PSDを欠くマウス | 吉林省パッチケーブルグループ

Scientific Reports volume 5、記事番号: 16410 (2015) この記事を引用

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メトリクスの詳細

タンパク質のユビキチン化は、ニューロンの発達と機能のさまざまな側面に大きな影響を与えます。 Rnf19a としても知られる Dorfin は、筋萎縮性側索硬化症およびパーキンソン病に関与するとされるリングフィンガー E3 ユビキチンリガーゼですが、その in vivo での機能はまだ調査されていません。我々はここで、ドーフィンが興奮性シナプス後足場タンパク質PSD-95の新規結合パートナーであることを報告する。ドーフィン変異体 (Dorfin-/-) マウスは、成体神経新生の減少と海馬歯状回の長期増強を示しますが、CA1 領域では正常な長期増強を示します。行動面では、ドーフィン-/-マウスは文脈上の恐怖条件付けが障害されているが、手がかりによる恐怖条件付け、恐怖の消滅、空間学習と記憶、物体認識記憶、空間作業記憶、パターン分離は正常レベルである。プロテオミクスアプローチを使用して、我々は、Dorfin-/- 脳内でユビキチン化レベルが低下している多くのタンパク質も同定しました。これらの結果は、ドーフィンが成人の神経発生、シナプス可塑性、文脈的恐怖記憶を調節している可能性があることを示唆しています。

タンパク質のユビキチン化は、ニューロンの発達と機能のさまざまな側面を制御します。 E3 ユビキチンリガーゼは数百 (マウスとヒトでは約 400 ～ 500) ありますが、タンパク質のユビキチン化システムの重要な構成要素であり、基質特異性の決定に重要な役割を果たしています。タンパク質のユビキチン化は、26S プロテアソームによるタンパク質の分解を引き起こすことが知られています。しかし、蓄積されている証拠は、それがタンパク質間相互作用だけでなく、タンパク質機能の調節、輸送および細胞内局在化などの追加の機能も果たすことを示している。

神経系におけるタンパク質のユビキチン化は、神経新生、遊走、神経突起形成、シナプス形成などのニューロン発達のさまざまな段階を制御します1、2、3、4、5。さらに、シナプスタンパク質のユビキチン化は、シナプスの構造、機能、可塑性のさまざまな側面を制御すると考えられています。シナプスのユビキチン化の既知の基質には、足場/アダプタータンパク質、受容体、およびシグナル伝達分子が含まれます。特定の例および関連する E3 リガーゼには、PSD-95–Mdm26、GKAP/SAPAP-Trim37,8、Shank/ProSAP7、SPAR-βTRCP9,10、AKAP79/1507、Homer-1a11、CaMKIIα12、liprin-α1-APC/C13,14 が含まれます。、エフェキシン-5 – Ube3A15、Arc – Ube3a/Triad3a16,17、AMPA 受容体 (AMPAR) – Nedd4-1/RNF167/APC/C14,18,19,20,21,22、NMDA 受容体 (NMDAR) – Mib223、mGluR1α -Siah1A24,25、mGluR5-Siah1A25、GABAA受容体（γ2サブユニット）26,27、Munc13-1-Fbxo4528、RIM1-SCRAPPER29、ピッコロ/ファゴット-Siah1A30。

RING フィンガー E3 ユビキチンリガーゼである Dorfin は、当初、精母細胞および中心体の XY 体の構成要素として同定されました 31。 Dorfin (マウスでは長さ 840 アミノ酸) には、中間リング (IBR) ドメインに隣接する 2 つの RING ドメインと 2 つの膜貫通ドメインが含まれていますが、このタンパク質の正確な膜トポロジーは十分に確立されていません。以前の研究では、ドルフィンが家族性筋萎縮性側索硬化症 (ALS) およびパーキンソン病に関与していることが示されています 32,33,34,35,36,37,38,39,40。 ALS におけるドーフィンの神経保護的役割をサポートするために、ドルフィンは ALS 関連変異体 SOD1 (スーパーオキシドジスムターゼ 1) タンパク質をユビキチン化し 33、家族性 ALS のマウスモデルで過剰発現すると、変異体 SOD1 タンパク質の量を減少させ、神経学的表現型と運動機能を抑制します。ニューロン死40。しかし、タンパク質間相互作用、基質タンパク質、基質タンパク質のユビキチン化の機能的影響など、正常な脳におけるドルフィンの機能についてはほとんどわかっていません。さらに、ドーフィンの生体内機能は、遺伝子ノックアウトアプローチを使用して研究されていません。

本研究では、ドルフィンが豊富な興奮性シナプス後足場タンパク質 PSD-95 と相互作用することを発見しました。ドルフィン-/-マウスは、成体神経新生の抑制と歯状回（DG）における長期増強（LTP）の増強、および文脈的恐怖条件付けの障害を示し、ドルフィンが成体神経新生、シナプス可塑性、学習および記憶にとって重要であることを示唆している。

酵母ツーハイブリッドアッセイを使用してマウス脳 cDNA ライブラリーをスクリーニングし、PSD-95 の新規結合パートナーとして Dorfin/Rnf19a を同定しました。 Dorfin には、N 末端半分の IBR ドメインによって分離された 2 つの RING ドメインが含まれ、その後に 2 つの推定膜貫通ドメインと C 末端の PDZ ドメイン結合モチーフが続きます (図 1A)。 Dorfin の最後の 7 アミノ酸は、PSD-95 の PDZ1 および PDZ2 ドメインと相互作用しましたが、PDZ3 ドメインとは相互作用しませんでした (図 1B)。 Dorfin は PSD-95 近縁種 (PSD-93/Chapsyn-110、SAP97、SAP102) の PDZ ドメインとも相互作用しましたが、S-SCAM、GRIP2、または Shank1 のドメインとは相互作用しませんでした。最後のアミノ酸残基が変異した変異体ドーフィン (I840A) は PSD-95 と相互作用できず、これは標準的な PDZ 相互作用を示しています。これらのPDZ相互作用はGSTプルダウンアッセイによって検証され、PSD-93とSAP102はPSD-95およびSAP102と比較して弱い相互作用を示したものの、異種細胞で発現した全長PSD-95ファミリータンパク質がGST-Dorfinによってプルダウンされることが示された。 SAP97 (図 1C)。インビトロ共免疫沈降実験により、Dorfin と PSD-95 および SAP97 との PDZ 依存性相互作用が独立して確認されました (図 1D、E)。

ドルフィンは、酵母ツーハイブリッド、GST プルダウンおよび免疫共沈降アッセイにおいて PSD-95 ファミリータンパク質と相互作用します。

(A) マウス Dorfin のドメイン構造。 IBR、中間リング。 TM、膜貫通ドメイン。 PB、PDZ ドメイン結合モチーフ。 (B) ドルフィンと PSD-95 の酵母ツーハイブリッド相互作用。 PSD-95 ファミリータンパク質、S-SCAM、および pGAD10 (プレイベクター) 内の他の PDZ タンパク質の PDZ ドメインを、Dorfin (aa 834 ～ 840; 野生型および最後の Ile 残基がに変更された I840A 変異体) への結合についてテストしました。 Ala) 酵母ツーハイブリッドアッセイにおける pBHA (ベイトベクター)。 β-ガラクトシダーゼ (β-Gal) 活性: +++、<45 分。 ++、45 ～ 90 分。 +、90 ～ 240 分。 −、有意なβ-Gal活性なし。 HIS3 活性: +++、>60%。 ++、30 ～ 60%、+、10 ～ 30%、 −、大幅な伸びなし。 (C) GST-Dorfin 融合タンパク質による完全長 PSD-95 ファミリータンパク質およびコントロール PDZ タンパク質 (S-SCAM および GRIP2) のプルダウン。 GST-Dorfin (aa 834-840; WT および I840A)、または GST 単独を使用して、HEK293T 細胞で発現された指定のタンパク質を低下させ、続いてイムノブロットを行いました。 (D、E) PSD-95 または SAP97 とのドルフィンの共免疫沈降。 Flag-Dorfin (全長; WT または Δ3 の最後の 3 つの aa 残基が欠けている) および PSD-95 または SAP97 で二重トランスフェクトされた HEK293T 細胞を、Flag 抗体で免疫沈降 (IP) し、指定の抗体で免疫ブロットしました。

