次に、上清をプールし、約 800 × g で 6 ～ 8 分間遠心して HEK 細胞の破片を除去しました。次に、上清を 4 °C、約 120,000 × g で 2 時間遠心分離しました (SW41Ti ローターを装備した Beckman L8-70M 超遠心分離機)。ウイルスペレットを約50～100μlのDMEM培地に再懸濁し、4℃で一晩保存し、その後小分けして実験使用前に-80℃で凍結しました。

ヒト H1-ES 細胞 (図 1 ～ 5 を参照) とドキシサイクリン誘導性 Ngn2 導入遺伝子を持つ同系 iPS 細胞株 (WTC-11、図 6 を参照) 33 の両方を mTeSR™1 / mTeSR™ Plus 培地 ( StemCell Technologies) フィーダーフリー条件下。培地は毎日交換した。細胞密度が約 70% に達したら、リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) + 0.5 mM EDTA で細胞を解離し、1:6 希釈で Matrigel (BD Bioscience) でコーティングされたウェルにプレーティングしました。継代中、培養物にＲＯＣＫ阻害剤Ｙ−２７６３２（２．５μＭ、ＭｅｄＣｈｅｍＥｘｐｒｅｓｓ）を一晩さらに補充したが、その後の培地交換のために除外した。

H1-ES 細胞では、以前に記載されているように、Ngn2 を介した直接的なニューロン変換が達成されました 31,32。簡単に説明すると、ES細胞をrtTAおよびNgn2-t2A-ピューロマイシン耐性をコードするレンチウイルスで同時感染させ、ドキシサイクリン（2μg/ml）で誘導し、ピューロマイシン（1μg/ml）を使用して選択し、PBS + EDTAまたはアキュターゼで穏やかに解離させた（革新的） Cell Technologies) を使用し、初代マウスグリア (継代 1 ～ 2、CD-1 ® IGS マウス由来) をマトリゲルでコーティングしたカバースリップ上に再播種しました (図 1a を参照)。同様の戦略が、ドキシサイクリン曝露によって直接再プログラムされたiPS細胞由来ニューロンにも採用されました（補足図S8aを参照）33。プロトコールタイムラインに示すように、分化中または分化直後に、ニューロンに V57 因子を発現するレンチウイルスをさらに感染させ、空の pFSW-67 ベクターから作成したウイルスを感染制御として使用しました。

0日目から14日目まで、インスリン[20μg/ml、Sigma]、ペニシリン/ストレプトマイシン[サーモフィッシャー])。グリアの共培養中に、2 ～ 2.5% のウシ胎児血清 (FBS、Atlas Biologicals) が含まれました。培地は 3 ～ 4 日ごとに半分交換され、70 ～ 80% コンフルエントに達した後にグリアの増殖を阻害するために 5-フルオロデオキシウリジン (FdU、10 μM) が追加で補充されました。 15日目以降、N3培地を、FBS + FdUも補充されたNeurobasal Plus培地[Thermo Fisher] + B27 + ペニシリン/ストレプトマイシンに徐々に置き換えました。