Dorfin の in vivo 機能を調査するために、Dorfin 遺伝子のエクソン 2 と 3 の間のイントロンを標的とする遺伝子トラップアプローチを使用して Dorfin -/- マウスを作製しました (図 2A)。トラップされた対立遺伝子は、遺伝子型決定ポリメラーゼ連鎖反応 (PCR) によって検証されました (図 2B)。逆転写 PCR (RT-PCR) および定量的 PCR (qPCR) により、Dorfin mRNA は Dorfin -/- マウスの皮質と海馬の両方で検出できないことが明らかになりました (図 2C-E)。

Dorfin-/- マウスの作製。

(A) エクソンとイントロン、およびエクソン 2 とエクソン 3 の間のイントロンにおける遺伝子トラップ挿入部位を示す Dorfin 遺伝子の構造を示す図。(B) PCR ジェノタイピングによるトラップされた Dorfin 遺伝子の同定。 (C) マウス Dorfin 遺伝子における RT-PCR および qPCR 用のプライマーと in situ ハイブリダイゼーション用のプローブの位置。 (D、E)従来のRT-PCRおよびqPCRによるDorfin-/-脳(2ヶ月)におけるDorfin mRNAの検出不能な発現。 (F) in situ ハイブリダイゼーションによって明らかにされた、WT および Dorfin-/- マウス脳切片 (2 ヶ月) における Dorfin mRNA の分布パターン。 CA1 と DG、海馬の CA1 と DG 領域。スケールバー、1 mm。 (G) in situ ハイブリダイゼーションによって明らかにされた WT ラット脳切片 (3 ヶ月) におけるドルフィン mRNA の分布パターン。 Cb、小脳。 CPUu、尾状被殻。 Ctx、大脳皮質。 OB、嗅球。みぞおち、下垂体。スケールバー、5 mm。

野生型（WT）脳とDorfin-/-の脳でのin situハイブリダイゼーション実験では、Dorfin mRNAが皮質や海馬を含むWTマウスのさまざまな脳領域で広く発現しているのに対し、Dorfin-/-の脳ではシグナルがほとんど検出できないことが示された。 (図2F)。広範なDorfin mRNAシグナルがラットの脳でも観察されました（図2G）。注目すべきことに、海馬におけるドルフィン mRNA シグナルは、特にマウスの脳において、CA1 領域よりも DG 領域で強かった。我々の結果は、マウス Dorfin mRNA に関する Allen Brain Atlas (http://www.brain-map.org/) のデータとほぼ一致しています。繰り返しの試みにもかかわらず、適切な抗体が不足しているため、ドルフィンタンパク質の発現/分布パターンを特徴付けることができませんでした。

神経マーカーであるNeuNに対する抗体を使用したWT脳およびDorfin-/-脳の免疫組織化学的染色により、Dorfin-/-脳は生後4週目および8週目に正常な肉眼的形態を有することが明らかになった（図3A、B）。さらに、ビオシチンを注入したニューロンのショール解析により、海馬の DG および CA1 領域の Dorfin-/- 主要ニューロンが正常な樹状突起形態を有することが示されました (図 3C-G)。 Dorfin-/- マウスは生後 4 ～ 8 週目に正常に成長し、雄雌ともに WT マウスと同等の体重を示しました（図 3H）。さらに、海馬ライセート、海馬の粗シナプトソーム画分、および顕微解剖したDGライセートの免疫ブロット分析により、シナプス足場および受容体タンパク質のレベルが遺伝子型間で差がないことが明らかになりました（図3I）。

Dorfin-/- マウスの一般的な特徴付け。

(A、B) 冠状および矢状切片におけるニューロンマーカー NeuN の染色によって決定された、生後 4 週目および 8 週目における Dorfin-/- 脳の正常な肉眼的形態。スケールバー、1.0 mm。 (C – G) ビオサイチン注射と Sholl 分析によって実証された、海馬 CA1 および DG 領域 (2 週間) の主要なニューロンの正常な樹状突起形態。スケールバー、50μm。 (sem、CA1 基底、WT の場合は 4 匹のマウスからの n = 6 細胞、KO の場合は 7, 5 細胞; CA1 頂端、WT の場合は n = 7, 4、KO の場合は 7, 5 細胞; DG、n = 7, 5 の WT および 6 、KOの場合は5）。 (H) 生後 4 ～ 8 週目の雄および雌の Dorfin-/- マウスの正常体重。（標準誤差、n = WT男性の場合は17、KO男性の場合は19、WT女性の場合は17、KO女性の場合は14）。 (I) 海馬全体のライセート、粗シナプトソーム (P2) 海馬画分、および顕微解剖した全 DG ライセートのイムノブロット分析によって実証された、Dorfin-/- 海馬 (2 ～ 3 か月) のシナプス足場および受容体タンパク質の正常レベル (標準誤差) 、WTおよびKOの場合はn = 3〜6）。

ドーフィンは豊富な興奮性シナプス足場タンパク質である PSD-95 と相互作用するため、我々はドーフィン -/- マウスにおける興奮性シナプス伝達の変化の可能性を調査しました。 Dorfin-/- DG 領域の顆粒細胞は、WT ニューロンと比較して、小型興奮性シナプス後電流 (mEPSC) の振幅の増加を示したが、周波数の増加は示さなかった (図 4A)。対照的に、これらのニューロンでは、小型抑制性シナプス後電流（mIPSC）の周波数と振幅の両方が正常でした（図4B）。さらに、DG顆粒細胞上のDorfin-/-内側穿孔経路シナプス（MPP-DGシナプス）の入出力曲線は、ファイバーボレー振幅に対してプロットされたフィールドEPSP（fEPSP）の傾きによって測定されるように、正常でした（図4C））。最後に、刺激間間隔に対するペアパルス比プロットは正常であり (図 4D)、シナプス前解放確率が変化していないことを示唆しています。

Dorfin-/- 海馬の DG 領域で LTP が増強されましたが、CA1 領域では増強されません。

(A) Dorfin-/- DG 顆粒細胞における mEPSC の振幅の増加、ただし頻度は正常 (WT の場合は 5 匹のマウス、KO の場合は 21、3 匹のマウスからの P15 ～ 17、sem、n = 19 細胞、*p < 0.05、ns、有意ではない、スチューデントの t 検定)。（B）Dorfin-/- DG顆粒細胞におけるmIPSCの通常の頻度と振幅（P15〜17、sem、n = 17、WTの場合は4、KOの場合は15、4、ns、有意ではない、スチューデントのt検定）。 (C) Dorfin-/- MPP-DG シナプスにおけるファイバーボレー振幅に対するフィールド EPSP (fEPSP) の傾きをプロットすることによって決定された通常の入出力曲線 (3 週間、WT の場合は 4 匹のマウス、KO の場合は 13、4 匹のマウスからの n = 11 スライス) ）。 (D) Dorfin-/- MPP-DG シナプスでの刺激間間隔に対する 2 つの連続する fEPSP 勾配の比をプロットすることによって決定された正常なペアのパルス比 (3 週間、n = 4 匹の WT マウスからの 11 スライスと 13、KO の場合は 4) ）。（E）Dorfin-/- MPP-DG シナプスにおける 4 つの HFS 列によって誘発された LTP の増強（4 週間、標準誤差、n = WT の場合は 4 匹のマウス、KO の場合は 8、7 匹からの 7 スライス、*p < 0.05、スチューデントの t-テスト）。 (F) Dorfin-/- MPP-DG シナプスにおける正常な NMDA/AMPA 比。-70 (AMPA) および +40 (NMDA) mV の保持電位で誘発された fEPSP の傾きを比較することによって決定されました (3 週間、標準誤差、n = 11) WT の場合は 6 匹、KO の場合は 8、4 匹のマウスからの細胞、ns、有意ではない、スチューデントの t 検定）。（G）Dorfin-/- CA1錐体細胞におけるmEPSCの通常の周波数と振幅（WTの場合は3匹のマウスからのP15-17、sem、n = 14細胞、KOの場合は11、3、ns、有意ではない、スチューデントのt検定）。（H）Dorfin-/- CA1錐体細胞におけるmIPSCの通常の周波数と振幅（P15〜20、sem、n = 11、WTの場合は3、KOの場合は13、4、ns、有意ではない、スチューデントのt検定）。 (J) Dorfin-/- SC-CA1 シナプスにおける HFS によって誘導された正常な LTP (4 週間、WT の場合は 6 匹のマウス、KO の場合は 8、5 匹からの n = 10 スライス、ns、有意ではない、スチューデントの t 検定)。

興味深いことに、4 連の高周波刺激 (HFS; 100 Hz) によって誘導された MPP-DG シナプスでの LTP は、WT マウスと比較して Dorfin-/- マウスで有意に増強されました (図 4E)。 MPP-DG シナプスにおける LTP は NMDAR に依存することが知られているが、これらのシナプスにおける NMDAR および AMPAR 媒介電流の比率は変化していないため、これは NMDAR 機能の増加に起因するとは思われない (図 4F)。、42。

海馬の CA1 領域も、DG よりも程度は低いものの、Dorfin mRNA を発現するため、この領域における mE/IPSC および LTP の変化の可能性をテストしました。我々は、mEPSCもmIPSCもDorfin-/- CA1錐体ニューロンでは変化していないことを発見した（図4G、H）。さらに、HFS（100Hz）によって誘導されたLTPは、Dorfin-/-Schaffer側副CA1錐体（SC-CA1）シナプスでは変化しなかった（図4I）。これらの結果は、ドーフィン欠失が MPP-DG シナプスにおける LTP の増強につながるが、SC-CA1 シナプスではそうではないことを示唆しています。

次に、Dorfin-/- マウスが何らかの行動異常を示すかどうかを調査しました。ドルフィン -/- マウスは、マウスを試験前 3 日間慣れさせた慣れた環境での動きの 48 時間連続モニタリングによって測定されたように、慣れた環境でのライトオフフェーズ中に運動活性の向上を示しました（図 5A）。）。対照的に、オープンフィールド試験で測定したところ、ドルフィン -/- マウスは新しい環境において正常な移動運動を示し（図5B）、これは、ドルフィン -/- マウスが慣れ親しんだ環境では多動であるが、新しい環境では多動であることを示唆している。

ドルフィン-/-マウスは、慣れ親しんだ環境では多動性を示しますが、新しい環境ではそうではなく、正常レベルの不安様行動、身づくろい、発作傾向、社会的相互作用、および運動調整を示します。

(A) ドルフィン -/- マウスは、24 時間サイクルで平均した慣れ親しんだ環境でのマウスの動きを 48 時間連続モニタリングすることで測定したように、慣れた環境で運動活動の向上を示します (Laboras、WT については n = 9 マウス、11 マウス) KO の場合、二元配置分散分析、ボンフェローニ事後分析、***p < 0.001、**p < 0.01、*p < 0.05、総移動距離のスチューデント t 検定)。 (B) ドルフィン -/- マウスは、オープンフィールドテスト (新しい環境) で正常な運動活動を示します。中央領域で費やされる時間も通常どおりであることに注意してください。 (sem、n = WT で 13 匹、KO で 11 匹、ns、有意ではない、二元配置分散分析、ボンフェローニ事後分析、スチューデントの t 検定)。 (C–E) ドルフィン -/- マウスは、高架十字迷路 (C)、明暗ボックス (D)、および新規性抑制摂食試験 (E) で正常レベルの不安様行動を示します (sem、n = 8 マウス)高架十字迷路および明暗ボックステストにおける WT および KO マウス、および新規性抑制摂食テストにおける WT および KO マウスの 19、ns、有意ではない、スチューデントの t 検定）。（F–I）ドルフィン-/-マウスは、正常レベルのセルフグルーミング（F）、PTZ誘発発作（G）、三腔社会的相互作用（H）、およびロータロッド運動調整（I）を示します（sem、n = 8） WT および KO [セルフグルーミング] マウス、WT 17 匹および KO [発作] 14 匹、WT および KO [3 腔] 8 匹、および WT および KO [ロータロッド] 12 匹、ns、有意ではない、Student's t-テスト）。

次に、Dorfin-/- マウスが不安様行動を示すかどうかを 3 つの異なるテストによってテストしました。ドルフィン -/- マウスは、オープンフィールドアリーナの中央領域（図 5B）、高架十字迷路の開閉アーム（図 5C）、および明暗室で通常の時間を過ごしました。明暗ボックスの（図5D）。新規性抑制摂食試験では、WT マウスと Dorfin -/- マウスは、新規のオープンフィールドでの給餌までの潜伏期間が同等のレベルを示しました (図 5E)。これらの結果は、Dorfin-/- マウスが不安様行動を示さないことを示しています。

最後に、ドーフィン -/- マウスは、3 チャンバーテストで正常レベルのセルフグルーミング行動 (図 5F)、ペンチレンテトラゾール (PTZ) 誘発発作 (図 5G)、社会的相互作用および社会的新規性認識 (図 5H) を示しました。）およびロータロッドテストでのモーター調整（図5I）。これらの結果を総合すると、ドルフィン -/- マウスは、慣れた環境ではあるが新しい環境では運動活動の特異的な増加を示し、一方、他の試験された行動は正常であることを示している。

Dorfin-/- マウスは海馬 DG 領域の LTP の亢進を示すため、我々は Dorfin-/- マウスに一連の学習および記憶行動テストを実施しました。空間学習と記憶を測定するモリス水迷路テストでは 43、Dorfin-/- マウスは学習、探査、反転段階で正常に動作しました (図 6A)。ドルフィン -/- マウスは、空間作業記憶を測定する T 迷路報酬変化テストおよび T 迷路自発的変化テストでも正常に成績を示しました 44 (図 6B、C)。物体認識記憶と新規物体の好みを測定する新規物体認識テストでは、WT マウスと Dorfin-/- マウスは新規物体に対して同様の好みを示しました (図 6D)。