ヒトニューロンの全細胞パッチクランプ記録は、以前に記載されたものと同様に実行されました67,68。簡単に説明すると、（電圧固定用、mM）135 CsCl2、1 EGTA、1 NaGTP、2 QX-314、および 10 HEPES-CsOH（pH 7.4、310 mOsm）を含む内部溶液を使用してニューロンをパッチしました。または (電流クランプの場合、mM) 130 KCl、10 NaCl、2 MgCl2、0.5 EGTA、0.16 CaCl2、4 Na2ATP、0.4 NaGTP、14 Tris-クレアチンリン酸、および 10 HEPES-KOH (pH 7.3、310 mOsm)。細胞外浴溶液は、(mM) 140 NaCl、5 KCl、3 CaCl2、1 MgCl2、10 グルコース、および 10 HEPES-NaOH (pH 7.4、300 mOsm) を含みました。すべての記録は、カスタマイズされた Igor Pro 8 (WaveMetrics) データ収集システムによって制御される統合パッチクランプアンプ (IPA、Sutter Instruments) を使用して、室温で行われました。すべてのセルについて、パッチの品質は直列抵抗値 (Rs < 15 MOhm) を使用して監視されましたが、実験グループ間で大きな変化はありませんでした。 AMPAR EPSC および GABAAR IPSC の電圧クランプ記録は、特に記載がない限り、-70 mV の Vhold で実行されました (図 6)。誘発された PSC は、A365RC 分離パルス刺激装置 (World Precision Instruments) に接続されたマトリックス電極 (FHC、MX21AEW-RT2) を使用した場刺激によって誘発されました。 AMPAR または GABAAR 媒介 PSC は、それぞれ PTX (100 μM; GABAAR/GlycineR ブロッカー、Tocris Bioscience) または CNQX (25 μM; AMPAR ブロッカー、Tocris Bioscience) を使用して単離されました。 Vhold = -70 mV でのすべての電圧クランプ記録には NMDAR をブロックする細胞外 Mg2+ が含まれていましたが、Vhold = +10 mV での一部の実験 (図 6 を参照) には CPP (50 μM; NMDAR 阻害剤; Tocris Bioscience) も含まれていました。自発的APによって引き起こされるシナプス前放出を避けるために、すべてのミニチュアmEPSCおよびmIPSC記録中にテトロドトキシン(TTX; 2μM; Ascent Scientific)を外部溶液に添加した。 1 mM AMPA (RS-AMPA 臭化水素酸塩、Tocris Bioscience) または 1 mM GABA (Tocris Bioscience) の圧力灌流を、Picospritzer III (Parker Instrumentation) を使用して 20 psi パフで 100 ms 実行し、総電荷移動を 30 秒以内に計算しました。パフの塗布から。

図5b〜fでは、グリアと同時プレーティングした直後、誘導後日に細胞をGABAARアンタゴニストPTX（100μM）、GABABRアンタゴニストCGP55845（10μM、Tocris Bioscience）、またはDMSO（コントロール）のいずれかとインキュベートしました。 4～5。培地を等量の薬剤と一日おきに半分交換し、56〜60日目に細胞を分析しました（図5a）。免疫染色では、培養物を PBS で 3 ～ 4 回洗浄し、室温で 4% パラホルムアルデヒド (PFA) で固定し、抗体インキュベーションのために処理しました (以下を参照)。全細胞パッチングの場合、記録前にニューロンをバス溶液で2分間×3回徹底的に洗浄しました。

マウス正円窓への in vivo レンチウイルス注射の方法は、わずかな変更を加えて以前のプロトコルから採用されました 69,70。簡単に言うと、新生児マウス（P2〜P4）の耳介の尾側に約1 cmの小さな切開が行われ、鼓室胞が露出してその下の正円窓が露出しました（補足図S9aを参照）。鼓室胞を 34 ゲージの針で穿刺し、少なくとも 10 分間排液させました。約0.3μlのレンチウイルス（0.1μlのGAD65、0.1μlのGAD67、および0.1μlのvGATのカクテル）またはAAV-chrimson/RFP（コントロール）を、34ゲージの取り外し可能な5μlハミルトンシリンジを使用して正円窓にゆっくり注射しました。注射針、0.375 インチ 12° ベベル。注射量が増えると、液体のあふれ、蝸牛水道の破壊、脳脊髄液への漏出が生じる可能性があることに注意してください。針を引っ込めた後、手術部位を縫合し、子犬を元の場所に戻しました。ホームケージで成体動物を屠殺し、ウイルス感染後 2 ～ 4 週間後に脳スライスを画像化または電気生理学実験用に調製した。端球シナプスは出生後急速に発達し、~3 週間までに形態学的および機能的成熟に達する 71,72,73,74 。