Dorfin-/- マウスは、文脈的恐怖記憶に特有の欠陥を示しますが、他のタイプの学習および記憶行動には欠陥を示しません。

(A) ドーフィン -/- マウスは、モリス水迷路テストの学習、プローブ、および反転段階で正常な空間学習と記憶を示します (T: ターゲット、L: 左、R: 右、O: 反対、標準偏差、n = 14) WT の場合はマウス、KO の場合は 16 匹、ns、有意ではない、二元配置分散分析、ボンフェローニ事後分析、スチューデントの t 検定）。 (B、C) ドルフィン -/- マウスは、T 迷路報酬型 (B) および自発的 (C) 変化テストで正常な空間作業記憶を示します (2 日間にわたる 8 回の試行が 1 つのブロックを構成します。sem、報酬型、WT の n = 7) KOの場合は8、自然発生、WTの場合はn = 9、KOの場合は11、ns、有意ではない、二元配置分散分析、ボンフェローニ事後分析、スチューデントのt検定）。 (D) ドルフィン -/- マウスは、WT マウスに匹敵する新規オブジェクト嗜好性を示します (sem、n = 8 WT および 10 KO 、ns、有意ではありません、スチューデントの t 検定)。 (E – G) ドーフィン -/- マウスは、文脈的恐怖記憶の低下を示しますが、正常な恐怖消去と手がかり恐怖条件付けを示します。 (sem、文脈的恐怖条件付け、WT および KO について n = 16、文脈的恐怖消去、WT および KO について n = 16、手掛かり恐怖条件付け、WT について n = 13、KO について 15、ns、有意ではない、***p < 0.001、二元配置分散分析、ボンフェローニ事後分析、スチューデントの t 検定)。 (H) ドルフィン -/- マウスは、成体 DG における神経新生の抑制を示します。 BrdUを注射したマウス（6週間）の海馬切片をBrdU、ダブルコルチン（DCX）、DAPIで三重標識し、BrdU陽性細胞の数、ならびにDAPI陽性細胞に対して正規化したBrdUとDCXの二重陽性細胞の数を定量した。スケールバー、50μm。 (標準誤差、WT の場合は n = 3 マウス、KO の場合は n = 4 マウス、*p < 0.05、スチューデントの t 検定)。 (I) Dorfin-/- マウスにおける正常パターンの分離。 (sem、WT では n = 9 マウス、KO では n = 7、ns、有意ではない、スチューデントの t 検定、二元配置分散分析、ボンフェローニ事後)。

文脈的恐怖条件付けテストでは、ドーフィン-/- マウスは、WT マウスと比較して、条件付け後 24 時間で同じショックチャンバー内でのすくみの減少を示しました (図 6E)。対照的に、ドーフィン -/- マウスは、WT マウスと同等の文脈的恐怖消去および手がかり恐怖条件付けを示しました (図 6F、G)。これらの結果を総合すると、ドーフィン -/- マウスは状況に応じた恐怖条件付けに特有の欠陥があるが、他の種類の学習や記憶には欠陥がないことが示唆されています。

Dorfin-/- マウスの DG 領域で観察された mEPSC 振幅と LTP の増加は、DG45 のシナプス可塑性を調節することが知られている成体神経新生の変化と関連している可能性があります。 DG顆粒細胞層の内側境界領域の細胞を分裂細胞のマーカーであるBrdUで標識すると、成体Dorfin-/- DG（6週間）ではBrdU陽性細胞の数が、それと比較して有意に減少した。 WTマウスにおける（図6H）。さらに、BrdU と新しく生成されたニューロンのマーカーであるダブルコルチンに対して二重陽性の細胞の数が、Dorfin-/- DG では大幅に減少しました。これらの結果は、ドルフィン欠失が成体 DG における神経新生の抑制につながることを示しています。

成人の DG における神経発生は、空間的/文脈的な学習と記憶に加えて、空間パターンの分離と関連しています 45,46,47。したがって、我々はDorfin -/- マウスに文脈弁別テストを行ったところ、Dorfin -/- マウスは通常、2つの類似した文脈（そのうちの1つはフットショックに関連している）を区別することを学習できることが判明した（図6I）。

ドーフィンが脳内でユビキチンリガーゼとして作用するのであれば、ドーフィン-/-脳内のドーフィン基質タンパク質のユビキチン化レベルの減少を観察できるはずです。この目的を達成するために、ユビキチン化タンパク質の K-GG ペプチドを標的とする抗体を使用して海馬ライセートを免疫沈降し、続いて沈殿物の液体クロマトグラフィー - タンデム質量分析 (LC-MS/MS) 分析を行いました (図 7A)。

Dorfin-/- 海馬におけるユビキチン化が低下したタンパク質のプロテオミクス同定。

(A) Dorfin-/- 脳内でユビキチン化が変化したタンパク質を同定する手順。海馬溶解物からのユビキチン化ペプチドを K-GG 抗体で免疫アフィニティー精製し、タンデム質量分析 (LC-MS/MS) 分析により定性的配列決定、標的部位の同定および定量を行いました。 (1 つのサンプルでそれぞれ、WT については n = 6 匹のマウス、KO については 8 匹のマウス)。 (B) WT コントロールと比較して、Dorfin-/- 海馬においてユビキチン化レベルが 2.5 倍を超えて減少しているタンパク質のリスト (補足表 1 も参照)。緑色の丸は、その発現レベルが海馬溶解物の免疫ブロットによって試験されたタンパク質を示す（図７Ｈも参照）。 (C-G) ドーフィンは、図 7B のリストから選択された 5 つのタンパク質と複合体を形成します。 Myc-Dorfin と示されたタンパク質を二重発現する HEK293 細胞を免疫沈降し、Myc または EGFP 抗体で免疫ブロットしました。 Rab11b (C)、NFM (D)、PPP1CA (E)、PPP1CB (F)、および H2AFZ (G)。入力、5%。 (H) 全海馬ライセート、粗シナプトソーム (P2) 海馬画分、および顕微解剖された全 DG ライセートの免疫ブロット分析によって決定された、WT コントロールと比較した Dorfin-/- 海馬 (2 ～ 3 か月) のタンパク質発現レベル。 (標準誤差、WT および KO 海馬の n = 3 ～ 6)。

陽性タンパク質をユビキチン化の減少が大きい順に並べ替え、WTコントロールと比較してDorfin-/-脳でユビキチン化レベルが大幅に減少した（>2.5倍）24個のタンパク質のリストを作成しました（補足表S1）。これらのタンパク質は、接着分子/細胞外マトリックス、アダプター/足場、Gタンパク質関連タンパク質、ホスファターゼ、プロテアーゼ、酵素、細胞周期/クロマチン調節タンパク質など、いくつかの機能グループに分類できます(図7B)。

異種細胞における免疫共沈降実験を使用して、これらのタンパク質のいくつかとドーフィンとの会合を検証しました（図7C-G）。これらのタンパク質には、Rab11b (低分子量 GTPase)、ニューロフィラメント M、PP1 ホスファターゼの α および β サブユニット、およびヒストン H2A が含まれていました。予想外なことに、異種細胞でドルフィンと共発現させた場合、これらの5つのタンパク質はいずれもユビキチン化されないことがわかりました（補足図1）。さらに、海馬溶解物、海馬の粗シナプトソーム画分、および顕微解剖したDG溶解物の免疫ブロット分析によって測定したところ、それらのタンパク質レベルはDorfin-/-マウスでは変化しなかった（図7H）。さらに、ATP6V1A、プレキシン A1/A4、NPEPPS、14-3-3 η/ζ、ゲルソリンなど、リスト内の他のタンパク質の発現レベルに変化はありませんでした (図 7H)。したがって、生体内でのドルフィン欠失は、試験したタンパク質のレベルの検出可能な減少を引き起こさないように思われる。

私たちの研究は、マウスのドーフィン欠失がDGの神経新生の減少、MPP-DG経路のLTPの増強、および文脈的恐怖条件付けにおける特異的な行動の欠損を引き起こすが、他の種類の学習や記憶ではそうではないことを示しています。また、我々は、PSD-95の新規結合パートナーとしてDorfinを同定し、Dorfin-/-マウスにおいてユビキチン化レベルが低下する多くのタンパク質を同定した。

ドルフィンと PSD-95 間の相互作用の機能的重要性は、本研究では直接調査されていません。しかし、PSD-95 が興奮性シナプスに豊富に存在する足場タンパク質であることを考えると、他の多くの PSD-95 相互作用タンパク質で実証されているように、PSD-95 がドルフィンのシナプス標的化を促進する可能性があります 48,49。あるいは、PSD-95 は多様な膜、シグナル伝達および足場/アダプタータンパク質と相互作用するマルチドメインタンパク質であるため 49、E3 リガーゼはアダプター/足場タンパク質と相互作用して基質タンパク質のスペクトルを広げることがよくあります 1、2、3、4、5。 PSD-95は、Dorfinがさまざまな基質と相互作用するためのゲートウェイとして機能する可能性があります。これは、シナプス PDZ タンパク質 CASK/LIN-2 と、興奮性シナプスの数と強度を負に制御し 51、有糸分裂後ニューロンを興奮毒性から保護することが知られている E3 ユビキチンリガーゼである Parkin50 との相互作用を思い出させます。別の例は、シナプス前タンパク質の集合を制御する2つの大きな活性ゾーンタンパク質であるピッコロとファゴットとSiah1（E3ユビキチンリガーゼ）との相互作用であり、これはシナプス前タンパク質の分解を調節することによってシナプスの完全性の維持を促進すると考えられています30。

ドルフィン -/- マウスは、海馬において 2 つのシナプス表現型を示しました。DG 顆粒細胞における mEPSC 振幅の増加と、MPP-DG シナプスにおける HFS 誘導性 LTP の増強です。これらの結果は、ドーフィンがLTPだけでなくシナプスAMPARにも悪影響を与える可能性があることを示唆しています。行動面では、ドーフィン-/-マウスは文脈的恐怖条件付けにおいて特異的な障害を示したが、空間学習と記憶（モリス水迷路）、新規物体認識記憶、空間作業記憶（T迷路）、恐怖の消滅、手がかりとなる恐怖の条件付け、パターンの分離。

ドルフィン欠失がどのようにして DG における mEPSC の振幅と LTP の増加につながるのかは不明ですが、基礎条件下または LTP 中の AMPAR の数または機能の増加が関与している可能性があります。 AMPAR の GluA1 サブユニット上の 2 つの部位、S831 および S845 のリン酸化は、AMPAR の生物物理学的特性および AMPAR を介したシナプス可塑性の調節に関与しています 54,55。しかし、我々のデータは、この可能性を除いて、これらのリン酸化のレベルがドーフィン-/-の脳では変化していないことを示した。

私たちのデータは、E3 ユビキチンリガーゼがシナプス可塑性、学習、記憶を調節しているという概念をさらに裏付けるものです。マウスでは母親の Ube3A (ユビキチンタンパク質リガーゼ E3A) の欠損が LTP を抑制し、文脈上の恐怖条件付けを損なうことが示されています 56。さらに、ラットにおけるPraja2（プラジャリングフィンガー2、E3ユビキチンプロテインリガーゼ）のノックダウンは、後期LTP57を抑制します。後期 LTP および文脈的恐怖条件付けは、Mindbomb-1-/- マウス 58 および APC/C-Cdh1-/- マウス 59,60 で抑制されます。最後に、LTP の強化と恐怖条件付けの抑制が、それぞれ Scrapper-/- および Scrapper+/- マウスで観察されます 61,62。

私たちの結果は、海馬のDG（CA1ではない）領域のE3欠失がLTP、学習、記憶を変化させるという点でユニークです。これは、海馬の DG 顆粒細胞と空間行動および文脈上の恐怖条件付けとの関連が報告されている 63,64,65 と一致しています。さらに、これは、APC/C-Cdh1-/- マウスの扁桃体 66、パーキン線条体で以前に観察されたように、海馬 CA1 領域に加えてさまざまな脳領域の E3 リガーゼがシナプス可塑性の調節に重要であることを示唆しています。 −マウス６７およびＵｂｅ３ａｍ−／ｐ＋マウス６８の視覚野。

注目すべき発見は、我々の予想に反して、Dorfin-/- マウスにおける LTP の低下ではなく増強が、文脈上の恐怖条件付けの障害と関連していることであった。しかし、例えば、Fmr2、Gα1、PDE4D、IRSp53、およびSCRAPPERタンパク質を欠くマウスに関する以前の研究では、シェーファー側副路における海馬LTPの亢進と文脈的恐怖条件付けの低下が関連付けられている61,62,69,70,71,72,73。これらの結果は、我々の結果と合わせると、DG 領域または CA1 領域のいずれかの方向への海馬 LTP の偏位が、学習と記憶において同様の障害を引き起こす可能性があることを示唆しています。

Dorfin-/- マウスにおける LTP の亢進と文脈的恐怖条件付けの障害につながるメカニズムはまだ解明されていないが、Dorfin-/- マウスにおいてユビキチン化レベルが 2.5 倍を超えて減少したタンパク質のリストは、いくつかの出発点を提供する可能性がある。実際、これらのタンパク質の多くはシナプス後密度（PSD）が豊富で、興奮性シナプス伝達、シナプス可塑性、学習と記憶の調節に関与していると考えられています（補足表S1）。例えば、Rab11a/b は、LTP74、75、76、77 中の樹状突起スパインへのリサイクルエンドソームの転座と GluA1 の局所エキソサイトーシスを促進します。したがって、ドルフィン依存性のユビキチン化と Rab11a/b タンパク質の分解は、LTP を負に制御すると考えられます。さらに、シグナル伝達アダプター 14-3-3η および 14-3-3ζ が阻害タンパク質の遺伝子発現によって機能的に阻害されているトランスジェニックマウスは、NMDAR のシナプス内容、NMDAR 媒介シナプス伝達、LTP および文脈的恐怖条件付けの減少を示します 78 、14-3-3ηと14-3-3ζがシナプス可塑性と学習と記憶を積極的に調節していることを示唆しています。したがって、これらの機能は、ドーフィン依存性の 14-3-3 タンパク質分解によって抑制される可能性があります。

我々の当初の予想に反して、我々のデータは、ドーフィン-/-マウスにおいてユビキチン化の減少を示したタンパク質の一部が、それらがインビトロでドルフィンと結合することを我々が実証したにもかかわらず、変異脳では正常レベルで発現したことを示している。しかし、タンパク質のユビキチン化には、タンパク質機能の調節、エンドサイトーシス、細胞内局在化、タンパク質間相互作用など、タンパク質分解以外の機能があることが示されています1、2、3、4、5。我々のデータは、Dorfinと複合体を形成することが証明された少なくとも5つのタンパク質（Rab11b、ニューロフィラメント-M、PP1-α触媒サブユニット、PP1-β触媒サブユニットおよびヒストンH2A.Z）が、異種細胞では直接ユビキチン化されていないことを示している。これらのタンパク質が、公平なスクリーニングによってDorfin-/-海馬ではユビキチン化が少ないことが判明したことを考えると、それらのユビキチン化には神経/脳環境に特有の特定の条件が必要であるか、またはこれら5つのタンパク質以外のいくつかのタンパク質は異種環境においてDorfinによってユビキチン化される可能性がある。細胞。

最後に、我々の結果は、Dorfin-/- 成体 DG における神経新生が抑制されていることを示しています。 DG における成人の神経新生は、DG シナプスにおけるシナプス可塑性と、パターン分離、空間的/文脈的学習および記憶を含む海馬依存性行動の調節に関与しているため 45,46,47,79、Dorfin-/- 成人における神経新生の減少DG は、これらのマウスにおける LTP の強化と状況的恐怖条件付けの障害に関連している可能性があります。しかし、成人の神経新生の減少はLTPとLTD80の両方を抑制することが示されているため、神経新生の減少がLTPの亢進（ただし抑制ではない）と関連しているという我々の結果は、以前の結果とは異なります。しかし、以前の研究では、成人のDGにおける神経新生の低下は、文脈上の恐怖条件付けにおけるパフォーマンスの低下と関連しており45,81、これは我々の結果と一致している。