200 mg/kg ケタミンと 10 mg/kg キシラジンを使用してマウスを麻酔し、屠殺し、脳を取り出し、氷冷ショ糖溶液 (mM: 76 NaCl、75 スクロース、25 NaHCO3、25 グルコース、2.5 KCl) に入れました。、1.25 NaH2PO4、7 MgCl2、0.5 CaCl2)。ビブラトーム (Leica VT1200) を使用して矢状切片 (142 μm) を切断し、標準記録溶液 (mM: 125 NaCl、26 NaHCO3、20 グルコース、2.5 KCl、1.25 NaH2PO4、1.5 MgCl2、1.5 CaCl2、4 Na) 中でインキュベートしました。 L-乳酸、2 Na-ピルビン酸、0.4 Na L-アスコルビン酸、95% O2 - 5% CO2 で 34 °C で 20 分間バブリング。その後、スライスは記録まで室温に保管されました。記録中に、自発的なグリシン作動性 IPSC を阻害するために 1 μM ストリキニーネを添加し、AMPAR および NMDAR 媒介 EPSC をそれぞれブロックするために 10 μM NBQX および 5 μM CPP を添加し、GABA 作動性 IPSC をブロックするために 20 μM ビククリンを添加しました。全細胞電位固定記録は、抵抗 1.3 ～ 2.3 MΩ のホウケイ酸パッチピペットを使用して、AVCN スライスの BC から行われました。ピペットに、(mM) 35 CsF、100 CsCl、10 EGTA、10 HEPES、および 1 QX-314、pH 7.3、300 mOsm を含む内部溶液を充填しました。 BC は、Igor (WaveMetrics) で実行されるカスタム作成ソフトウェア (mafPC) によって駆動される ITC-18 インターフェイス (Instrutech) によって制御される Multiclamp 700B (Molecular Devices) を備えた Olympus BX51WI 顕微鏡下でパッチされました。ポンプ (403U/VM2; Watson-Marlow) を使用して浴槽を 3 ～ 4 ml/分で灌流し、生理食塩水をインラインヒーターに流して温度を 34 °C に維持しました (SH-27B と TC-324B コントローラー; Warner)楽器）。 BC は -70 mV に保持され、アクセス抵抗 5 ～ 15 MΩ が 70% に補正されました。 BC細胞体から30〜50μm離れたところに配置されたガラス微小電極を使用し、刺激アイソレーター（WPI、A360）を介して4〜20μAの電流で単一のシナプス前端球終末を刺激しました。シナプス前刺激は 8 秒ごとに適用されました。 V57 条件では、すべての sEPSC および sIPSC の結果は、検出可能な誘発 IPSC を含むニューロンのみから分析されました。

V57 因子の有無にかかわらず、ヒト神経細胞培養物を 4% PFA 中で室温で 30 分間固定しました。次に、細胞を5〜10％の子ウシ血清（CCS）で37℃で1時間ブロックし、一次抗体（補足図S3を参照）とともに37℃で1〜2時間、揺り動かしながらインキュベートし、水で4回洗浄しました。ブロッキングバッファーで洗浄した後、Alexa Fluor (Invitrogen) 488/555/647 結合二次抗体 [488 ヤギ抗マウス (A11029)、546 ヤギ抗マウス (A11030)、647 ヤギ抗マウス (A11030)、647 ヤギ抗マウス (A11030)マウス (A32728)、488 ヤギ抗ウサギ (A11034)、546 ヤギ抗ウサギ (A11035)、647 ロバ抗ウサギ (A31573)、488 ヤギ抗ニワトリ (A11039)、546 ヤギ抗ニワトリ (A11040)、 647 ヤギ抗ニワトリ (A21449)、488 ヤギ抗モルモット (A11073)、555 ヤギ抗モルモット (A21435)、または 647 ヤギ抗モルモット (A21450)] の 1:1000 ～ 2000 希釈。次いで、培養物をブロッキング緩衝液およびＰＢＳで４回洗浄し、Ｆｌｕｏｒｏｍｏｕｎｔ－Ｇ（ＳｏｕｔｈｅｒｎＢｉｏｔｅｃｈ）を使用してカバーガラスをスライドガラス上に逆さまに取り付けた。必要に応じて、細胞核を DAPI (1:50000; Thermo Fisher、カタログ番号 D1306) で 5 ～ 10 分間染色しました。ほとんどの免疫染色アッセイは、ブロッキング緩衝液に Triton X-100 (0.1%) を適用し、洗浄や抗体希釈を含むその後のすべてのステップを適用する透過性環境で実施されました。ただし、GABAARの細胞表面局在（図5fおよび補足図S6dを参照）と樹状分岐での分布を視覚化するために、非透過性条件下（トリトンなし）でGABAARサブユニットα3の細胞外エピトープに対する一次抗体を使用しました。 X-100)、その後 Triton X-100 を使用して透過処理し、樹状 MAP2 について免疫標識しました。