結論として、我々の研究は、E3ユビキチンリガーゼDorfinがPSD-95の新規リガンドであることを特定し、Dorfinが成人の神経新生、興奮性シナプス伝達、シナプス可塑性および文脈的恐怖条件付けを調節する可能性があるという仮説を支持する生体内証拠を提供する。

全長ドーフィン cDNA をラット脳 cDNA ライブラリーから PCR によって増幅し、GW1 (British Biotechnology) にサブクローニングしました。 Flag-Dorfin については、GW1 のラット Dorfin を PCR 増幅し、p3XFLAG-CMV-7.1 ベクター (Sigma) にサブクローニングしました。 Myc-Dorfin の場合、全長ラット Dorfin を pGW1-Myc にサブクローニングしました。 GST プルダウン用の完全長 PSD-95、EGFP-PSD-93、EGFP-SAP97、EGFP-SAP102、EGFP-S-SCAM、Myc-GRIP2 が説明されています82。全長 pCFP-Rab11b は、KAIST の Wondo Heo 博士からの親切な贈り物でした。全長 pEGFP-mNFM、pEGFP-PP1α、pEGFP-PP1β、および pRK5-HA-Ub は、Addgene から入手しました (それぞれ ID # 32909、44224、44223、および 17608)。 pEGFP-H2Afzは、マウス脳cDNAライブラリーからPCRによって増幅され、pEGFP-N1にサブクローニングされました。

以下の抗体が記載されています: EGFP83、PSD-93、SAP97、SAP102、S-SCAM84、および GluA185。以下の抗体は商業供給元から購入しました: マウスモノクローナル PSD-95 K28/43、GluN2B N59/36 (UC Davis/NIH NeuroMab Facility) NR1/GluN1 (BD Pharmingen)、GluN2A、NPEPPS、NeuN (Millipore)、pGluR1 S831、およびS845 (細胞シグナル伝達)、GluA2、ウサギポリクローナルおよびマウスモノクローナル Myc、ATP6V1A、Rab11、14-3-3η、14-3-3ζ、PP1、ユビキチン (Santa Cruz Biotechnology)、マウスモノクローナル HA (Roche Molecular Biochemicals)、マウスモノクローナル Flag M2 (Sigma)、α-チューブリン (Sigma)、GABARα1 (SySy)、ダブルコルチン、プレキシン A1 および A4、ゲルソリン (Abcam)、BrdU (Novus Biologicals)。免疫ブロットアッセイは、Odyssey Fc (LI-COR Biosciences) を使用して実施されました。

マウス Dorfin の最後の 7 アミノ酸 (aa 834 ～ 840、WT および I840A) は、オリゴヌクレオチドをアニーリングし、それらを pBHA にサブクローニングすることによって生成されました。以前に記載されているように、さまざまなタンパク質の PDZ ドメインを pGAD10 (プレイベクター: Clontech) にサブクローニングしました 86。酵母ツーハイブリッドアッセイは、以前に記載されているように実行されました87。

プルダウンでは、マウス Dorfin の最後の 7 アミノ酸 (aa 834 ～ 840、WT および I840A) を、オリゴヌクレオチドをアニーリングし、それらを pGEX-4T-1 (Amersham Pharmacia Biotech) にサブクローニングすることによって生成しました。プルダウンのために、HEK293T 細胞を PSD-95、EGFP-SAP97、EGFP-PSD-93、EGFP-SAP102、EGFP-S-SCAM、Myc-GRIP2 でトランスフェクトしました。プルダウンされた沈殿は、PSD-95、EGFP、および Myc 抗体を用いたイムノブロッティングによって分析されました。

in situ ハイブリダイゼーションは、以前に記載されているように実行されました 82。マウス Dorfin mRNA のハイブリダイゼーションプローブは、マウス Dorfin (NM_013923.2) の nt 2161 ～ 2820 を使用して調製し、pGEM-7Zf ベクターにサブクローニングしました。ラット Dorfin mRNA のハイブリダイゼーションプローブは、ラット Dorfin (NM_001130560.1) の nt 2609 ～ 3187 を使用して調製し、pGEM-7Zf ベクターにサブクローニングしました。

Myc-Dorfin および HA-ユビキチンを、EGFP-Rab11b、EGFP-NFM、EGFP-PPP1CA、PPP1CB-EGFP、または H2Afz-EGFP を用いて HEK293 細胞に三重に、または二重に (ドーフィンなしで) トランスフェクトしました。希釈バッファー (10 mM Tris-HCl、150 mM NaCl、2 mM EDTA、1% Triton X-100) に希釈した細胞溶解物 (2% SDS、150 mM NaCl、10 mM Tris-HCl) を EGFP 抗体とインキュベートしました。続いて免疫沈降分析とイムノブロット分析を行います。

Dorfin-/- マウスは、TIGM (OST244733) から取得した Dorfin 遺伝子のエクソン 2 とエクソン 3 の間のイントロンに挿入されたジーントラップカセットを備えたマウス精子から生成されました。 129/SvEv の遺伝的背景を持つマウスを C57BL6 マウスと 5 世代以上戻し交配しました。実験用マウスは、雄と雌のヘテロ接合マウスを交配させることにより得た。マウスは KAIST の動物研究の要件に従って維持され、すべての手順は KAIST の動物研究委員会 (KA2012-19) によって承認されました。マウスを含むすべての実験は、関連するガイドラインと規制に従って実行されました。マウスは、12 時間の明暗サイクルの下、標準的なケージ環境で飼育されました。

ジェノタイピング PCR 用のプライマーは、5'-CGG-GCT-GGG-TTT-ACA-TAG-AA-3' (WT 5')、5'-GAC-CCA-AAT-GTC-CAT-CAA-CC-3' ( WT 3') および 5'-CAA-AAT-GGC-GTT-ACT-TAA-GC-3' (トラップ 5')。 RT-PCR用のプライマーは4セットから構成されました。ドーフィン 1: 5'-ACT-GAA-CGG-TTT-AAT-CCT-C-3' および 5'-CTG-TTC-CAC-AGC-CTT-CTC-3'。ドーフィン 2: 5'-TGT-TTC-AAC-AGG-TTG-GAA-GTA-3' および 5'-GCG-TTA-TCA-CTA-ACT-GTT-CCC-AAG-3'。ドーフィン 3: 5'-ATC-AAG-GGA-GCT-CAA-TGG-TGG-3' および 5'-GCA-TCA-CAG-GTC-TGG-TTT-GG-3'ドーフィン 4: 5'-GCA- AGA-TGG-TGG-CAG-TTT-TT-3 'および 5'-CTA-ATG-GGA-CCG-TCT-TCT-GC-3'。 qPCR 用のプライマーは、5'-ACT-GAA-CGG-TTT-AAT-CCT-C-3' および 5'-CTG-TTC-CAC-AGC-CTT-CTC-3' でした。

脳スライスは、4 週目と 8 週目のマウスから調製されました。脳切片 (50 μm) を 0.5% TritonX-100 で 30 分間透過処理し、NeuN 抗体で染色しました。 24時間後、切片を二次抗体で2時間染色し、続いて共焦点顕微鏡(LSM780、Carl Zeiss)で画像を取得した。

5-ブロモ-2'-デオキシウリジン (BrdU、Sigma) をマウス (6 週間) に 3 日間腹腔内注射しました (50 mg/kg)。最後の注射から 5 日後、マウスに 4% パラホルムアルデヒドを灌流しました。ビブラトームによって得られた固定脳スライス（50μm）を氷上で1N HCl中で10分間インキュベートし、続いて室温で10分間2N HCl中でインキュベートした後、37℃のインキュベーターに20分間移動した。ホウ酸緩衝液（０．１Ｍ）を室温で１２分間スライスに添加した。次に、スライスを BrdU および DCX 抗体とともに 4 °C で 12 時間インキュベートし、続いて二次抗体染色し、Vectashield および DAPI を使用してマウントしました。スライス画像は共焦点顕微鏡 (LSM780、Zeiss) によって取得されました。

海馬の CA1 領域の錐体ニューロンと DG 領域の顆粒細胞をランダムに選択し、ビオサイチン (0.5%) を 5 分間注入しました。注射後、スライスを収集し、4% パラホルムアルデヒドで 24 時間固定しました。切片をストレプトアビジン抗体で染色した。画像は 20 倍の対物レンズ (LSM 780、Carl Zeiss) を使用して取得されました。樹状枝の交差部分は、ブラインド方式で手動で分析されました。

成体マウス海馬 (2 ～ 3 か月) の粗シナプトソーム (P2) 画分を、以前に記載されているように調製しました 88。全海馬/DG ライセートは、均質化バッファー (0.32 M スクロース、10 mM HEPES、2 mM EDTA) を使用して調製しました。 DG 顕微解剖では、ビブラトームを使用して脳スライス (400 μm) を切断し、DG を解剖しました。

海馬組織を液体窒素で凍結し、K-GG ペプチド免疫沈降および LC-MS/MS (LTQ-Orbitrap-Velos および ESI-CID) を使用した Ubiscan 分析 (細胞シグナル伝達) を行いました。 MS/MS スペクトルは、Sage-N Research (v 4.0、Milpitas CA) の SEQUEST 3G および SORCERER 2 プラットフォームを使用して分析しました。

海馬の矢状スライス (全細胞記録の場合は 300 μm、フィールド記録の場合は 400 μm) を、氷冷切片緩衝液 (212 mM スクロース、25 mM NaHCO3、5 mM KCl、1.25 mM NaH2PO4、 10 mM D-グルコース、2 mM ピルビン酸ナトリウム、1.2 mM アスコルビン酸ナトリウム、95% O2/5% CO2 でバブリングした 3.5 mM MgCl2 および 0.5 mM CaCl2)、aCSF (125 mM NaCl、25 mM NaHCO3、 2.5 mM KCl、1.25 mM NaH2PO4、10 mM D-グルコース、1.3 mM MgCl2 および 2.5 mM CaCl2)。 30分後、スライスを室温に維持した。全細胞パッチクランプ記録および電界電位記録は、前述のように実行されました72。録音は Multiclamp 700B アンプと Axopatch 200B を使用して実行されました。データは、Clampfit 10.2 (Molecular Devices) を使用して分析されました。

mEPSC と NMDA/AMPA 比の全細胞記録は、内部溶液 (117 mM CsMeSO4、10 mM TEA-Cl、8 mM NaCl、10 mM HEPES、5 mM QX-314) を満たした記録ピペット (3 ～ 5 MΩ) を使用して行われました。 -Cl、4 mM Mg-ATP、0.3 mM Na-GTP、および 10 mM EGTA)。 mIPSC 測定では、115 mM CsCl、10 mM TEA-Cl、8 mM NaCl、10 mM HEPES、5 mM QX-314-Cl、4 mM Mg-ATP、0.3 mM Na-GTP、 10mM EGTA。すべての内部溶液は、pH 7.3 および 290 ～ 300 mOsm になるように調整されました。シグナルは、mEPSC および mIPSC の場合は 1.0 kHz、NMDA/AMPA 比実験の場合は 2.0 kHz でフィルターされました。 mEPSCの場合、ピクロトキシン(50μM)およびTTX(0.5μM)をaCSFに添加した。 mIPSC記録のために、ピクロトキシン(50μM)、NBQX(10μM)およびAP5(25μM)を添加した。 NMDA/AMPA 比実験では、ピクロトキシン (100 μM) を添加しました。 mEPSC および mIPSC の記録は、-70 mV の保持電位で 2 分間実行されました。 NMDA/AMPA比実験では、MPP-DG経路に配置されたaCSFを含むガラスピペットを用いてEPSCを誘発した。 AMPA EPSC は -70 mV で記録されました。 25 ～ 30 の安定したトレースを取得した後、保持電位を +40 mV に変更して NMDA EPSC (20 トレース) を記録しました。刺激後 50 ms の NMDA EPSC を NMDA/AMPA 比に使用しました。

電場電位の記録は、aCSF で満たされた記録ピペットを使用して行われました。入出力およびペアパルス比の記録では、主な実験が始まる前に安定した fPEEP が 10 分間記録されました。入出力記録では、0.05 ～ 0.3 mV/ms のファイバーボレー振幅を誘発するように刺激を徐々に増加させ、刺激ごとに 3 つのトレースを記録しました。ペアのパルス比記録では、刺激間の間隔は 25、50、100、200、および 300 ミリ秒でした。録音は3回繰り返されました。高周波刺激LTPの場合、ピクロトキシン(100μM)をaCSFに添加した。 20 分間安定したベースライン応答が得られた後、SC-CA1 経路に 100 Hz の単一刺激 (1 秒) を与え、さらに 4 つの 100 Hz 刺激の列 (各 1 秒、列間の間隔は 20 秒) を与えました。 MPP-DG 経路。回答は 1 時間記録されました。

マウスの動きを長期間継続的にモニタリングするために、ケージ内のマウスの動きから生じる振動を検出するように設計されたLABORASTM システム (Metris) を使用しました。マウスを一匹ずつ隔離し、記録室のLABORASケージ内で3日間馴化させた。慣れさせた後、マウスの入った LABORAS ケージを振動に敏感な記録プラットフォームの上に 72 時間置きました。過去 48 時間のデータが分析され、24 時間サイクルで平均化されました。

マウスを40×40×40cmの箱に入れ、完全な暗闇（約0ルクス）下で1時間水平運動活動を記録しました。中心ゾーンラインは端から１０ｃｍ離れていた。動きは Ethovision XT 10 (Noldus) を使用して分析されました。

床から 50 cm の高さまで上げられた迷路は、2 つの開いたアーム、2 つの閉じたアーム、および中央ゾーンで構成されていました。中央ゾーンに置かれたマウスの動きを 7 分間記録し、閉じた腕または開いた腕で過ごした時間を手動で分析しました。

ボックスの寸法は、明室 (約 250 ～ 300 ルクス) が 12 × 30 × 20 cm、暗室 (約 0 ～ 5 ルクス) が 14 × 13 × 20 cm でした。マウスを明室の中央に置き、その後 10 分間動きをモニタリングしました。明室または暗室で費やした時間を手動で分析しました。

マウスを 24 時間絶食させ、40 × 40 × 40 cm の新しい箱に入れました。餌ペレットを箱の中央に置き、餌に近づいて食べるまでの時間を測定しました。

マウスを空のホームケージに入れ、セルフグルーミング行動を10分間記録した。セルフグルーミング行動は、前肢で顔、頭、体の領域をなでたり引っ掻いたり、体の一部をなめたりすることと定義されました。セルフグルーミングの時間を盲検法で測定した。

マウスの腹腔内に50μg/体重(g)のペンチレンテトラゾール(PTZ)を注射し、10分間発作を記録した。発作は、横向きに寝ているときおよび/または激しく飛び跳ねているときの間代発作および/または強直間代発作を含むけいれん運動として定義されました。