蝸牛核の免疫染色のために、マウスに０．９％生理食塩水、続いて４％ＰＦＡを経心的に灌流し、次いで脳を４％ＰＦＡ中で１時間後固定し、２０％スクロース中に一晩置いた。蝸牛の染色には追加のステップが含まれます。つまり、側頭骨から蝸牛を除去し、120 mM EDTA で約 5 日間インキュベートして脱灰し、その後 100 ブルームゼラチンに包埋し、PFA で一晩固定します。凍結包埋組織をミクロトームを使用して 50 μm 切片に切断し、0.2 M PBS (0.9% NaCl) で 3 回洗浄し、PBS + Triton X-100 中の 5% ヤギ血清で室温で 1 時間ブロックし、室温で一晩インキュベートしました。一次抗体を使用した場合は 4 °C (補足図 S3)。スライスを PBS で 3 回洗浄し、Alexa Fluor (Invitrogen) 568 ロバ抗ヤギ (A11057)、594 ヤギ抗ウサギ (A11037)、488 ヤギ抗マウス (A11029)、および/または 488 ロバを含む溶液中でインキュベートしました。抗ウサギ (A21206) 二次抗体 (1:250)。次いで、スライスをＰＢＳで３回洗浄し、ＰｒｏＬｏｎｇダイヤモンド退色防止封入剤（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｐ３６９６１）に封入した。

培養ヒトニューロンの共焦点画像は、倒立 STELLARIS 5 (Leica Microsystems) レーザー走査顕微鏡を使用して取得し、Leica Application Suite バージョン X (LAS-X、Core_3.7.4_23463) ソフトウェアで処理しました。 20 倍の乾燥対物レンズまたは油浸対物レンズ (40 倍または 60 倍) を使用して、光学的厚さ約 0.5 ～ 1 μm の一連の光学 Z 投影が得られました。すべての超解像度画像（図3f、j、6d、および補足図S5a、bを参照）は、Zeiss LSM 880顕微鏡（Zen）を使用して収集されました（x / y / z軸の寸法：0.04×0.04×0.18μm）。 2.3 ブラックエディション、ソフトウェア v.14.0.9.201)、プランアポクロマート 63 倍油浸対物レンズ (1.4 na) と Airyscan ガリウムヒ素リン (GaAsP) 検出器を備え、x/y で 120 nm の空間分解能を持つと報告されています。 z 面では 350 nm 75。マウスの脳組織、すなわち蝸牛核およびらせん神経節ニューロンの画像（図7bおよび補足図S9bを参照）は、オリンパスFV1000共焦点顕微鏡を使用して、〜1.84μmの光学Z断面で捕捉されました。

すべての共焦点画像は、FIJI-ImageJ (NIH) ソフトウェアを使用して分析されました。神経突起に沿ったシナプス涙点のさまざまなパラメーターを定量化するために、画像は通常、最大強度の Z 投影 (10 ～ 20 枚の光学スライス) として重ね合わされます。関心領域 (ROI) からのシナプス信号は、対応する神経突起領域 (MAP2 または EGFP 標識) に関して正規化されました。 2 つのシナプスマーカー間の共局在は、最初に個々のチャネルを適切にしきい値処理して個々の実験バッチのバックグラウンド信号を除去し、次に JACoP プラグイン内の各光学セクションのマンダー係数を測定することによって評価されました。超解像度画像の場合、ZEN 2.3 (ブルーエディション) ソフトウェア (v.2.3.69.1000) 内の処理および分析モジュールを使用して、最大強度プロファイルを抽出し、蛍光強度を測定しました。