このテストは、社会的相互作用と社会的新規性の認識を測定するために実行されました89。装置は、中央チャンバーの寸法が 12 × 20 × 26 cm、サイドチャンバーの寸法が 14 × 20 × 26 cm の 3 つのチャンバーで構成されました。両側の部屋の隅には、物やマウスを置くためのプラスチック製のケージがありました。実験は、中央キャンバーでの慣れ（10分）、すべてのチャンバーでの慣れ（10分）、物体/マウスの探索（10分）、および古い/新しいマウスの探索（10分）を含む4つのセッションで構成されました。 3 回目のセッションでは、WT 見知らぬマウスをプラスチックのケージに静かに閉じ込め、無生物を反対側のプラスチックのケージに置きました。社会的相互作用を分析するために、マウスを自由に移動させ、探索し、匂いを嗅ぎ、室内時間を測定した。スニッフィングは、マウスの鼻が対象物体またはマウスの方を向いて近づくこととして定義されます。最後のセッションでは、オブジェクトは新しい WT ストレンジャーマウスに置き換えられました。物体と見知らぬ人 1 の位置は、側の優先を防ぐためにランダムな方法で交互に配置されました。

マウスをロータロッド装置（Stoelting）の回転ロッド上に静かに置き、続いてロッドの速度を5分間かけて4から40 rpmに増加させた。実験は連続 5 日間実施され、ロッドから落下するまでの時間を測定しました。

白色不透明水（22～24℃）で満たされた円形水槽（直径100cm）内のマウスを、隠れたプラットフォーム（直径10cm）を見つけるように訓練した。学習フェーズは、5 日間にわたる 1 日あたり 3 回のトライアルで構成されました。プローブテスト (1 分) では、プラットフォームを取り外し、マウスが各象限を探索するのに費やした時間を測定しました。反転テスト (3 日間) では、プラットフォームを反対側の象限位置に再配置しました。マウスの動きは、EthoVision XT 10 (Noldus) を使用して分析されました。

このテストは前述のように実行されました44。簡単に説明すると、体重が正常範囲の 80 ～ 85% である摂食不足のマウスを 2 日間、5 分間 T 迷路アリーナに慣れさせた後、20 μl の 70% 牛乳報酬で 10 日間訓練しました。

開始点に配置されたマウスは、迷路の 2 つのアームを自由に探索することができました。マウスが 2 本のアームのうちの 1 つに入る場合、次のラウンドのためにアーム内で 5 秒間過ごした後、開始点に戻されます。これを 10 回繰り返しました。

1日目にオープンフィールドボックスに60分間慣れさせたマウスに、2日目に11分間2つの同一の物体を与えた。3日目に、物体の1つを新しい物体に置き換えた。物体認識は、マウスの鼻が物体を指している時間によって測定されました。

１日目に、マウスをショックチャンバー（Coulbourn Instruments）に５分間慣れさせた。 2日目、マウスをチャンバー内で3分間過ごした後、3分、4分、5分の時点でフットショック（0.8mA）を与え、3〜6分間のすくみレベルを定量しました。 3 日目に、マウスを足にショックを与えずに 5 分間チャンバーに再曝露し、この 5 分間のすくみレベルを定量化しました。フリーズ挙動は、FreezeFrame 3 ソフトウェア (Coulbourn Instruments) を使用して分析されました。文脈的恐怖を消滅させるために、マウスを連続 10 日間、同じショックチャンバーに 5 分間曝露しました。

慣れていないマウスは、コンテキスト-A ショックチャンバー内で 3 分間過ごした後、聴覚合図 (4 kHz、75 dB) を 30 秒間受信し、2 秒間のフットショック (0.8 mA) と同時に終了しました。このコンディショニングを１分間隔で３回繰り返した。 24 時間後、マウスをコンテキスト B に置き、3 分間同じ聴覚刺激を受ける前に 3 分間過ごしました。この 3 分間の凍結挙動を分析しました。

私たちは、同一の金属グリッド床を共有するが、壁紙、底面の色、照明が独特であるあまり区別されない文脈のペア（A と B）を使用して、マウスに文脈的恐怖条件付けテストを実施しました。このプロトコルでは、繰り返しの経験の影響を調査するために、恐怖条件付けが数日間にわたって段階的に行われました。実験は同じ時間、温度、湿度の条件（午後 2 ～ 9 時、20 ～ 22 °C、45%）で実行されました。各試験はケージ内で 30 ～ 60 分間慣らした後、1 日 2 回実施されました。実験の 1 ～ 3 日目には、マウスをショックチャンバーに 180 秒間入れ、0.8 mA の単一足ショックを 2 秒間与え、60 秒後に取り出しました。 4日目と5日目に、一般化のために、各遺伝子型のマウスを2つのグループに分け、一方はチャンバーAを訪問し、もう一方はチャンバーBを訪問し（1日1回の試行）、4日目に4分間訪問し、5日目に未訪問のチャンバーを訪問しました。マウスは全身化中に足へのショックを受けず、すくみを評価した。 6〜13日目の間、弁別訓練のために、マウスは8日間毎日2つのチャンバーを訪れ、チャンバーAに置かれた後180秒で常にフットショック（0.8mAを2秒間）を受けましたが、チャンバーBには入れられませんでした。さらに分滞在してください。各チャンバーでの最初の 3 分間の曝露中の凍結を使用して、毎日の識別率を計算しました。

すべての行動結果は盲検法で分析されました。

この記事を引用する方法: Park, H. et al. PSD-95と相互作用するE3リガーゼであるDorfin/Rnf19aを欠くマウスは、成体神経新生の減少、長期増強の増強、および文脈上の恐怖条件付けの障害を示します。科学。議員 5、16410; 土井: 10.1038/srep16410 (2015)。

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この研究は、科学・情報通信・未来計画省 (香港への 2014047939) および基礎科学研究所 (IBS) (IBS-R002-D1) の資金提供を受けた韓国国立研究財団 (NRF) を通じた脳研究プログラムによって支援されました。 EKへ）。

韓国科学技術大学院大学（KAIST）医科学工学大学院、大田、305-701、韓国

ハンウル公園

生物科学部、KAIST、大田、305-701、韓国

ヤン・ジンヒ、キム・リョンヒ、イ・チュンウ、パク・ジョンイル、キム・ウンジュン

シナプス脳機能障害センター、基礎科学研究所 (IBS)、大田、305-701、韓国

ヤン・リー、イ・イェンクム、キム・ウンジュン

解剖学部門および脳韓国部門 21. 高麗大学校医科大学生物医学科学部、ソウル、136-704、韓国

ドンミン・イ＆ヒョン・キム

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JY は Y2H、プルダウン、および共免疫沈降実験の一部を実施しました。 RKは電気生理学的実験と成人の神経新生実験の一部を実施した。 YLは成人の神経新生実験を実施しました。 YL は in vitro ユビキチン化アッセイを実施しました。 JPとCLは行動実験の一部を実施した。 DL は in situ ハイブリダイゼーション実験を実施しました。 HP は他のすべての実験を実行しました。 EKとHKが原稿を書きました。

著者らは、競合する経済的利害関係を宣言していません。

この作品は、クリエイティブコモンズ表示 4.0 国際ライセンスに基づいてライセンスされています。この記事内の画像またはその他のサードパーティ素材は、クレジットラインに別段の記載がない限り、記事のクリエイティブコモンズライセンスに含まれています。素材がクリエイティブコモンズライセンスに含まれていない場合、ユーザーは素材を複製するためにライセンス所有者から許可を得る必要があります。このライセンスのコピーを表示するには、http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/ にアクセスしてください。

転載と許可

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受信日: 2015 年 6 月 1 日

受理日: 2015 年 10 月 14 日

公開日: 2015 年 11 月 10 日

DOI: https://doi.org/10.1038/srep16410

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