コントロール対 V57 条件の iPS 細胞由来ヒトニューロンを PBS で洗浄し、500 μl TRIzol 試薬に収集しました。直ちに、250 μl のクロロホルムを細胞溶解物に加え、激しくボルテックスし、12,000 × g で 15 分間遠心分離し、水相を収集し、250 μl のイソプロパノールを加えて 12,000 × g で 10 分間遠心分離することにより RNA を沈殿させました。次に、RNA ペレットを 70% エタノールで洗浄し、風乾し、ナノピュア水に溶解しました。 cDNA は、Invitrogen SuperScript III First-Strand Synthesis SuperMix (カタログ番号 11752–050、Thermo Fisher Scientific) を製造元のプロトコールに従って使用して、300 ～ 800 ng の全 RNA から生成しました。定量的 PCR (qPCR) は、SYBR Green Master Mix (カタログ番号 RK21203、ABclonal) を使用して CFX-96 (Bio-Rad) 装置で実行されました。すべてのプライマーセットは、2つの隣接するエクソン間にまたがるように設計され、ヒトGAPDHが内部対照として使用されました（補足図S8c、dを参照）。

Ngn2誘導ヒトニューロンのRNA配列決定結果（補足図S1c）は、以前にNIHデータベース（GEOリポジトリ、アクセッション番号GSE129241 [https://www-ncbi-nlm-nih-gov.ezproxy.u)]に寄託されています。 -pec.fr/geo/query/acc.cgi?acc=GSE129241])32 であり、一般に公開されています。

56 ～ 60 日目の NV57 ニューロンをスクレイピングによって収集し、HaltTM プロテアーゼ阻害剤カクテルを添加した RIPA 緩衝液 (150 mM NaCl、5 mM EDTA、25 mM Tris pH 7.4、1% Nonidet P-40 代替品、0.5% デオキシコール酸ナトリウム) で溶解しました。 (PIC、Thermo Scientific、カタログ番号 78429)。ライセートを 4x ドデシル硫酸ナトリウム (SDS) ローディングバッファーと 3:1 で混合し、7.5% ポリアクリルアミドゲル (PAGE) 上で泳動し、次にニトロセルロース膜に転写しました。膜をトリス緩衝生理食塩水（TBS + 1% Tween-20）中の 3% ウシ血清アルブミン（BSA）で周囲温度で 2 ～ 3 時間ブロックし、一次抗体を使用して 4 °C で一晩免疫染色しました。続いて膜を蛍光二次抗体 (TBS + Tween-20 で 1:2000) で 37 °C で 2 ～ 3 時間染色し、LI-COR Odyssey CLx システムを使用して画像化し、Image Studio Lite ソフトウェア (バージョン 5.2) で分析しました。

すべての実験結果について、平均値は X/Y として表示されます。「X」は、「Y」個の独立したバッチから記録された (電気生理学用) または分析された視野 (イメージング用) のニューロンの総数を表します (人間のニューロンの場合）または動物（マウスの脳のスライス）。すべての平均データは、平均値 ± SEM (パラメータの標準偏差 [SD] をサンプル数の平方根で割ったもの) を示します。すべてのサンプルはランダムに選択され、分析から除外されたデータはありません。少なくとも 3 つ以上の生物学的複製を使用し、ほとんどのデータセットで SEM がそれぞれの平均の 1/10 未満になるようにサンプルサイズを選択しました。図を除く。図 3 および 5 に示されているように、多くのアッセイでは急性適用時の薬剤の同一性 (図 1、2、6、および 7)、導入遺伝子の組み合わせ (図 1 および 7) についての事前知識が必要であるため、研究者は実験または結果の評価中に割り当てについて知らされていませんでした。、または特定の時間間隔でのサンプル収集と処理（図 4）。

すべての図パネル (メインと補足の両方) の数値は、ソースデータファイルとして提供されます。ほぼ正規分布したデータセット (つまり、歪度および尖度の値が -2 > ≈ および ≈ < 2) の場合、条件間の統計的評価は、対応のない (バッチごとの比較用に対応)、両側、スチューデントの t 検定 (**) を使用して実行されました。 *P < 0.005; **P < 0.01; *P < 0.05; ns = 有意ではない、P > 0.05)。それ以外の場合は、対応する図の説明に記載されているように、両側ノンパラメトリックマン・ホイットニー U 検定を実行しました。すべてのグループごとの評価について、単一因子分散分析 (正規に近いデータ分布の場合) またはクラスカル-ウォリス検定 (正規分布からの大幅な逸脱の場合) の P 値が報告されました。

研究デザインの詳細については、この記事にリンクされている Nature Research レポートの概要をご覧ください。

ソースデータはこのペーパーに付属しています (Excel ファイルを参照)。これらには、主要な原稿 (図 1 ～ 7) と補足情報 (図 S1 ～ S10) の両方に示されているすべての個々のデータポイントと平均値が含まれます。画像化および電気生理学実験の生データは、合理的な要求に応じて、対応する著者から入手できます。 Ngn2 ニューロンの RNA 配列データセットは、我々の以前の研究によって寄託されたように、公的に利用可能な GEO リポジトリ (アクセッション番号 GSE129241) から入手できます 32。ソースデータはこのペーパーに付属しています。

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この研究は、コロラド州立大学から SC へのスタートアップ基金、および国立衛生研究所からの助成金 (SC への R01-MH126017、TCS への R37-MH052804、および MAX への R01-DC015508) によって支援されました。博士たちに感謝します。コロラド州立大学の Robert E. Cohen 氏と Tingting Yao 氏は、シナプスの超解像度画像を取得するために Airyscan 検出器を備えた Zeiss LSM 880 顕微鏡を提供していただきました。また、WTC-11 iPS 細胞株を提供してくださった NINDS の Michael E. Ward 博士にも感謝します。

これらの著者は同様に貢献しました: Scott R. Burlingham、Nicole F. Wong、Lindsay Peterkin。

生化学と分子生物学、コロラド州立大学、フォートコリンズ、コロラド州、米国

スコット・R・バーリンガム、リンジー・ピーターキン、リリー・ルボウ、カロリーナ・ドス・サントス・パソス、オリオン・ベナー、トーマス・P・キャスト、ソーハム・チャンダ

生物科学、ニューヨーク州立大学バッファロー校、バッファロー、ニューヨーク州、米国

ニコール・F・ウォン＆マシュー・A・シュー・フリードマン

生物科学、カリフォルニア州立大学フラートン校、フラートン、カリフォルニア州、米国

マイケル・ジェブリアル

分子および細胞生理学、スタンフォード大学医学部、スタンフォード、カリフォルニア州、米国

トーマス・C・ズードホフ & ソーハム・チャンダ

分子、細胞および統合神経科学、コロラド州立大学、フォートコリンズ、コロラド州、米国

ソーハム・チャンダ

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TCS と SC がこのプロジェクトを発案しました。 SC は研究を監督しました。 MAX、TCS、および SC が実験を設計しました。 SRB、NFW、LP、LL、CDSP、OB、MG、SC が実験を実施しました。 SRB、NFW、LP、OB、TPC、SC がデータを分析しました。 MAX、TCS、SC が論文を執筆しました。著者全員が原稿をレビューしました。

Matthew A. Xu-Friedman、Thomas C. Südhof、または Soham Chanda との通信。

著者らは、この研究で説明されている研究に関して、金銭的または非金銭的を問わず、競合する利益を持たないことを宣言します。実験試薬に関するすべてのリクエストは SC ([email protected]) に宛てて行う必要があります。

Nature Communications は、この研究の査読に貢献してくれた他の匿名の査読者に感謝します。査読レポートが利用可能です。

発行者注記 Springer Nature は、発行された地図および所属機関の管轄権の主張に関して中立を保っています。

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転載と許可

バーリンガム、SR、ウォン、NF、ピーターキン、L. 他新たな神経伝達物質合成によるシナプス形成の誘導。 Nat Commun 13、3060 (2022)。 https://doi.org/10.1038/s41467-022-30756-z

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受信日: 2021 年 9 月 23 日

受理日: 2022 年 5 月 17 日

公開日: 2022 年 6 月 1 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-022-30756-z

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